Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczej komórki u myszy dzięki połączonej perfuzji tkanki płucnej in-situ i barwieniu X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Podsumowanie

Nowatorski protokół opisany w niniejszym badaniu pozwala na selektywne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczej komórki u myszy poprzez połączoną perfuzję i fiksację płuc in-situ oraz barwienie X-Gal komórek nowotworowych oznaczonych lacZ.

Streszczenie

Przerzuty są główną przyczyną zgonów w większości typów nowotworów i w związku z tym głównym celem badań nad rakiem. Jednak wykrywanie mikroprzerzutów za pomocą obrazowania radiologicznego i powodzenie w ich terapeutycznym zwalczaniu pozostają ograniczone.

Chociaż modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami do badań nad rakiem¹, monitorowanie/wizualizacja mikroprzerzutów pozostaje wyzwaniem, a niedokładna ocena rozprzestrzeniania się przerzutów w badaniach przedklinicznych może prowadzić do rozczarowujących wyników w badaniach klinicznych². W związku z tym istnieje duże zainteresowanie udoskonaleniem metod, które ostatecznie umożliwią powtarzalne i wiarygodne wykrywanie przerzutów aż do poziomu pojedynczej komórki w zdrowej tkance. W związku z tym główny nacisk kładziony jest na techniki, które umożliwiają wykrywanie komórek nowotworowych in vivo, takie jak tomografia mikrokomputerowa (micro-CT), pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie bioluminescencyjne lub fluorescencyjne^3,4. Obecnie optymalizujemy te techniki pod kątem monitorowania in vivo wzrostu guza pierwotnego i przerzutów w różnych modelach kostniakomięsaka. Niektóre z tych technik mogą być również stosowane do analizy ex vivo przerzutów obok klasycznych metod, takich jak qPCR⁵, FACS⁶ lub różnych rodzajów barwienia histologicznego. Jako punkt odniesienia ustaliliśmy w niniejszym badaniu stabilną transfekcję lub transdukcję komórek nowotworowych z genem lacZ kodującym enzym bakteryjny β-galaktozydazę, który metabolizuje chromogenny substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-beta-D-galaktopyranozyd (X-Gal) do nierozpuszczalnego barwnika błękitu indygo⁷ i umożliwia wysoce czułe i selektywne histochemiczne barwienie na niebiesko komórek nowotworowych w tkance myszy ex vivo aż do poziomu pojedynczej komórki, jak pokazano tutaj. Jest to tanie i niewymagające dużego zużycia sprzętu narzędzie, które pozwala na precyzyjną walidację przerzutów⁸ w badaniach oceniających nowe terapie przeciwnowotworowe^9-11. Czynnikiem ograniczającym barwienie X-gal jest niski kontrast do np. związanego z krwią czerwonego zabarwienia dobrze unaczynionych tkanek. W tkance płucnej problem ten można rozwiązać za pomocą perfuzji płuc in-situ, techniki, która została niedawno opracowana przez Borsiga i wsp.¹² którzy przeprowadzili fuzję płuc myszy pod narkozą, aby oczyścić je z krwi oraz utrwalić i osadzić in situ pod napompowaniem przez tchawicę. Metoda ta zapobiega również zapadaniu się płuca, a tym samym utrzymuje morfologię funkcjonalnych pęcherzyków płucnych, co poprawia jakość tkanki do analizy histologicznej. W niniejszym badaniu opisujemy nowy protokół, który wykorzystuje połączenie barwienia X-gal komórek nowotworowych wykazujących ekspresję lakZ oraz perfuzji i utrwalenia tkanki płucnej in situ. Ten udoskonalony protokół pozwala na bardzo czułe wykrywanie pojedynczych komórek przerzutowych w płucach i umożliwił nam w niedawnym badaniu wykrycie "uśpionych" mikroprzerzutów do płuc w mysim modelu¹³, który pierwotnie został opisany jako nieprzerzutowy¹⁴.

Protokół

1. Perfuzja i utrwalenie płuc in-situ

1. Znieczulenie myszy przez wstrzyknięcie dożylnie ~150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 112,5 mg / kg (masa ciała) ketaminy, 16,5 mg / kg ksylazyny i 15 mg / kg acepromazyny (lub przez inne znieczulenie zawierające odpowiednie środki przeciwbólowe).
2. Kiedy odruchy myszy nie są już obserwowane, przymocuj ją do stołu operacyjnego z powrotem do dołu i zwilż futro 70% etanolem, aby zlizać włosy.
3. Otwórz skórę od brzucha do szyi i pociągnij ją na boki lub zdejmij.
4. Otwórz otrzewną i klatkę piersiową do dużych rozmiarów. Zapobiegaj pękaniu dużych naczyń krwionośnych (np. żyły szyjnej), aby uniknąć zmniejszenia wydajności późniejszej perfuzji.
5. Przetnij żyłę główną pod wątrobą.
6. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml wyposażonej w igłę 21G - 24G powoli wstrzykiwać 10-15 ml PBS do prawej komory bijącego serca, aż płuco stanie się całkowicie białe, a serce przestanie bić (asystolia).
7. Ściśnij naczynia krwionośne nad wątrobą i przeponą za pomocą zacisku naczyniowego.
8. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 21G - 24G wstrzyknąć ~2 ml 3% paraformaldehydu (PFA) w PBS do prawej komory.
9. Odsłoń tchawicę na zewnątrz klatki piersiowej. Użyj tej samej strzykawki do wstrzyknięcia ~ 3 ml 3% PFA w PBS czaszki (poza klatką piersiową) do tchawicy, aż płuco zostanie napompowane. Natychmiast po wyjęciu igły ściśnięć tchawicę ogonową nakłucia za pomocą zacisku naczyniowego i odczekać 10 minut, aby umożliwić utrwalenie.
10. Przeciąć naczynia krwionośne powyżej zacisku naczyniowego, zdjąć zacisk i wstrzyknąć ~2 ml PBS do prawej komory w celu usunięcia nadmiaru PFA.
11. Nakłuć dolne części wszystkich płatów płuc igłą, usunąć zacisk naczyniowy na tchawicy i wstrzyknąć 3-5 ml roztworu pożywki PolyFreeze/PBS 1:1 do tchawicy ogonowej pierwszego nakłucia, aż PFA w płatach płuc zostanie zastąpiony roztworem.
12. Ostrożnie usuń płuco, ciągnąc serce kleszczami i przecinając więzadła tkanki łącznej, naczynia krwionośne i tchawicę. Utrzymuj serce połączone z płucami.
13. W zależności od sposobu postępowania z analizą tkanki płucnej, należy postępować zgodnie z protokołami opisanymi w punktach 2 lub 3. Jeśli chcesz wykonać obie analizy, usuń jeden płat płuca i postępuj zgodnie z opisem w punkcie 3. Przetwarzaj pozostałe płaty połączone z sercem zgodnie z opisem w punkcie 2.

2. Wizualizacja komórek nowotworowych z przerzutami oznaczonych lacZ w całych płatach płuc

1. Umieść płuco w plastikowym kubku ze szczelnie zamykającą się pokrywką i utrwal je 2% formaldehydem w PBS w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut.
2. Usunąć roztwór utrwalający i dokładnie przemyć 3 razy PBS.
3. Dodać co najmniej 10 ml świeżo przygotowanego roztworu barwiącego 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozydu (X-Gal) (roztwór podstawowy X-Gal [40 mg/ml dimetyloformamidu] w stosunku 1:40 rozcieńczony w zasadowym roztworze barwiącym; pH 7,1 (tabela 1); chronić przed światłem).
4. Połóż kawałek gazy na płucach pływackich, aby utrzymać go całkowicie w roztworze i umieść pokrywkę tylko luźno na garnku, aby umożliwić wymianę powietrza.
5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 godzin, chroniąc przed światłem.
6. Usuń roztwór X-Gal, spłucz raz PBS, aby usunąć resztki roztworu X-Gal (opcjonalnie) i dodaj 4% PFA.

3. Wizualizacja komórek nowotworowych z przerzutami w kriosekcjach płuc oznaczonych lacZ

1. Napełnij oznaczoną formę do zatapiania do 1/3 nierozcieńczonym medium do zatapiania PolyFreeze. Połóż płat płuca na wierzchu i wypełnij go podłożem do zatapiania, aż płat zostanie całkowicie pokryty. Staraj się zapobiegać powstawaniu pęcherzyków.
2. Inkubować osadzone płuca w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
3. Następnie powoli zamrozić osadzone płuca w mieszaninie suchego lodu i izopentanu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
4. Wytnij kriosekcje o wielkości 7-10 μm na kriostacie i zamontuj je na szkiełkach mikroskopowych SuperFrostPlus.
5. Skrawki należy natychmiast inkubować roztworem barwiącym X-Gal w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w wilgotnej komorze.
6. Opłucz szkiełka w PBS 2 razy przez 5 minut, a następnie krótko w wodzie destylowanej.
7. Przeciw barwieniu za pomocą nuclear fast red przez 10-30 sekund, spłucz w wodzie destylowanej i zamontuj szkiełka za pomocą Immu-Mount.

4. Reprezentatywne wyniki

Asai i in. poinformowali w oryginalnym artykule na temat mysiego modelu LM8 OS pochodzącego z Dunna, że pierwotne guzy s.c. pochodzące z rodzicielskich komórek Dunna, inne niż te pochodzące z wysoce przerzutowej linii subkomórkowej LM8, nie tworzą spontanicznie wykrywalnych przerzutów do płuc u syngenicznych myszy C3H¹⁴. Za pomocą opisanych tutaj technik ponownie zbadaliśmy powstawanie przerzutów w mysich modelach systemu operacyjnego Dunn/LM8. Wykorzystaliśmy stabilne komórki Dunn i LM8 transdukowane przez lacZ oraz protokół perfuzji i utrwalenia płuc in situ u myszy. Reprezentatywne obrazy perfundowanych i nieperfundowanych płuc myszy, którym wstrzyknięto podskórnie kontrolne komórki Dunna i LM8 transdukowane przez lacZ i nietransdukowane, pokazano na rycinie 1. U myszy, którym wstrzyknięto kontrolne komórki Dunna, makroskopowe i mikroskopowe przerzuty pozostały niewykrywalne w płucach nieperfundowanych i perfundowanych (ryc. 1A, i-iv). Ale, co ciekawe, u myszy, którym wstrzyknięto komórki Dunn-lacZ, barwienie X-gal ujawniło niebieskie ogniska mikroprzerzutów pojedynczych komórek lub skupisk małych komórek (< 0,1 mm) na powierzchni nieperfundowanych płuc (Figura 1A, vi). Perfuzja i unieruchomienie płuc in situ dodatkowo poprawiły wykrywalność mikroprzerzutów Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). Nie zaobserwowano jednak wyrastania do ognisk makroskopowych (ryc. 1A, v, vii).

U myszy, którym wstrzyknięto kontrolne komórki LM8, w nieperfundowanych płucach rozpoznano półprzezroczyste, ledwo wykrywalne ogniska makroprzerzutowe o średnicy większej niż 0,1 mm (Rysunek 1B, i). Perfuzja płuc (ryc. 1B, iii) nie poprawiła wykrywania ognisk. Jednak u myszy, którym wstrzyknięto komórki LM8-lacZ, na powierzchni nieperfundowanych narządów wykryto wiele wybarwionych na niebiesko makro- (Figura 1B, v) i mikroprzerzutów (Figura 1B, vi). Co więcej, perfuzja płuc jeszcze bardziej poprawiła wykrywalność makro- i mikroprzerzutów (ryc. 1B, vii-viii). W konsekwencji mikro- i makroprzerzuty stawały się widoczne w większej gęstości i większej liczbie, głównie ze względu na przezierność perfundowanej tkanki, w której widoczne stały się również ogniska pod powierzchnią narządu.

Dodatkowa analiza histologiczna z użyciem kriosekcji tkanki płucnej potwierdziła lepszą wykrywalność przerzutów do płuc u myszy, którym wstrzyknięto transdukowane lakZ komórki Dunna i LM8. U myszy z guzami pierwotnymi pochodzącymi z komórek Dunn-lacZ lub LM8-lacZ, w przeciwieństwie do myszy z guzami pierwotnymi odpowiednich komórek kontrolnych, w skrawkach płuc rozpoznano mikroprzerzuty, a nawet ogniska jednokomórkowe (ryc. 2). Co więcej, makroprzerzuty były również wyraźniej widoczne u myszy, którym wstrzyknięto komórki LM8-lacZ niż u zwierząt, którym wstrzyknięto kontrolne komórki LM8 (Figura 2C, D).

Rysunek 1. Wykrywanie spontanicznych przerzutów nietransdukowanych (i-iv) i transdukowanych lacZ (v-viii) komórek Dunna (A) i LM8 (B) w nieperfundowanych (i, ii, v, vi) i perfundowanych (iii, iv, vii, viii) płucach u myszy C3H. Przerzuty w reprezentatywnych całych płucach zabarwionych X-Galem (v, vii w A i B) oraz odpowiednie zbliżenia (vi, viii w A i B) wydają się niebieskie. Ogniska makroprzerzutowe (> 0,1 mm) w narządach myszy, którym wstrzyknięto nieoznakowane komórki LM8 (i-iv w B) są oznaczone gwiazdkami. Obszary pokazane w zbliżeniach są reprezentatywne dla całych płuc. Paski skali wskazują 1 mm na obrazach całych płuc i 0,1 mm na zbliżeniach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Wykrywanie mikroprzerzutów Dunna i LM8 w kriosekcjach płuc. Skrawki tkanki płucnej zatopionej w OCT inkubowano w roztworze barwiącym X-Gal w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w wilgotnej komorze, a następnie przeciwbarwiono czerwienią jądrową. Strzałki wskazują na ogniska mikroprzerzutowe rozpoznawane w odcinkach płuc myszy, którym wstrzyknięto komórki Dunn-lacZ (B) lub LM8-lacZ (D). Mikroprzerzuty pozostały niewykrywalne w skrawkach płuc myszy, którym wstrzyknięto nietransdukowane komórki Dunna (A) lub LM8 (C). Paski skali wskazują 0,1 mm.

Dyskusja

Przedstawione tutaj wyniki w mysim modelu operacyjnym Dunn/LM8 pokazują moc nowo opracowanej metody, która łączy barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ z perfuzją/utrwalaniem tkanki płucnej in situ . To połączenie tych dwóch technik pozwala na bardzo czułe wykrywanie zmian mikroprzerzutowych aż do poziomu pojedynczej komórki, a także poprawia wizualizację makroprzerzutów na powierzchni płuc (ryc. 1), a także w skrawkach płuc (ryc. 2). Podczas gdy barwienie X-Gal pozwala również na wykrycie (mikro)przerzutów w innych narządach, perfuzja/utrwalenie in-situ poprawia wykrywalność ognisk przerzutowych w tkankach innych niż płuca tylko nieznacznie ze względu na naturalny kolor krwi i tkanek tych narządów¹³. Nawet jeśli perfuzja jest skierowana do innego narządu, np. wątroby, usunięcie krwi tylko częściowo poprawiłoby kontrast między barwieniem X-Gal a naturalnym kolorem narządu. Jednak metoda ta ma zastosowanie do każdego rodzaju komórek nowotworowych znakowanych lacZ, radykalnie poprawi wykrywalność przerzutów do płuc aż do poziomu uśpionych mikroprzerzutów jednokomórkowych i umożliwi łatwą i wiarygodną ocenę ilościową makro- i mikroprzerzutów. Ograniczeniem tej metody i wszystkich innych technik opartych na genach reporterowych, w tym lucyferazie i białkach fluorescencyjnych, jest stabilność ekspresji transgenu. Jak pokazano na rycinie 2d, nie wszystkie komórki nowotworowe w ogniskach makroprzerzutów są zabarwione na niebiesko, co wskazuje na brak aktywności beta-galaktozydazy. Może to być związane z martwicą, ale bardziej prawdopodobne jest, że jest to spowodowane utratą ekspresji transgenu. Zaobserwowaliśmy, że komórki Dunn i LM8 są bardzo skuteczne w regulacji w dół lacZ i innych transgenów, nawet przy ciągłej selekcji ekspresji. Dlatego w ostatnich badaniach przeszliśmy na mysie linie komórkowe K12 i K7M2 oraz ludzkie linie komórkowe kostniakomięsaka HOS, 143B i SaOS-2, które utrzymywały stabilną ekspresję lacZ in vitro , a także in vivo do 100% w czasie.

Po zagwarantowaniu stabilnej ekspresji lacZ, technika ta może być stosowana w badaniach na komórkach nowotworowych manipulowanych genami, np . do mechanicznego badania procesu kolonizacji tkanek¹³ , a także do opracowywania i testowania nowych terapii mających na celu eradykację zmian przerzutowych^15,16. Ponadto może służyć jako punkt odniesienia dla poprawy obecnych technik obrazowania radiologicznego, takich jak PET, (mikro)CT i MRI, stosowanych do wczesnego wykrywania zmian przerzutowych. W niedawnym badaniu PET (niepublikowanym) z różnymi znacznikami zweryfikowaliśmy wykryte in vivo przerzuty do płuc, a następnie ex vivo zgodnie z opisanym protokołem. W trwającym badaniu z wykorzystaniem nowej mikrotomografii komputerowej dla małych zwierząt (SkyScan) jesteśmy do tej pory w stanie wykryć przerzuty do płuc in vivo do wielkości 0,5 mm i ex vivo do 0,3 mm, ale dążymy do rozdzielczości 0,1 mm. Co ciekawe, jest to limit wielkości, który ustaliliśmy, aby odróżnić makro- od mikroprzerzutów za pomocą połączonej metody perfuzji in-situ i barwienia X-Gal. Podkreśla to ponownie wrażliwość i użyteczność tej łatwej i opłacalnej techniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narketan10 (ketamina)	Vé tochinol AG		100 mg/ml roztwór
Ksylazyna (ksylazyna)	Streuli Pharma AG		20 mg/ml roztwór
Prequilan (acepromazyna)	Fatro S.p.A.		Roztwór 10 mg/ml
Zacisk naczyniowy Bulldog Typ Serrefine	Fine Science Tools	18051-35	zakrzywiony, 35 mm
Plastikowy kubek z pokrywką	Semadeni	2988	Kubki 25 ml z pokrywkami
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktozyd (X-Gal); proszek	Axxora	ALX-582-002-G005	rozpuścić w N,N-Di-metyloformamidzie do 40 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20 ° st; C
Zasadowy roztwór barwiący, o pH 7,1, przechowywany w temperaturze 4 stopni Celsjusza w temperaturze 4 stopni; C na maksymalnie 1 miesiąc	samodzielnie przygotowany		100 ml/L 10xPBS, 1,64 g/L K3Fe(CN)6, 2,1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Deoksycholan sodu
PolyFreeze Embedding Medium	Polysciences; szwajcarski dystrybutor: Brunschwig	19636-1
Forma do zatapiania	Polysciences	18646A-1
Kriostat Leica CM1850	Leica Microsystems
Prowadnice SuperFrost	Menzel	J1800AMNZ
Nuclear-Fast Red - Roztwór siarczanu glinu	Division Chroma Waldeck GmbH& Dystrybutor Co KG: Medite	84-0241-00
Immu-Mount	Thermo Electron, szwajcarski dystrybutor: Histocom	9990412