Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Podsumowanie

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Streszczenie

Przerzuty są główną przyczyną zgonów w większości typów nowotworów, w związku z czym stanowią kluczowy punkt zainteresowania w badaniach nad rakiem. Jednakże wykrywanie przerzutów utajonych za pomocą obrazowania radiologicznego oraz skuteczność ich eradykacji terapeutycznej pozostają ograniczone.

Choć modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w badaniach nad nowotworami¹, monitorowanie i wizualizacja przerzutów mikro pozostaje wyzwaniem, a niedokładna ocena rozprzestrzeniania się przerzutów w badaniach przedklinicznych może prowadzić do rozczarowujących wyników w badaniach klinicznych². W związku z tym istnieje duże zainteresowanie udoskonaleniem metod, które pozwoliłyby na powtarzalne i wiarygodne wykrywanie przerzutów w tkankach prawidłowych, aż do poziomu pojedynczych komórek. Główny nacisk kładzie się zatem na techniki umożliwiające wykrywanie komórek nowotworowych in vivo, takie jak mikrotomografia komputerowa (micro-CT), pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie bioluminescencyjne lub fluorescencyjne^3,4. Obecnie optymalizujemy te techniki w celu monitorowania in vivo wzrostu guza pierwotnego i przerzutowania w różnych modelach osteosarkoma. Niektóre z tych technik mogą być również stosowane do analizy przerzutów ex vivo obok metod klasycznych, takich jak qPCR⁵, FACS⁶ czy różne rodzaje barwień histologicznych. W ramach punktu odniesienia ustanowiliśmy w niniejszym badaniu stabilną transfekcję lub transdukcję komórek nowotworowych genem lacZ kodującym bakteryjny enzym β-galaktozydazę, która metabolizuje chromogenny substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galaktopyranosyd (X-Gal) do nierozpuszczalnego barwnika w kolorze indygo⁷, co umożliwia wysoce czułe i selektywne histochemiczne barwienie komórek nowotworowych w tkankach mysich ex vivo na poziomie pojedynczych komórek, jak pokazano w niniejszym materiale. Jest to niskokosztowe narzędzie niewymagające zaawansowanego sprzętu, które pozwala na precyzyjną walidację przerzutów⁸ w badaniach oceniających nowe terapie przeciwnowotworowe^9-11. Czynnikiem ograniczającym barwienie X-gal jest niski kontrast w stosunku do np. czerwonego zabarwienia związanego z krwią w tkankach dobrze unaczynionych. W tkance płuc problem ten można rozwiązać poprzez perfuzję płuc in-situ – technikę opracowaną niedawno przez Borsiga et al.¹², która polega na perfuzji płuc myszy pod narkozą w celu usunięcia z nich krwi, a następnie utrwaleniu i zablokowaniu ich in-situ w stanie nadmuchania poprzez tchawicę. Metoda ta zapobiega również zapadaniu się płuc, a tym samym zachowuje morfologię funkcjonalnych pęcherzyków płucnych, co poprawia jakość tkanki do analizy histologicznej. W niniejszym badaniu opisujemy nowy protokół, który wykorzystuje połączenie barwienia X-gal komórek nowotworowych wykazujących ekspresję lacZ oraz perfuzji i utrwalania tkanki płucnej in-situ. Ten udoskonalony protokół umożliwia wysokoczułe wykrywanie pojedynczych komórek przerzutowych w płucach i pozwolił nam w niedawnym badaniu wykryć „uśpione” mikroprzerzuty w płucach w modelu mysim¹³, który pierwotnie opisywany był jako nieprzerzutowy¹⁴.

Protokół

1. Perfuzja i utrwalanie płuc in-situ

1. Zanurzyć myszy w narkozie poprzez wstrzyknięcie d.o. ~150 μl soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) zawierającej 112,5 mg/kg (masy ciała) ketaminy, 16,5 mg/kg ksylazyny i 15 mg/kg acepromazyny (lub za pomocą innej narkozy zawierającej odpowiednie leki przeciwbólowe).
2. Gdy odruchy myszy przestaną być widoczne, unieruchomić ją na stole operacyjnym na grzbiecie i zwilżyć sierść 70% etanolem, aby przycisnąć włosy do ciała.
3. Rozciąć skórę od brzucha aż do szyi i odsunąć ją na boki lub usunąć.
4. Otworzyć otrzewną i klatkę piersiową, tworząc odpowiednio duży otwór. Unikać przerwania dużych naczyń (np. vena jugularis), aby nie zmniejszyć wydajności późniejszej perfuzji.
5. Przeciąć vena cava caudalis poniżej wątroby.
6. Za pomocą strzykawki 20 ml wyposażonej w igłę 21G - 24G powoli wstrzyknąć 10-15 ml PBS do prawej komory bijącego serca, aż płuca staną się całkowicie białe, a serce przestanie bić (asystolia).
7. Zacisnąć naczynia krwionośne powyżej wątroby i przepony za pomocą klamry naczyniowej.
8. Za pomocą strzykawki 10 ml wyposażonej w igłę 21G - 24G wstrzyknąć ~2 ml 3% paraformaldehydu (PFA) w PBS do prawej komory.
9. Odsłonić tchawicę poza klatką piersiową. Za pomocą tej samej strzykawki wstrzyknąć ~3 ml 3% PFA w PBS do tchawicy w części czaszkowej (poza klatką piersiową), aż płuca zostaną nadmuchane. Natychmiast po wyjęciu igły zacisnąć tchawicę poniżej miejsca nakłucia klamrą naczyniową i odczekać 10 min w celu utrwalenia.
10. Przeciąć naczynia krwionośne powyżej klamry naczyniowej, usunąć klamrę i wstrzyknąć ~2 ml PBS do prawej komory, aby usunąć nadmiar PFA.
11. Nakłuć igłą dolne części wszystkich płatów płuc, usunąć klamrę naczyniową z tchawicy i wstrzyknąć 3-5 ml roztworu medium zatapiającego PolyFreeze/PBS w stosunku 1:1 do tchawicy poniżej pierwszego nakłucia, aż PFA w płatach płuc zostanie zastąpione roztworem.
12. Ostrożnie usunąć płuca, odciągając serce pęsetą i przecinając więzadła tkanki łącznej, naczynia krwionośne oraz tchawicę. Pozostawić serce połączone z płucami.
13. W zależności od planowanej analizy tkanki płucnej kontynuować zgodnie z protokołami opisanymi w sekcjach 2 lub 3. W przypadku chęci wykonania obu analiz, usunąć jeden płat płuca i postąpić zgodnie z opisem w punkcie 3. Pozostałe płaty połączone z sercem przetworzyć zgodnie z opisem w punkcie 2.

2. Wizualizacja komórek przerzutowych guza znakowanych lacZ w całych płatach płuc

1. Umieścić płuco w plastikowym kubku z dopasowaną pokrywką i utrwalić w 2% formaldehydzie w PBS w temperaturze pokojowej przez 30-60 min.
2. Usunąć roztwór utrwalający i dokładnie przemyć 3 razy w PBS.
3. Dodać co najmniej 10 ml świeżo przygotowanego roztworu barwiącego 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktozydem (X-Gal) (roztwór stokowy X-Gal [40 mg/ml w dimetyloformamidzie] rozcieńczony 1:40 w podstawowym roztworze barwiącym; pH 7,1 (Tabela 1); chronić przed światłem).
4. Położyć kawałek gazy na wierzchu pływającego płuca, aby utrzymać je całkowicie w roztworze, a pokrywkę nałożyć na naczynie luźno, aby umożliwić wymianę powietrza.
5. Inkubować w 37 °C przez 3-5 hr, chroniąc przed światłem.
6. Usunąć roztwór X-Gal, wypłukać raz w PBS w celu usunięcia pozostałości roztworu X-Gal (opcjonalnie) i dodać 4% PFA.

3. Wizualizacja komórek przerzutowego guza znakowanych lacZ w krioprzekrojach płuc

1. Wypełnij oznakowaną formę do zatapiania w 1/3 nierozcieńczonym medium do zatapiania PolyFreeze. Umieść na wierzchu płat płuca i dolej medium do zatapiania, aż płat zostanie całkowicie przykryty. Staraj się uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
2. Inkubuj zatopione płuca w temperaturze 4 °C przez 20 min.
3. Następnie powoli zamroź zatopione płuca w mieszaninie suchego lodu i izopentanu, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C.
4. Wykonaj kriostatyczne przekroje o grubości 7-10 μm i osadź je na szkiełkach przedmiotowych SuperFrostPlus.
5. Próbki natychmiast inkubuj z roztworem barwiącym X-Gal w temperaturze 37 °C przez 24 hr w komorze wilgotnościowej.
6. Płucz szkiełka w PBS 2 razy przez 5 min, a następnie krótko w wodzie destylowanej.
7. Wykonaj przeciwbarwienie za pomocą nuclear fast red przez 10-30 sec, wypłucz w wodzie destylowanej i zamontuj preparaty za pomocą Immu-Mount.

4. Reprezentatywne wyniki

Asai et al. zgłosili w oryginalnym artykule na temat modelu mysiego OS LM8 pochodzącego od linii Dunn, że guzy pierwotne s.c. wywodzące się z rodzicielskich komórek Dunn, w przeciwieństwie do tych pochodzących z wysoce przerzutowej podlinii LM8, nie tworzą spontanicznie wykrywalnych przerzutów do płuc u syngenicznych myszy C3H¹⁴. Przy zastosowaniu opisanych tutaj technik ponownie zbadaliśmy tworzenie przerzutów w mysich modelach OS Dunn/LM8. Wykorzystaliśmy stabilnie transdukowane lacZ komórki Dunn i LM8 oraz protokół perfuzji i fiksacji płuc in-situ u myszy. Reprezentatywne obrazy perfundowanych i nieperfundowanych płuc myszy, którym podskórnie wstrzyknięto transdukowane lacZ oraz nietransdukowane kontrolne komórki Dunn i LM8, przedstawiono na Rysunku 1. U myszy wstrzykniętych kontrolnymi komórkami Dunn przerzuty makroskopowe i mikroskopowe pozostały niewykrywalne w płucach nieperfundowanych i perfundowanych (Rysunek 1A, i-iv). Jednakże, co ciekawe, u myszy wstrzykniętych komórkami Dunn-lacZ barwienie X-gal ujawniło niebieskie ogniska mikroprzezrutowe pojedynczych komórek lub małych skupisk komórkowych (< 0,1 mm) na powierzchni nieperfundowanych płuc (Rysunek 1A, vi). Perfuzja i fiksacja płuc in-situ dodatkowo poprawiły wykrywalność mikroprzezrutów Dunn-lacZ (Rysunek 1A, viii). Nie zaobserwowano jednak rozrostu do ognisk makroskopowych (Rysunek 1A, v, vii).

U myszy wstrzykniętych kontrolnymi komórkami LM8 w nieprzepłukanych płucach rozpoznano półprzezroczyste, ledwo wykrywalne ogniska makroprzerzutów o średnicy większej niż 0,1 mm (Rysunek 1B, i). Perfuzja płuc (Rysunek 1B, iii) nie poprawiła wykrywalności tych ognisk. Jednak u myszy wstrzykniętych komórkami LM8-lacZ na powierzchni nieprzepłukanych organów wykryto liczne, zabarwione X-Gal na niebiesko makroprzerzuty (Rysunek 1B, v) oraz mikroprzerzuty (Rysunek 1B, vi). Co więcej, perfuzja płuc dodatkowo poprawiła wykrywalność makro- i mikroprzerzutów (Rysunek 1B, vii-viii). W konsekwencji mikro- i makroprzerzuty stały się widoczne z większą gęstością i w większej liczbie, głównie ze względu na przejrzystość przepłukanej tkanki, w której widoczne stały się również ogniska znajdujące się pod powierzchnią organu.

Dodatkowa analiza histologiczna z wykorzystaniem krioprzekrojów tkanki płuc potwierdziła lepszą wykrywalność przerzutów do płuc u myszy, którym wstrzyknięto komórki Dunn i LM8 transdukowane lacZ. U myszy z guzami pierwotnymi pochodzącymi z komórek Dunn-lacZ lub LM8-lacZ, w przeciwieństwie do myszy z guzami pierwotnymi z odpowiednich komórek kontrolnych, w przekrojach płuc rozpoznano mikroprzerzuty lub nawet pojedyncze ogniska komórkowe (Rysunek 2). Co więcej, makroprzerzuty były również wyraźniej widoczne u myszy, którym wstrzyknięto komórki LM8-lacZ, niż u zwierząt, którym wstrzyknięto kontrolne komórki LM8 (Rysunek 2C, D).

Rycina 1. Wykrywanie przerzutów spontanicznych komórek Dunn (A) i LM8 (B) nietransdukowanych (i-iv) oraz transdukowanych lacZ (v-viii) w płucach nieperfundowanych (i, ii, v, vi) i perfundowanych (iii, iv, vii, viii) myszy C3H. Przerzuty w reprezentatywnych całych płucach barwionych X-Gal (v, vii w A i B) oraz w odpowiadających im powiększeniach (vi, viii w A i B) mają kolor niebieski. Ogniska makroprzerzutowe (> 0.1 mm) w organach myszy wstrzykniętych nieoznakowane komórki LM8 (i-iv w B) zaznaczono gwiazdkami. Obszary pokazane w powiększeniach są reprezentatywne dla całych płuc. Paski skali wskazują 1 mm na obrazach całych płuc i 0.1 mm w powiększeniach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 2. Wykrywanie mikroprzewidziewów Dunn i LM8 w krioskrzykach płuc. Przekroje tkanki płuc zatopionej w O.C.T. inkubowano w roztworze barwiącym X-Gal w temperaturze 37 °C przez 24 hr w komorze wilgotnościowej, a następnie barwiono kontrastowo Nuclear Fast Red. Strzałki wskazują ogniska mikroprzewidziewów rozpoznane w przekrojach płuc myszy wstrzykniętych komórkami Dunn-lacZ (B) lub LM8-lacZ (D). Mikroprzewidziewy pozostały niewykrywalne w przekrojach płuc myszy wstrzykniętych nietransdukowanymi komórkami Dunn (A) lub LM8 (C). Paski skali wskazują 0.1 mm.

Dyskusja

Przedstawione tutaj wyniki w mysim modelu OS Dunn/LM8 demonstrują skuteczność nowo opracowanej metody, która łączy barwienie X-Gal z lacZ-oznaczone komórki nowotworowe za pomocą in situ perfuzja/utrwalanie tkanki płucnej. To połączenie obu technik umożliwia wykrywanie zmian mikrometalstatycznych z wysoką czułością, aż do poziomu pojedynczej komórki, a także poprawia wizualizację makrometalstaz na powierzchni płuc (Rycina 1) a także w przekrojach płuc (Rysunek 2). Choć barwienie X-Gal pozwala również na wykrywanie (mikro)przerzutów w innych narządach, in situ perfuzja/utrwalanie poprawia wykrywalność ognisk przerzutowych w tkankach innych niż płuca jedynie w niewielkim stopniu ze względu na naturalną barwę krwi i tkanek tych organów¹³Nawet jeśli perfuzja jest skierowana do innego narządu, np. wątroby, usunięcie krwi jedynie częściowo poprawiłoby kontrast między barwieniem X-Gal a naturalnym kolorem narządu. Metoda ta jest jednak możliwa do zastosowania w przypadku każdego rodzaju lacZ-oznaczone komórki nowotworowe drastycznie poprawią wykrywalność przerzutów do płuc, aż do poziomu uśpionych pojedynczych komórek w mikroprzerzutach, oraz umożliwią łatwą i wiarygodną kwantyfikację makro- i mikroprzerzutów. Ograniczeniem tej metody oraz wszystkich innych technik opartych na genach reporterowych, w tym lucyferazie i białkach fluorescencyjnych, jest stabilność ekspresji transgenu. Jak pokazano w Rycina 2dnie wszystkie komórki nowotworowe w ogniskach makrometastatycznych są zabarwione na niebiesko, co wskazuje na brak aktywności beta-galaktozydazy. Może to być związane z martwicą, jednak bardziej prawdopodobną przyczyną jest utrata ekspresji transgenu. Zaobserwowaliśmy, że komórki Dunn i LM8 bardzo skutecznie wykazują obniżenie poziomu ekspresji lacZ or inne transgeny, nawet przy ciągłej selekcji na ekspresję. W związku z tym w niedawnych badaniach przeszliśmy na mysie linie komórkowe osteosarkoma K12 i K7M2 oraz ludzkie linie HOS, 143B i SaOS-2, z których wszystkie zachowały stabilną lacZ ekspresja in vitro oraz in vivo do 100% w czasie.

Po zapewnieniu stabilnej ekspresji lacZ, technika ta może zostać zastosowana w badaniach z wykorzystaniem komórek nowotworowych z manipulacjami genetycznymi, np. w celu mechanistycznego zbadania procesu kolonizacji tkanek¹³, a także w opracowywaniu i testowaniu nowych terapii mających na celu eradykację ognisk przerzutowych^15,16. Ponadto może ona służyć jako wzorzec do ulepszania obecnych technik obrazowania radiologicznego, takich jak PET, (mikro)CT i MRI, stosowanych do wczesnego wykrywania przerzutów. W niedawnym badaniu PET (nieopublikowanym) z zastosowaniem różnych znaczników zweryfikowaliśmy wykryte in vivo przerzuty do płuc następnie ex vivo za pomocą opisanego protokołu. W trwającym badaniu z wykorzystaniem nowego mikro-CT dla małych zwierząt (SkyScan) jesteśmy obecnie w stanie wykryć przerzuty do płuc in vivo do wielkości 0,5 mm oraz ex vivo do 0,3 mm, jednak dążymy do uzyskania rozdzielczości 0,1 mm. Co ciekawe, jest to granica wielkości, którą ustaliliśmy w celu rozróżnienia makro- od mikroprzerzutów przy zastosowaniu łączonej metody perfuzji in-situ i barwienia X-Gal. Podkreśla to ponownie czułość i użyteczność tej prostej i kosztowo efektywnej techniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narketan10 (ketamina)	Vétoquinol AG		roztwór o stężeniu 100 mg/ml
Ksylazyna (xylazine)	Streuli Pharma AG		roztwór o stężeniu 20 mg/ml
Prequilan (acepromazyna)	Fatro S.p.A.		roztwór o stężeniu 10 mg/ml
Kleszczyki naczyniowe Serrefine typu Bulldog	Fine Science Tools	18051-35	zakrzywiony, 35 mm
Plastikowy kubek z pokrywką	Semadeni	2988	kubki 25 ml z pokrywkami
5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd (X-Gal); proszek	Axxora	ALX-582-002-G005	rozpuścić w N,N-dimetyloformamidzie do stężenia 40 mg/ml, przechowywać w ciemności w temperaturze -20°C °C
Podstawowy roztwór barwiący, zrównoważony do pH 7,1, przechowywany w ciemności w temperaturze 4°C °C przez maks. 1 miesiąc	własnej produkcji		100 ml/L 10xPBS, 1,64 g/L K3Fe(CN)6, 2,1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% deoksycholan sodu
Medium do zatapiania PolyFreeze	Polysciences; dystrybutor w Szwajcarii: Brunschwig	19636-1
Forma do zatapiania	Polysciences	18646A-1
kriostat Leica CM1850	Leica Microsystems
szkiełka SuperFrost	Menzel	J1800AMNZ
Nuclear-Fast Red – roztwór siarczanu glinu	Division Chroma Waldeck GmbH&dystrybutor amp;Co KG: Medite	84-0241-00
Immu-Mount	Thermo Electron, dystrybutor w Szwajcarii: Histocom	9990412
Tabela 1. Odczynniki i sprzęt.