Artykuł metodologiczny

Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4145

⸱

24 czerwca 2012

 ,  ,  ,  , 
1Section of Virology, Imperial College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Norowirusy są główną przyczyną gastroenteritis, jednak techniki molekularne służące do ich charakterystyki są wciąż stosunkowo nowe. W niniejszej pracy przedstawiamy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej w celu efektywnego odzyskiwania norowirusa mysiego (MNV), jedynego przedstawiciela tego rodzaju, który może być propagowany w hodowlach komórkowych.

Streszczenie

Ludzkie norowirusy odpowiadają za większość przypadków ludzkiego zapalenia żołądka i jelit (GE) na całym świecie i stanowią nawracający problem w środowiskach, w których nie można uniknąć bliskiego kontaktu z człowieka na człowieka 1, 2. W ciągu ostatnich kilku lat zgłaszano wzrost częstotliwości występowania ognisk zakażeń w szpitalach, co powoduje znaczne zakłócenia w ich zdolnościach operacyjnych, a także duże straty ekonomiczne. Identyfikacja nowych metod przeciwwirusowych była ograniczona z powodu niezdolności ludzkich norowirusów do przeprowadzenia produktywnej infekcji w hodowlach komórkowych 3. Niedawna izolacja mysiego norowirusa (MNV), ściśle spokrewnionego z ludzkim norowirusem 4, ale mogącego być propagowanym w komórkach 5, otworzyła nowe możliwości badania tych patogenów 6, 7.

Replikacja MNV prowadzi do syntezy nowych cząsteczek genomowego i subgenomowego RNA o polarności dodatniej, przy czym te drugie odpowiadają ostatniej jednej trzeciej genomu wirusa (Rysunek 1). MNV zawiera cztery różne otwarte ramki odczytu (ORF), z których ORF1 zajmuje większość genomu i koduje siedem białek niestrukturalnych (NS1-7) uwalnianych z prekursora poliproteiny. ORF2 i ORF3 znajdują się w obrębie regionu subgenomowego RNA i kodują białka kapsydu (odpowiednio VP1 i VP2) (Rysunek 1). Niedawno zidentyfikowano, że dodatkowa ramka ORF4, nakładająca się na ORF2, ale znajdująca się w innej ramce odczytu, jest funkcjonalna i koduje zlokalizowany w mitochondriach czynnik wirulencji (VF1) 8.

Replikacja wirusów RNA o dodatniej polarności, w tym norowirusów, zachodzi w cytoplazmie, co prowadzi do syntezy nowych, niekapsylowanych genomów RNA. Aby promować translację wirusową, wirusy wykorzystują różne strategie mające na celu rekrutację komórkowego aparatu syntezy białek 9-11. Co ciekawe, translacja norowirusa jest napędzana przez wielofunkcyjne białko-starter VPg, które jest kowalencyjnie powiązane z końcem 5' zarówno genomowych, jak i subgenomowych RNA 12-14. Ten złożony mechanizm translacji prawdopodobnie stanowi główny czynnik ograniczający wydajność odzyskiwania wirusa za pomocą konwencjonalnych metod genetyki odwrotnej.

W niniejszej pracy opisujemy dwie różne strategie oparte na generowaniu transkryptów norowirusa mysiego-1 (w dalszej części tekstu określanego jako MNV) z czapeczką na końcu 5'. Jedna z metod obejmuje syntezę in vitro oraz czapeczkowanie wirusowego RNA, natomiast drugie podejście polega na transkrypcji cDNA MNV w komórkach wykazujących ekspresję polimerazy RNA T7. Dostępność tych systemów genetyki odwrotnej do badania MNV oraz modelu małych zwierząt zapewniła bezprecedensową możliwość analizy roli sekwencji wirusowych w replikacji i patogenezie 15-17.

Protokół

1. Transkrypcja i capping RNA w celu odzyskania zakaźnego MNV

Niniejszy protokół został opracowany w celu umożliwienia wydajnego odzyskiwania zakaźnego MNV z cDNA poprzez transkrypcję in vitro oraz jego późniejsze cappingowanie in vitro (sekcja 1.1). Powstałe cappingowane transkrypty są następnie transfekowane do komórek w celu odzyskania zakaźnego MNV (sekcje 1.2 i 1.3). Podejście to stanowi najczulszą metodę odzyskiwania MNV, z typowymi wydajnościami przekraczającymi 105 jednostek zakaźnych na szalkę z komórkami o średnicy 35 mm dla MNV. Szczegóły protokołu przedstawiono poniżej:

1.1 Synteza zakaźnych transkryptów MNV z czapeczką:

  1. Przetraw plazmid zawierający cDNA typu dzikiego MNV (pT7:MNV 3'Rz) enzymem NheI w celu uzyskania liniowego DNA. NheI rozpoznaje unikalną miejsce restrykcyjne za ogonem polyA na końcu 3' genomu MNV (Rysunek 2). Zlinearyzowane plazmidy są zazwyczaj oczyszczane przy użyciu kolumn krzemionkowych (np. GFX PCR DNA Gel Band Purification Kit od GE Healthcare) i eluowane w H2O.
  2. Przeprowadź transkrypcję in vitro zlinearyzowanego wektora przy użyciu polimerazy RNA T7, zgodnie z wcześniejszym opisem 17. Do tego celu dostępnych jest wiele zestawów komercyjnych, które zapewniają powtarzalną metodę syntezy dużych ilości RNA, takich jak MEGAScript (Life Technologies) i RiboMAX (Promega). Reakcje transkrypcji są zazwyczaj trawione DNazą przed dalszą analizą; jednak w wielu przypadkach nie jest to wymagane, ponieważ oczyszczanie chlorkiem litu opisane poniżej nie wytrąca efektywnie DNA.
  3. Przeanalizuj niewielką alikwot reakcji transkrypcji RNA, zazwyczaj 0,5 μl lub mniej, za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby upewnić się, że reakcja transkrypcji przebiegła wydajnie, a RNA ma pełną długość. Chociaż wielu użytkowników może chcieć stosować żele denaturujące w celu prawidłowego określenia wielkości RNA, zazwyczaj stosujemy niedenaturującą elektroforezę w żelu agarozowym jako szybką metodę analizy integralności RNA. Genom MNV wytworzony z infekcyjnego klonu cDNA pT7:MNV 3'Rz będzie wędrował na poziomie około 3 Kbp w stosunku do drabinki dsDNA w niedenaturującym żelu agarozowym (Rysunek 3).
  4. Należy wziąć pod uwagę, że jako alternatywa do szybkiej analizy integralności RNA dostępne są inne metody, takie jak użycie bioanalizatora Agilent (Rysunek 3).
  5. Należy pamiętać, że w przypadku nałożenia zbyt dużej ilości RNA może wystąpić słaba rozdzielczość żelu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby żel agarozowy był przygotowany z odczynników wolnych od RNaz, aby uniknąć degradacji RNA podczas elektroforezy, co może wpłynąć na rozdzielczość prążków. W niektórych przypadkach pomocne może być również podgrzanie RNA do 65 °C, a następnie schłodzenie na lodzie.
  6. Oczyść próbkę RNA, aby usunąć niewbudowane nukleotydy. Dostępnych jest wiele metod, w tym podejścia oparte na kolumnach krzemionkowych, jednak w tym protokole zazwyczaj stosujemy chlorek litu jako kosztowo efektywną alternatywę. W tym celu dodaj H2O do osiągnięcia końcowej objętości 100 μl, a następnie dodaj 40 μl Lithium chloride precipitation solution (7,5 M LiCl, 50 mM EDTA, pH 8,0, Ambion) i przechowuj próbkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 min.
  7. Osadź RNA poprzez wirowanie przy 12 000 X g w temperaturze 4 °C przez 15 min.
  8. Usuń nadsącz, uważając, aby nie naruszyć półprzezroczystego osadu RNA, i przemyj go w 150 μl 70% etanolu. Wiruj probówkę przy 12 000 X g w temperaturze 4 °C przez 15 min.
  9. Usuń etanol i wysusz RNA powietrzem, unikając całkowitego wyschnięcia osadu, ponieważ utrudni to resuspensję.
  10. Następnie resuspenduj transkrypty MNV w 50-100 μl RNA storage solution (Ambion). Należy zadbać o to, aby całe RNA rozpuściło się prawidłowo. Jeśli RNA wydaje się trudne do pełnego rozpuszczenia, podgrzanie próbki do 60 °C może pomóc w jego resuspensji. Wszelki nierozpuszczalny materiał należy następnie usunąć przez wirowanie przed kwantyfikacją RNA. Oczyszczone transkrypty nie posiadają czapeczki i wymagają późniejszego etapu czapeczkowania in vitro, aby były infekcyjne (ScriptCap m7G Capping System, Epicentre Biotechnologies).
  11. Ilościowo określ RNA za pomocą spektrofotometrii. W zależności od charakteru i skali reakcji transkrypcji, typowe wydajności wynoszą od 50-150 μg RNA na 100 μl reakcji transkrypcji. Integralność RNA powinna zostać przeanalizowana przed reakcją czapeczkowania poprzez naniesienie 100-300 ng próbki na 1% żel agarozowy (Rysunek 3).
  12. Aby zwiększyć wydajność czapeczkowania RNA, podgrzej 60 do 70 μg transkryptów RNA MNV w temperaturze 65 °C przez 10 min, a następnie natychmiast umieść probówkę na lodzie. Krok ten może zmniejszyć ewentualny efekt hamujący struktury RNA na czapeczkowanie. Krótko wiruj probówkę w schłodzonej mikrowirówce, aby zebrać krople powstałe podczas etapu podgrzewania.
  13. Przygotuj mieszaninę do reakcji czapeczkowania zgodnie z sugestią producenta (ScriptCap m7G Capping System, Epicentre Biotechnologies). W skrócie, dodaj 60-70 μg RNA MNV do końcowej objętości reakcji 100 μl. Mieszanina do reakcji czapeczkowania może zawierać 10 μl 10 x Capping buffer (500 mM TrisHCl pH 8,0, 60 mM KCl, 12,5 mM MgCl2), 10 μl 10 mM GTP, 0,5 μl 20 mM S-adenozylometioniny, 2,5 μl Scriptguard (100 jednostek) oraz 4 μl enzymu Scriptcap (40 jednostek).
  14. Podczas przygotowywania reakcji przechowuj transkrypty RNA na lodzie, aby uniknąć degradacji. Dobrze wymieszaj mieszaninę reakcyjną, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez 1 h. Należy pamiętać, że skala reakcji może być dostosowana do wymaganej ilości czapeczkowanego transkryptu.
  15. Oczyść RNA poprzez wytrącanie LiCl, jak wyjaśniono powyżej (patrz punkt 1.1.6). Rozpuść osad w 50-100 μl RNA storage solution (Ambion) i określ ilość RNA. Zazwyczaj próbki RNA są następnie normalizowane do 1 μg/μl. Ponownie sprawdź, czy całe RNA rozpuściło się prawidłowo. Jeśli nie rozpuściło się prawidłowo, podgrzej próbkę do 60 °C, aby umożliwić jej rozpuszczenie. Usuń przez wirowanie wszelki nierozpuszczalny materiał przed kwantyfikacją RNA.
  16. Ponownie sprawdź integralność RNA przed przejściem do etapu transfekcji. W tym celu nanieś 100-300 ng próbki na 1% żel agarozowy (Rysunek 3).

1.2 Odzyskiwanie poprzez transfekcję RNA do komórek Raw264.7 za pomocą systemu Neon:

W celu odzyskania zakaźnych wirionów MNV w podatniej linii komórkowej możliwe jest przeprowadzenie elektroporacji czapeczkowanego transkryptu MNV do komórek Raw264.7 przy użyciu systemu Neon transfection (Invitrogen). Komórki Raw264.7 są podatne na zakażenie MNV, co umożliwia wielokrotne cykle replikacji wirusa i następujące po nich ponowne zakażenia. W efekcie typowe wydajności przekraczają 105 jednostek zakaźnych na ml 24 godziny po transfekcji, natomiast osiągają szczyt na poziomie >107 jednostek zakaźnych po 48 godzinach.

  1. Na jeden dzień przed transfekcją wysiać komórki Raw264.7 do osiągnięcia szacowanej konfluencji na poziomie 50%. Zazwyczaj do przeprowadzenia 3 transfekcji wymagane są dwie kolby T75 z komórkami.
  2. W dniu transfekcji zebrać monowarstwy komórek poprzez zdrapywanie do podłoża DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) zawierającego 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), zapewniając uzyskanie jednokomórkowej zawiesiny poprzez wielokrotne pipetowanie.
  3. Określić stężenie żywych komórek za pomocą komory countingowej (hemocytometru), stosując metodę wykluczania trypan blue w celu znakowania komórek nieżyjących.
  4. Odwirować komórki przy 1,200 X g przez 5 min i resuspendować je w DMEM z 10% FCS do końcowego stężenia 8 x 106 komórek/ml.
  5. Bezpośrednio przed transfekcją odmierzyć 1 ml komórek na każdą transfekcję i odwirować je przy 1,200 X g przez 2 min. Usunąć pożywkę i przemyć komórki w 500 μl PBS (bez Mg2+/Ca2+). Ponownie odwirować komórki przy 1,200 X g przez 2 min. Należy pamiętać, że zaleca się utrzymywanie komórek w DMEM jak najdłużej, ponieważ przechowywanie w PBS przez dłuższy czas może pogorszyć żywotność komórek i wydajność transfekcji.
  6. Usunąć PBS z probówek i dodać 130 μl roztworu do resuspensji (Neon transfection system kit, Invitrogen) do końcowego stężenia 6 x 107 komórek/ml. Należy zachować ostrożność podczas resuspensji komórek, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, które spowodują iskrzenie podczas transfekcji i obniżą przeżywalność komórek.
  7. Dodać do komórek odpowiednią ilość zmodyfikowanego transkryptu MNV z czapką (Ryc. 2); zazwyczaj dodaje się 1,3 μg RNA z czapką do 130 μl resuspendowanych komórek i delikatnie miesza. Następnie zebrać 100 μl mieszaniny do końcówki do transfekcji Neon o pojemności 100 μl. Należy zachować szczególną ostrożność, aby w kuwecie do elektroporacji (Neon transfection system kit 100 μl tip) nie powstały pęcherzyki powietrza, ponieważ spowoduje to niepowodzenie eksperymentu.
  8. Przeprowadzić elektroporację komórek za pomocą pojedynczego impulsu o napięciu 1,700 V przez 25 msec, upewniając się, że podczas impulsowania nie występują iskry, co wskazywałoby na obecność pęcherzyków powietrza w próbce. W przypadku wystąpienia iskrzenia należy odrzucić próbkę i powtórzyć transfekcję. Przenieść komórki do probówki Eppendorf zawierającej 1 ml DMEM bez antybiotyków z dodatkiem 10% FCS. Należy pamiętać, że każda końcówka może być użyta do trzech razy z tą samą próbką RNA, jeśli wymagana jest większa liczba transfektowanych komórek.
  9. Następnie rozdzielić komórki z probówki do oddzielnych dołków zawierających odpowiednią ilość uprzednio ogrzanego DMEM bez antybiotyków z 10% FCS. Jako ogólną wskazówkę: 150 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 1.2.8 jest wystarczające dla jednego dołka płytki 24-dołkowej zawierającej 0,5 ml ogrzanego DMEM, natomiast 300 μl jest odpowiednie dla dołka płytki 12-dołkowej zawierającej 1 ml ogrzanego DMEM.
  10. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 10% CO2 przez 24 do 72 godzin. Następnie uwolnić zakaźne wiriony z komórek poprzez jeden (lub więcej) cykl zamrażania i rozmrażania i oznaczyć miano wirusa w próbce za pomocą metody plackowej lub TCID50. Należy pamiętać, że lizaty przed mianowaniem należy sklarować poprzez wirowanie przez 1-2 minuty z maksymalną prędkością lub poprzez filtrowanie przez filtr o porach 0,22 μm. Zazwyczaj MNV osiąga miana rzędu 1 x 106 TCID50/ml w 24 godzinach po transfekcji i do 1 x 109 w 72 godzinach po transfekcji.
  11. Obecność i stabilność mutacji wprowadzonych do pT7:MNV 3'Rz są zazwyczaj oznaczane poprzez sekwencjonowanie odzyskanych wirusów po 2 do 5 dodatkowych pasażach w komórkach Raw264.7.

1.3 Odzyskiwanie poprzez lipofekcję do komórek BHK-21:

Bardziej bezpośrednią i często bardziej efektywną kosztowo metodą odzyskiwania zakaźnego MNV z transkryptów z czapeczką jest lipofekcja (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Biorąc pod uwagę, że komórki Raw264.7 są trudne do transfekcji przy użyciu metod opartych na lipidach, zazwyczaj wykorzystujemy inne linie komórkowe łatwe do transfekcji, takie jak BHK-21, która jest unieśmiertelnioną linią pochodzącą z fibroblastów nerek młodego chomika. Jako standardowe podejście w naszym laboratorium stosujemy komórki BSR-T7, pochodną linii komórkowej BHK-21, ponieważ choć komórki te są łatwe do transfekcji i wspierają replikację MNV, brakuje im odpowiedniego receptora, który umożliwiłby kilka rund reinfekcji. W rezultacie wydajność wirusa uzyskana z tego systemu jest wskaźnikiem pojedynczego cyklu replikacji wirusa. Podejście to jest szczególnie użyteczne podczas badania wpływu mutacji na odzyskiwanie wirusa, ponieważ pozwala na przeprowadzenie wielu transfekcji przy znacznie niższych kosztach w porównaniu do transfekcji za pomocą systemu Neon, a także nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Warto zauważyć, że inne łatwo dostępne linie komórkowe, takie jak ludzkie komórki embrionalne nerek 293T, również wspierają efektywne odzyskiwanie MNV, jednak warunki transfekcji powinny zostać uprzednio zoptymalizowane, aby zapewnić wydajne dostarczenie RNA.

  1. Poddać trypsynizacji monowarstwę komórek BHK-21 (lub komórek BSR-T7), wysiać 7,5 x 105 komórek do naczynia o średnicy 35 mm w pożywce wzrostowej bez antybiotyków i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 10% CO2 przez noc. Zwiększyć dwukrotnie liczbę komórek na każdą płytkę, jeśli transfekcje są planowane na ten sam dzień co wysiew, i pozwolić komórkom przywrzeć do płytki przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C przy 10% CO2. Należy pamiętać, że do tego podejścia odpowiednie są również ludzkie komórki 293T, ludzkie komórki raka hepatokomórkowego Huh7 oraz komórki Cos7 z zielonej małpy afrykańskiej.
  2. Usunąć pożywkę z komórek i zastąpić ją 3 ml świeżej pożywki bez antybiotyków, aby zapewnić maksymalną wydajność transfekcji.
  3. Przygotować mieszaninę 1-2 μg uncapped MNV transcript w 100 μl Opti-MEM (Invitrogen) i zmieszać ją z 4 μl Lipofectamine 2000 uprzednio zmieszanym w 100 μl Opti-MEM. Dokładnie wymieszać próbkę, pipetując ją w górę i w dół 15 razy. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  4. Kompleksy transfekcyjne zawierające capped MNV transcripts dodać kroplami do monowarstwy komórek, delikatnie potrząsając płytką w kierunkach prostopadłych.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 10% CO2 przez 24 do 72 godzin. Następnie uwolnić zakaźne wiriony z komórek poprzez zamrażanie i rozmrażanie, a miano wirusa określić za pomocą metody plackowej lub TCID50. Uzyskuje się typowe wydajności na poziomie około 1 x 106 TCID50/ml.

2. Bezpośrednie odzyskiwanie zakaźnego MNV z cDNA w komórkach wykazujących ekspresję polimerazy RNA T7

Niniejszy protokół został opracowany w celu umożliwienia odzyskania MNV w komórkach poprzez transkrypcję infekcyjnego plazmidu zawierającego pełną sekwencję cDNA genomowego przez polimerazę T7 ekspresowaną w komórkach. Do odzyskiwania infekcyjnego MNV tą metodą można wykorzystać różne linie komórkowe, choć zazwyczaj najwyższe wydajności uzyskuje się przy użyciu komórek BHK-21 oraz BSR-T7 15. Zazwyczaj stosujemy komórki BSR-T7, ponieważ rosną one szybciej niż rodzima linia klonalna BHK. Komórki są infekowane wirusem ospy ptaków (FPV) kodującym polimerazę RNA T7 (FPV-T7) 18, który pełni funkcję wirusa pomocniczego napędzającego ekspresję viralnego RNA i późniejsze odzyskanie infekcyjnego wirusa (Rysunek 4). Chociaż komórki BSR-T7 konstytutywnie ekspresują polimerazę RNA T7, ekspresja ta nie jest wystarczająca do odzyskania infekcyjnego MNV po transfekcji pT7:MNV 3'Rz w przypadku braku pomocniczego FPV-T7. Mimo że typowe wydajności z tego systemu są co najmniej 10-krotnie niższe od opisanych powyżej, podejście to zapewnia szybką metodę przesiewania mutantów, umożliwiając identyfikację mutacji upośledzających funkcje. Metody tej zazwyczaj używa się najpierw do oceny żywotności konstruktu cDNA. Jeśli konstrukt nie wytwarza infekcyjnego wirusa lub wydaje wirusa na niższym poziomie niż infekcyjny klon typu dzikiego, stosuje się opisaną powyżej metodę opartą na RNA.

  1. Poddać trypsynizacji monowarstwę komórek BHK-21 (lub komórek BSR-T7) i zasiać 7,5 x 105 komórek do naczynia 35 mm w pożywce wzrostowej bez antybiotyków, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 10% CO2 przez noc. Jeśli transfekcje są planowane na ten sam dzień co wysiew, należy dodać podwójną liczbę komórek do każdej płytki i pozwolić im przywrzeć do powierzchni przez 2-3 godziny w 37 °C i 10% CO2.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 700 μl FPV-T7 do każdej studni (Rysunek 4). Zazwyczaj stosuje się wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą ok. 0,5 PFU na komórkę, w oparciu o miareczkowanie na pierwotnych fibroblastach zarodka kurczaka. Warto jednak zauważyć, że nowe preparaty wirusa pomocniczego hodowane na fibroblastach pierwotnych są miareczkowane funkcjonalnie w celu ustalenia dawki wymaganej do efektywnej regeneracji wirusa. Protokoły propagacji i miareczkowania FPV-T7 zostały opisane wcześniej 18.
  3. Inkubować w 37 °C i 10% CO2 przez 1 godzinę, aby umożliwić infekcję komórek przez FPV-T7. Następnie dodać 2 ml pożywki DMEM bez antybiotyków zawierającej 10% FCS i inkubować komórki przez kolejną godzinę w 37 °C i 10% CO2, aby umożliwić ekspresję polimerazy RNA T7.
  4. Aby przystąpić do transfekcji zakaźnego plazmidu, najpierw usunąć pożywkę z zainfekowanych komórek, przemyć 2 ml pożywki (10% FCS w DMEM bez antybiotyków), a na koniec pokryć monowarstwę komórek 3 ml pożywki. Do pożywki nie należy dodawać antybiotyków, ponieważ mogą one zakłócać wydajność Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
  5. Przygotować mieszaninę 1 μg zakaźnego plazmidu cDNA MNV typu dzikiego (np. pT7:MNV 3'Rz) w 100 μl Opti-MEM (Invitrogen) i zmieszać ją z 4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) uprzednio zmieszanym z 100 μl Opti-MEM (Invitrogen). Dokładnie wymieszać reakcję, pipetując ją w górę i w dół 15 razy, i przechowywać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  6. Powstałą mieszaninę do transfekcji należy następnie dodawać kroplami do monowarstwy komórkowej, a płytkę delikatnie potrząsać w kierunkach prostopadłych.
  7. Inkubować komórki zainfekowane FPV-T7 i transfekowane plazmidem MNV w 37 °C i 10% CO2 od 24 do 72 godzin. Komórki transfekowane zakaźnym plazmidem pT7:MNV 3'Rz zazwyczaj dają miana od 1 x 104 do 5 x 104 TCID50/ml.

3. Reprezentatywne wyniki

Oba podejścia genetyki odwrotnej są wysoce efektywne w odzyskiwaniu zakaźnego MNV w hodowli komórkowej, co pokazano na Rysunku 5. Zakaźny MNV o mianach przekraczających 105 TCID50/ml jest odzyskiwany 24 godziny po transfekcji zmodyfikowanego RNA MNV do komórek Raw264.7. Podobnie, transfekcja zakaźnego plazmidu pT7:MNV 3'Rz do komórek BSR-T7 uprzednio zainfekowanych pomocniczym FPV wykazującym ekspresję T7 (FPV-T7) doprowadziła do uzyskania mian wirusa znacznie przekraczających 104 TCID50/ml (Rysunek 5). Wartości miana wirusa uzyskane przy użyciu syntetycznych cząsteczek RNA i DNA są zbliżone do tych otrzymanych w transfekcjach z udziałem naturalnego RNA związanego z VPg, wyizolowanego z zakaźnych wirionów do tych samych komórek (Rysunek 5). Wyniki te podkreślają wysoką efektywność opisanych tutaj metod genetyki odwrotnej w odzyskiwaniu genetycznie zdefiniowanych wariantów MNV w hodowli komórkowej.

Schemat genomu wirusa; białka strukturalne NS1/2 do NS7, VP1, VP2 oraz mapa plazmidu rybozymowego.
Rycina 1. Ilustracja genomu MNV i plazmidu służącego do odzyskiwania zakaźnego wirusa. A, Schematyczna reprezentacja organizacji genomu MNV. Każdy region kodujący białko przedstawiono jako pojedyncze białe pole. ORF1 jest translacyjny na 7 różnych białek niestrukturalnych (NS1/2 do NS7), które są uwalniane z poliproteiny prekursorowej po procesie autoproteolizy. ORF 2 koduje główne białko kapsydu VP1, ORF 3 koduje pomocnicze białko kapsydu VP2, a ORF4, nakładający się na region kodujący ORF2, koduje czynnik wirulencji VF1. RNA genomiczne i subgenomiczne posiadają ogon polyA o zmiennej długości na swoich końcach 3'. B, Plazmid zawierający cDNA MNV wykorzystany w naszych podejściach genetyki odwrotnej (pT7:MNV 3'Rz). cDNA MNV jest połączone z ogonem polyA składającym się z 26 reszt na jego końcu 3'. Sekwencja cDNA MNV znajduje się bezpośrednio za skróconą sekwencją promotora T7, aby umożliwić transkrypcję sterowaną przez T7, oraz przed unikalną sekwencją rozpoznawczą NheI i następującą po niej sekwencją DNA kodującą samoprzecinający się rybozym. Sekwencje te są kluczowe dla zapewnienia terminacji transkrypcji RNA bezpośrednio po genomicznym ogonie polyA obecnym na końcu 3'.

Schemat procesu syntezy RNA MNV z etapami elektroforezy i transfekcji komórek w badaniu wirusa.
Rycina 2. Przegląd protokołu odzyskiwania zakaźnego MNV z RNA transkrybowanego i czapeczkowanego in vitro. Plazmid pT7:MNV 3'Rz jest linearyzowany bezpośrednio za sekwencją genomową MNV przy użyciu enzymu restrykcyjnego NheI (krok 1). Po oczyszczaniu DNA transkrypty RNA MNV są generowane in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 (krok 2). Produkty transkrypcji zazwyczaj wykazują pozorną mobilność 2,5-3Kb na niedenaturującym 1% żelu agarozowym (krok 3, Rycina 3). Matrycy DNA jest usuwane przy użyciu komercyjnej DNazy wolnej od RNazy. RNA jest następnie oczyszczane z wolnych nukleotydów poprzez wytrącanie LiCl (krok 4). Oczyszczony produkt RNA może być następnie czapeczkowany in vitro po uprzednim podgrzaniu do 65 °C w celu rozfałdowania wtórnych struktur RNA (kroki 5-6). Po oczyszczeniu przez wytrącanie LiCl, RNA jest transfekowane do komórek Raw264.7 (Neon transfection system, Invitrogen) lub komórek BSR-T7 (Lipofectamine 2000, Invitrogen) (kroki 7-8). Po dostaniu się do komórki, czapeczkowane transkrypty RNA zostaną przetłumaczone na białka wirusowe, które katalizują replikację transkryptów wirusowych w nowe cząsteczki RNA MNV zawierające odpowiednią cząsteczkę VPg na końcu 5'. Kolejne cykle replikacji połączone z translacją wirusową wygenerują dużą liczbę genomów wirusowych, które zostaną enkapsydowane w celu wytworzenia zakaźnych wirionów. Aby ułatwić uwalnianie wirusów z komórek, wykonuje się jeden lub kilka cykli zamrażania i rozmrażania (krok 9). Wydajność wirusa można następnie określić za pomocą procedur TCID50 lub testu plackowego.

Wynik elektroforezy żelowej; transkrypcja RNA, analiza cappingu z markerami, po traktowaniu LCI.
Rysunek 3. Analiza integralności transkrypcyjnych RNA MNV w trakcie protokołu. A, Integralność RNA MNV syntetyzowanego in vitro. Plazmid pT7:MNV 3'Rz jest najpierw linearyzowany przy użyciu enzymu restrykcyjnego NheI. Po oczyszczaniu DNA transkrypty RNA MNV są generowane in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 (ścieżka 2). Następnie RNA jest oczyszczane z wolnych nukleotydów poprzez wytrącanie LiCl (ścieżka 3). Produkty transkrypcji są rozdzielane w nie-denaturującym 1% żelu agarozowym równolegle z markerem DNA 1-Kb (New England Biolabs, ścieżka 1). Relatywna mobilność transkryptów wirusowych w warunkach nie-denaturujących jest podobna do produktu dsDNA o wielkości 2,5-3 Kb. B, Integralność transkryptów RNA MNV po cappingu. Transkrypty MNV wcześniej oczyszczone poprzez wytrącanie LiCl (ścieżka 2) poddawane są cappingowi enzymatycznemu (ścieżka 3) i oczyszczaniu poprzez wytrącanie LiCl (ścieżka 4). C, Analiza transkryptów MNV (druga ścieżka) oraz cappingowanych transkryptów MNV (trzecia ścieżka), które zostały wcześniej wytrącone w LiCl, przy użyciu Agilent RNA 6000 Nano chip. Równolegle przeprowadzono analizę markera ssRNA.

Schemat replikacji MNV; przedstawia ekspresję polimerazy T7, syntezę wirusową, replikację RNA, enkapsydację.
Rycina 4. Przegląd protokołu odzyskiwania zakaźnego MNV z cDNA. W pierwszej kolejności komórki BSR-T7 (lub BHK) są zakażane rekombinowanym wirusem ospy drobiu (FPV) wykazującym ekspresję polimerazy RNA bakteriofaga T7 (FPV-T7) (krok 1). Zakażone komórki inkubuje się przez 2 godziny przed dalszą obróbką, aby umożliwić ekspresję białek FPV, w tym rekombinowanej polimerazy RNA T7 (krok 2). Następnie do komórek transfekuje się pT7:MNV 3'Rz przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (krok 3). Po wniknięciu do komórki pT7:MNV 3'Rz jest rozpoznawany przez polimerazę RNA T7, która syntetyzuje transkrypty RNA MNV (krok 4). Obecność sekwencji samoprzecinającego się rybozymu δ na końcu 3' genomu gwarantuje, że koniec 3' transkryptu znajduje się bezpośrednio za ogonem polyA (krok 5). Część transkryptów wirusowych zostaje wewnątrzkomórkowo nakapsylowana przez enzym nakapsylowania FPV (krok 6). Powstałe nakapsylowane transkrypty MNV zostaną przetranslowane w celu wytworzenia białek MNV, które katalizują replikację transkryptów MNV. Nowo zsyntetyzowane cząsteczki RNA MNV zawierające odpowiednią cząsteczkę VPg na końcu 5' będą przechodzić kolejne cykle replikacji połączone z translacją wirusową, co ostatecznie może doprowadzić do powstania zakaźnego, enkapsydowanego wirusa. Aby ułatwić uwalnianie wirusa z komórek, przeprowadza się jeden lub kilka cykli zamrażania i rozmrażania (krok 7). Wydajność wirusa można następnie określić za pomocą procedur TCID50 lub testu plackowego.

Wykres słupkowy miana wirusa; porównuje zakaźne RNA MNV oraz MNV z czapką w komórkach Raw i BSR-T7.
Rysunek 5. Reprezentatywne wyniki mian wirusa uzyskane za pomocą różnych metod genetyki odwrotnej opisanych w tekście. Szare słupki przedstawiają miana wirusa uzyskane 24 godziny po neon-transfekcji 2 x 106 komórek Raw264.7 lub po lipo-transfekcji 2 x 106 komórek BSR-T7 transkrybowanym i posiadającym czapkę RNA MNV otrzymanym in vitro. Białe słupki przedstawiają miano wirusa zazwyczaj uzyskiwane po lipofekcji pT7:MNV 3'Rz (cDNA MNV) do 2 x 106 komórek BSR-T7, które wcześniej były przez 2 godziny infekowane wirusem ospy ptaków wykazującym rekombinowaną polimerazę T7 (FPV-T7). Jako kontrolę pozytywną dla transfekcji do komórek Raw i BSR-T7 zazwyczaj stosuje się 2 μg RNA wyekstrahowanego z komórek zainfekowanych MNV, zawierającego wysokie poziomy RNA MNV połączonego z białkiem VPg. Kontrole negatywne przeprowadzono z użyciem RNA MNV lub pT7:MNV 3'Rz kodującego mutację przesunięcia ramki odczytu (F/S), która znosi replikację, w wyniku czego nie wykryto wirusa (dane nie pokazano).

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiliśmy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej, które umożliwiają odzyskanie zakaźnego MNV w hodowli komórkowej. Oba podejścia skutecznie omijają bezwzględny wymóg kowalencyjnego powiązania VPg z końcem 5' wirusowego genomu RNA poprzez generowanie kapszapkownych transkryptów MNV, które są następnie rozpoznawane przez rybosomy komórkowe. Transkrypcja in vitro z następującym po niej enzymatycznym kapszapkowniem jest bardziej wydajna w odzyskiwaniu zakaźnego MNV niż transkrypcja zakaźnych plazmidów w komórkach ekspresujących polimerazę RNA T7, w których transkrypty mogą być kapszapkownione przez enzymy kapszapkownie FPV. Miana wirusa odzyskane za pomocą tych systemów genetyki odwrotnej są zbliżone do tych uzyskanych poprzez transfekcję wirusowego RNA powiązanego z VPg, oczyszczonego z zakażonych hodowli komórkowych 17 (Rycina 5). Transfekcja kapszapkownych RNA MNV do podatnych komórek Raw264.7 daje miano wirusa jedynie o 1 log niższe niż w eksperymentach obejmujących transfekcję całkowitego RNA z zakażonych komórek zawierającego wirusowe RNA powiązane z VPg (Rycina 5). Fakt ten zachęca do dalszych badań w celu ustalenia, czy dodanie cząsteczki VPg do końca 5' transkryptów generowanych przez te systemy mogłoby doprowadzić do zwiększenia wydajności wirusa, co mogłoby ujawnić funkcjonalne aspekty zakaźności MNV w komórkach związane z VPg. Niemniej jednak uważamy ten system genetyki odwrotnej za wysoce wydajny i porównywalny z innymi obecnie stosowanymi systemami genetyki odwrotnej dla wirusów RNA, w których RNA transkrybowane in vitro pozwala na odzyskanie mian jedynie o 10–100 niższych niż w rzeczywistych infekcjach wirionami 19, 20.

Ogólnie rzecz biorąc, obecne metodologie stanowią znaczący krok naprzód w dziedzinie biologii molekularnej norowirusów i dostarczają narzędzi do badania funkcji białek oraz konserwowanych motywów RNA w genomach norowirusów. Podejścia te zostały już połączone z dostępnym obecnie modelem mysim, wykazując, że MNV odzyskany z infekcyjnego cDNA jest w stanie wywołać śmiertelną infekcję u >80% myszy STAT1-/- w czasie krótszym niż 10 dni 4, 21. Wykorzystując ten system, odzyskano żywe mutanty mysiego norowirusa w obrębie białka kapsydu oraz odcinka polypirymidynowego uczestniczącego w wiązaniu różnych czynników gospodarza (PTB i PCBP), które wykazują nieco osłabiony fenotyp in vivo 21, 22. Ponadto niedawno wykazano, że wirusy pozbawione zdolności do efektywnej ekspresji białka VF1 z ORF4 namnażają się w hodowlach komórkowych, lecz ponownie wykazują zmniejszoną wirulencję u myszy w porównaniu z WT MNV 8. Badania te zachęcają do projektowania atenuowanych wersji ludzkich norowirusów w oparciu o studia nad MNV, które mogłyby zostać przebadane jako potencjalne kandydaty na szczepionki.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane z grantu Wellcome Trust Senior Fellowship przyznanego Ianowi Goodfellowowi oraz grantu Marie Curie Intra European Fellowship (FP7 European Research Council) przyznanego Armandomu Ariasowi. Chcielibyśmy podziękować Io Hong Cheong, dr Rebecca Robey i dr Mike Skinner za udzielenie zgody na korzystanie z ich bioanalizatora Agilent oraz pomoc w analizie próbek RNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór do wytrącania chlorkiem lituAmbionAM9480
Roztwór do przechowywania RNAAmbionAM7000
System cappingu ScriptCap m7GEpicentre BiotechnologiesSCCE0610
System transfekcji NeonInvitrogenMPK5000
Zestaw do systemu transfekcji NeonInvitrogenMPK1025
Opti-MEM IInvitrogen31985070
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
Zestaw Agilent RNA 600 NanoAgilent Technologies5067-1511
Bioanalizator Agilent 2100Agilent TechnologiesG2939AA

Bibliografia

  1. Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).
  2. Lopman, B. A. Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003. Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).
  3. Duizer, E. Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).
  4. Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus. Science. 299, 1575-1575 (2003).
  5. Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432(2004).
  6. Bok, K. Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome. Virology. 380, 328-337 (2008).
  7. Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection. Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).
  8. McFadden, N. Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4. PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).
  9. Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs. J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).
  10. Shuman, S., Hurwitz, J. Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).
  11. Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 44, 292-309 (1990).
  12. Chaudhry, Y. Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components. J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).
  13. Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4. E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).
  14. Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).
  15. Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).
  16. Ward, V. K. Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).
  17. Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).
  18. Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS One. 5, e10735(2010).
  19. Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).
  20. Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).
  21. Bailey, D. Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence. J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odzyskiwanie zakaźnego wirusatranskrypcja RNAcapping in vitropolimeraza RNA T7transfekcja wirusowego RNAtest plackowyreplikacja wirusahodowla komórkowa
Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.