Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgowej myszy i hipokampie za pomocą elektroporacji in utero

DOI:

10.3791/4163

⸱

26 lipca 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Neurobiology, MRC National Institute for Medical Research, 2Confocal and Image Analysis Laboratory, National Institute for Medical Research, 3Physiopathologie de la plasticité neuronale, Neurocentre Magendie, Université de Bordeaux

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji w macicy kory mózgowej i hipokampa przy E14.5 u myszy. Pokazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców w tych dwóch regionach mózgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja in utero (IUE) stała się potężną techniką do badania rozwoju różnych regionów embrionalnego układu nerwowego 1-5. Do tej pory narzędzie to było szeroko stosowane do badania regulacji proliferacji, różnicowania i migracji neuronów, zwłaszcza w rozwijającej się korze mózgowej 6-8. Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół elektroporacji w macicy kory mózgowej i hipokampa oraz przedstawiamy dowody na to, że to podejście można wykorzystać do badania dendrytów i kolców w tych dwóch regionach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja neuronami w kulturach pierwotnych przyczyniły się do lepszego zrozumienia procesów związanych z rozwojem dendrytów, kręgosłupów i synaps. Jednak neurony rosnące in vitro nie są narażone na wszystkie sygnały fizjologiczne, które mogą wpływać na tworzenie i utrzymanie dendrytów i/lub kręgosłupa podczas normalnego rozwoju. Nasza wiedza na temat struktur dendrytowych i kręgosłupowych in vivo u myszy typu dzikiego lub zmutowanego pochodzi głównie z obserwacji metodą Golgiego-Coxa 9. Jednak barwienie Golgiego jest uważane za nieprzewidywalne. Rzeczywiście, grupy komórek nerwowych i dróg włóknistych są oznaczane losowo, przy czym poszczególne obszary często wydają się całkowicie zabarwione, podczas gdy sąsiednie obszary są pozbawione barwienia. Ostatnie badania wykazały, że IUE konstruktów fluorescencyjnych stanowi atrakcyjną alternatywną metodę badania dendrytów, kolców, a także synaps u myszy zmutowanych / dzikich 10-11 (Figura 1A). Co więcej, w porównaniu z generowaniem nokautów myszy, IUE stanowi szybkie podejście do przeprowadzania badań przyrostu i utraty funkcji w określonej populacji komórek w określonym oknie czasowym. Ponadto IUE jest z powodzeniem stosowany z indukowalną ekspresją genów lub indukowalnymi metodami RNAi w celu udoskonalenia czasowej kontroli nad ekspresją genu lub shRNA 12. Te zalety IUE otworzyły zatem nowe wymiary do badania wpływu ekspresji/supresji genów na dendryty i kolce nie tylko w określonych strukturach mózgowych (Figura 1B), ale także w określonym punkcie czasowym rozwoju (Figura 1C).

Na koniec, IUE dostarcza użytecznego narzędzia do identyfikacji funkcjonalnych interakcji między genami zaangażowanymi w rozwój dendrytu, kręgosłupa i/lub synaps. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do innych metod transferu genów, takich jak wirus, łatwo jest połączyć wiele RNAi lub transgenów w tej samej populacji komórek.

Podsumowując, IUE to potężna metoda, która już przyczyniła się do scharakteryzowania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw funkcjonowania mózgu i choroby, a także powinna być przydatna w badaniu dendrytów i kolców.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Wielkiej Brytanii myszy są hodowane, hodowane i leczone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych na mocy Ustawy o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku.

1. Przygotowanie: roztwór DNA i igły

  1. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu Maxi-prep bez endotoksyn. Przygotuj roztwór plazmidowego DNA do wstrzykiwań do pożądanych stężeń w wodzie i dodaj Fast Green (końcowe stężenie 0,05%), aby uwidocznić wstrzyknięcia. Skuteczność elektroporacji jest w dużym stopniu zależna od stężenia DNA. Zwykle stosuje się stężenie 1 μg/μl. Stężenie to jest wystarczające do wizualizacji neuronów poddanych elektroporacji bez wpływu na ich rozwój. Jednak w zależności od promotora zastosowanego w wektorze plazmidowym (niski poziom ekspresji z promotorem/wzmacniaczem wirusa cytomegalii, silny poziom ekspresji z natychmiastowym wczesnym wzmacniaczem wirusa cytomegalii i promotorem fuzji promotora β-aktyny (CAG) z kurczaka), a także wielkości i stabilności wyrażanego białka, stężenie to można dostosować (0,25 μg/μl do 5 μg/μl).
  2. Wyciągnij szklane igły za pomocą ściągacza do mikropipet.

2. Przygotowanie do zabiegu

  1. Autoklaw chirurgiczne i sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS).
  2. Przygotować roztwór przeciwbólowy w PBS (Buprenorfina, Wetergezy, końcowe stężenie 30 μg/ml). Zważyć ciężarną mysz i wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg leku Vetergesic co najmniej 30 minut przed zabiegiem. W tym czasie należy przygotować obszar operacyjny. Włącz poduszki grzewcze i komorę regeneracji. Umieść sterylny PBS w kąpieli z ciepłą wodą, a wszystkie sterylne narzędzia i materiały na sterylnych serwetach. Umieść platynowe elektrody w zlewce wypełnionej PBS i podłącz do elektroporatora. Napełnij igłę roztworem DNA za pomocą końcówki mikroładowarki, połącz igłę z uchwytem kapilarnym i ściśnij końcówkę igły kleszczami.

3. Operacja przed wstrzyknięciem DNA i elektroporacją

  1. Znieczulić ciężarną mysz (E14.5-E15.5) izofluranem w nośniku tlenu (tlen 2 l/min) za pomocą anestezjologicznej komory indukcyjnej. Poczekaj, aż zwierzę straci odruch prostowania.
  2. Przenieś zwierzę do maski "przedoperacyjnej". Umieść kroplę żelu pod oczami na każdym oku, aby zapobiec owrzodzeniu rogówki oczu, gdy matka jest w znieczuleniu ogólnym. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić włosy na brzuchu. Oczyść ogolony obszar raz klorhexidine, aby zebrać latające włosy.
  3. Przenieś zwierzę do drugiej maski w obszarze operacyjnym. Umieść mysz tyłem na poduszce grzewczej. Rozpocznij operację, gdy odruch pedałowania został utracony
    4. .
  4. Załóż maskę i sterylne rękawiczki. Przykryj zwierzę sterylną serwetą (z małym otworem nad brzuchem), aby zapobiec zanieczyszczeniu tkanek i narzędzi przez obszary skóry, które nie zostały ogolone i zdezynfekowane. Oczyść ogolony obszar co najmniej 3 razy za pomocą krokeksydyny. Za każdym razem używaj innego sterylnego wacika. Użyj skalpela, aby wykonać pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej (~ 1 cal długości) przez skórę. Za pomocą nożyczek wykonaj podobne nacięcie mięśnia brzucha wzdłuż linea alba (biała linia złożona głównie z kolagenowej tkanki łącznej).
  5. Wybierz najbardziej dostępne zarodki i umieść kleszcze pierścieniowe między dwoma zarodkami i ostrożnie wyciągnij łańcuch embrionalny z jamy brzusznej. Od tego momentu utrzymuj zarodki nawodnione sterylnym, wstępnie podgrzanym PBS.

Do wizualizacji nie jest wymagany mikroskop.

4. Wstrzykiwanie DNA i elektroporacja

  1. Zacznij od jednego z najbardziej bocznych zarodków, co ułatwi śledzenie, które zarodki zostały poddane elektroporacji. Nie ciągnij zbyt mocno za zarodki, ponieważ zwiększy to ryzyko krwotoku. Manipuluj położeniem zarodka wewnątrz worka owodniowego za pomocą kleszczy pierścieniowych i ustabilizuj głowę zarodków między pierścieniami. Delikatnie ściśnij, aby popchnąć zarodek bliżej ściany macicy.
  2. Drugą ręką weź uchwyt kapilarny i ostrożnie włóż igłę w środek półkuli, aby celować w komorę boczną. Naciśnij pedał, aby wstrzyknąć około 1 μl roztworu DNA zmieszanego z Fast Green (mniej niż 1 μl do badania dendrytów). Należy obserwować zielony barwnik wypełniający komorę boczną. Kluczowe kroki: - Ostrość igły ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego przekłucia ściany macicy. Ważne jest, aby zminimalizować ruch igły na powierzchni ściany macicy i po wprowadzeniu do komory, ponieważ powiększenie otworu spowoduje wyciek płynu owodniowego i śmierć zarodka. Należy unikać przekłuwania naczyń krwionośnych w ścianie macicy, ponieważ może to spowodować krwawienie i śmierć zarodka.
    - Ważne jest, aby nie wstrzykiwać zbyt dużej objętości DNA do komory bocznej, ponieważ spowoduje to wodogłowie (nie przekraczaj 2 μl przy E14,5). Objętość DNA jest dostosowywana w zależności od celu eksperymentu. Jeśli w większości eksperymentów zwykle stosuje się 1 μl, do analizy dendrytów i kręgosłupa wymagana jest mniejsza objętość DNA (około 0,5 μl). Rzeczywiście, kilka izolowanych komórek musi być namierzonych, aby uwidocznić i zmierzyć dendrytyczną altanę neuronów poddanych elektroporacji.
  3. Umieść elektrody po bokach głowy zarodka z dodatnią (+) łopatką po tej samej stronie, co wstrzyknięta komora do elektroporacji kory lub po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory do elektroporacji hipokampa (ryc. 2). Następnie zastosuj pięć impulsów elektrycznych 30 V (czas trwania 50 ms) w odstępach 1 sekundy. Krok krytyczny: Unikaj stosowania prądu przez łożysko, ponieważ spowoduje to śmierć zarodka.
    Wszystkie zarodki u ciężarnej myszy mogą być elektroporowane, zwykle przy użyciu tego samego konstruktu DNA, aby uniknąć nieporozumień. Jednak długa operacja zmniejsza przeżywalność zarodków. Jama brzuszna nie powinna być otwierana dłużej niż 30 minut.

5. Zabieg chirurgiczny po elektroporacji

  1. Po elektroporacji zarodków dodaj PBS do jamy brzusznej i użyj kleszczyków pierścieniowych, aby zastąpić róg macicy w jego pierwotnym miejscu. Zszyj ścianę brzucha i skórę za pomocą wchłanialnych szwów Vicryl.
  2. Umieść zwierzę w komorze rekonwalescencyjnej, aż się obudzi (zwykle 5-10 min), a następnie przenieś do klatki umieszczonej na poduszce grzewczej.

6. Po operacji

Sprawdź zachowanie myszy, aby ocenić ból, cierpienie lub niepokój i zważyć zwierzęta 24 godziny i 48 godzin po operacji. W razie potrzeby można podać leki przeciwbólowe, aby zminimalizować ból i dyskomfort.

7. Przetwarzanie tkanek

Zbierz elektropograficznie naelektryzowane zarodki lub młode w stadium embrionalnym lub posturodzeniowym wymaganym do eksperymentu.

- Do analizy w stadium embrionalnym (na przykład do badania proliferacji lub migracji komórek):
Poddaj matkę eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy i zbierz zarodki. Po dekapitacji wybierz mózgi, które zostały prawidłowo poddane elektroporacji, na co wskazuje ilość i lokalizacja sygnału fluorescencyjnego, uwidocznionego w całej czaszce za pomocą fluorescencyjnej lornetki. Wypreparuj mózg z czaszki i utrwal przez noc w 4% PFA, a następnie umieść na noc w 20% sacharozy / PBS. Zanurzyć w związku OCT, zamrozić w temperaturze -80 °C i przeciąć za pomocą kriostatu.

- Do analizy w okresie postnatalnym (na przykład do badania dendrytów i kolców):
Znieczulić szczenięta lub dorosłe myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitonu (40-60 mg / kg) i wykonać perfuzję przezsercową za pomocą PBS, a następnie 4% PFA w PBS. Wypreparuj mózgi z czaszki i po naprawie w 4% PFA przez noc. Po przepłukaniu w PBS należy podzielić mózgi za pomocą wibratomu (skrawki 100 μm do analizy dendrytów). Zamontuj sekcje w Aqua Poly/zamontuj za pomocą szkiełek nakrywkowych o grubości 0,16-0,19 mm, aby zobrazować dendryty i grzbiety.

8. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 3 pokazuje przykłady elektroporowanych komórek w korze mózgowej (Rysunki 3A, B), w CA1 (Rysunki 3C, D) i w zakręcie zębatym hipokampa (Rysunki 3E, F). Myszy typu dzikiego poddano elektropowadze w E14.5 za pomocą konstruktu GFP (tłumik pCA-b-EGFPm5 3), a mózgi pobrano w dniu pourodzeniowym (P) 14. Poprzez wstrzyknięcie niewielkiej objętości roztworu DNA (0,5 μl lub mniej roztworu o stężeniu 1 μg/μl), znakuje się kilka komórek, co pozwala na wizualizację arboryzacji dendrytycznej izolowanych komórek GFP+ (ryc. 3), a także ich kolców przy większym powiększeniu (ryc. 4).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie protokołów elektroporacji, które można wykorzystać do badania dendrytów i kolców. (A) Elektroporacja konstruktu GFP w celu porównania dendrytów i kolców u myszy typu dzikiego i zmutowanego. (B) Elektroporacja GFP-shRNA (GFP ulega ekspresji z tego samego konstruktu) w celu porównania dendrytów i kolców u myszy poddanych elektroporacji konstruktem shRNA specyficznym dla genu będącego przedmiotem zainteresowania (X) lub kontrolnego shRNA. (C) IUE może być stosowany razem z systemem indukowalnym Cre w celu ograniczenia ekspresji shRNA do pożądanego okresu czasu. W tym eksperymencie wektor wyrażający formę rekombinazy Cre, która może być aktywowana przez 4-hydroksytamoksyfen (CAG-ERT2CreERT2; 1 μg/μl) 10, jest elektropostowany wraz z wektorem wyrażającym specyficzne shRNA w sposób zależny od Cre (1 μg/μl) oraz wskaźnikiem rekombinacji (konstrukt CALNL-GFP, ekspresja GFP indukowana przez Cre; 1 μg/μl) 10. Skuteczność knockdownu można poprawić, zwiększając stężenie shRNA, a także zwiększając stężenie CAG-ERT2CreERT2.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Przestrzenna kontrola elektroporacji. Ten rysunek pokazuje, gdzie należy ustawić elektrody łopatkowe w zależności od miejsca wstrzyknięcia DNA, aby celować w korę mózgową lub hipokamp.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wizualizacja altany dendrytycznej komórek elektroporowanych in utero w korze mózgowej i hipokampie. (A, B) Przekroje koronalne pokazujące komórki piramidalne GFP+ w korze mózgowej, (C-D) komórki piramidalne w CA1 hipokampa i (E, F), komórki ziarniste w zakręcie zębatym w P14. Konstrukt GFP (tłumik pCA-b-EGFPm5 3) został poddany elektroporacji w temperaturze E14,5. Zdjęcia w większym powiększeniu (B, D, F) pokazują, że IUE jest skuteczną metodą wizualizacji dendrytów. Podziałka skali reprezentuje 50 μm (B, D i F), 150 μm (A, C, E).

figure-protocol-4
Rysunek 4. Wizualizacja kolców dendrytycznych w neuronach P14, które zostały elektroporowane w macicy w E14.5 za pomocą konstruktu wyrażającego GFP. (A, B) Obrazy kolców w dużym powiększeniu z dendrytów podstawy neuronów piramidowych hipokampa. Podziałka liniowa reprezentuje 5 μm (A) i 2 μm (B).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IUE jest potężnym narzędziem do manipulowania ekspresją genów nie tylko w przestrzeni, ale także w czasie. Pokazujemy tutaj, że technika ta może być wykorzystana do wizualizacji i genetycznego manipulowania dendrytami i kolcami w korze mózgowej i hipokampie myszy. Oprócz wcześniej wymienionych zalet, warto zauważyć, że IUE, w przeciwieństwie do metody Golgiego, może być łączona z immunohistochemią lub hybrydyzacją in situ, co pozwala na przykład na fenotypowanie elektroporowanych komórek. Należy również wspomnieć, że procedura ta nie wywołuje widocznych wad rozwojowych mózgu pomimo swojej względnej inwazyjności. Ponadto, na poziomie komórkowym, IUE nie modyfikuje właściwości elektrofizjologicznych neuronów poddanych elektroporacji13. Podczas gdy nasza demonstracja koncentruje się na wizualizacji morfologii dendrytów i kręgosłupa, IUE neuronów korowych lub hipokampa w E14.5 może być również wykorzystana do badania innych zdarzeń rozwojowych, takich jak tworzenie aksonów i przewodnictwo. Ponadto ten sam rodzaj protokołu może być stosowany na innych etapach rozwoju embrionalnego, aby ukierunkowany na różne populacje. Na przykład, rozwojowo bardzo późny paradygmat elektroporacji korowej przy E18.5 może być wykonany w celu kierowania ekspresją u astrocytów progenitorowych 1. Podobnie, podczas gdy elektroporacja hipokampa w E14,5 pozwala na jednoczesne celowanie w progenitory neuronów piramidowych CA1-CA3 i prekursora komórek ziarnistych zębatki, późna elektroporacja hipokampa (E18,5 lub wczesna postnatalność) pozwoliłaby na celowanie w różne progenitory ziarnistości zębatej 14. W takim przypadku można zwiększyć objętość wstrzykniętego DNA, a także natężenie prądu.

Wydaje się, że transgeny wprowadzone przez IUE pozostają episomalne i dlatego są tracone z komórek po kolejnych podziałach komórkowych. Jednak w komórkach postmitotycznych, takich jak neurony, transgeny episomalne pozostają aktywne przez wiele miesięcy po elektroporacji, co pozwala na długoterminowe badania 13,15. W naszym badaniu zaobserwowaliśmy jasne komórki GFP+ do 7 tygodni po urodzeniu (ostatni analizowany przez nas punkt czasowy), co wskazuje, że embrionalne celowanie w prekursory neuronów korowych lub hipokampa za pomocą IUE powoduje trwałą ekspresję transgenu od wczesnych punktów rozwojowych aż do dorosłości.

Obecnym ograniczeniem tej techniki jest to, że trudno jest sprawować precyzyjną kontrolę nad całkowitą liczbą ogniw elektroporowanych. Jednak zmniejszając wstrzykiwaną objętość roztworu DNA, wykazaliśmy, że możliwe jest oznakowanie kilku komórek i wizualizacja arboryzacji dendrytycznej izolowanych komórek GFP+, a także ich kolców. Wymiar transfekowanego obszaru można również regulować, modyfikując parametry elektroporacji, takie jak natężenie prądu i liczba impulsów lub średnica łopatek elektroporacji.

Podsumowując, IUE jest metodą łatwą do wdrożenia, szybką i skuteczną do badania dendrytów i kolców in vivo.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Kathleen Mathers, dr Jean-Philippe Mocho i dr Yolandzie Saavedra Torres za pomoc w przeprowadzeniu elektroporacji in utero pod nadzorem aseptycznym, a także Hayley Wood za pomoc w przygotowaniu rysunków.

E.P. był wspierany przez długoterminowe stypendium Federacji Europejskich Towarzystw Biochemicznych (FEBS) i stypendium Rozwoju kariery Rady Badań Medycznych (MRC), M.A.H. przez grant Wellcome Trust dla Elizabeth Fisher i Victora Tybulewicza (080174/B/06/Z), H.W. przez długoterminowe stypendium EMBO, a R.A. przez stypendium MRC. Prace te zostały wsparte grantem projektowym z Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) oraz grantem z Rady ds. Badań Medycznych (U117570528) dla F.G.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przygotowanie igieł i roztworu DNA do wstrzykiwań
Endofree Plasmid Maxi KitQiagen12362
Fast GreenSigmaF-7258
Kapilary ze szkła borokrzemianowego
1,0 mm średnica zewnętrzna x średnica zewnętrzna 0,58 mm		Harvard Apparatus30-0016
Końcówki do mikroładowarekEppendorf5242956003Do pipet Eppendorf 0,5 μ L-10 Μ L / 2-20 Μ l
Materiał do operacji
Bardzo cienkie nożyczki do irysów Fine Science Tools14088-10
Kleszcze zakrzywioneFine Science Tools91197-00
Kleszcze pierścienioweFine Science Tools11103-09
Uchwyt na igłyFine Science Tools12002-12
Kleszcze Graefe Fine Science Tools11050-10
Nici wchłanialne VicrylEthicon Inc (Johnson Johnson)W9074
Sterylne serwety 30cm x 45 cmBuster141765
Sterylne wacikiShermondHUBY-340
Patyczki kosmetyczneClean Cross Co., Ltd1860
Buprenorfina (Vetergesic)Alstoe Zdrowie zwierząt
Clorhexidine VetaseptXHG007
Żel do oczu Viscotears Novartis
IsofluraneAbbott LaboratoriesB506
Pentoject, Pentobarbiton Sód 20%Animalcare
Electroporation
Electroporator BTXECM830
Platinum Pęseta 5mmBTX, Harvard Apparatus45-0489
Mikrowtryskiwacz FemtojetEppendorf5247000030
Sterownik nożny do mikrowtryskiwacza FemtojetEppendorf5247623002
Uchwyt kapilarnyEppendorf5176190002
Przetwarzanie tkanek
ParaformaldehydSigmaP6148
SacharozaVWR (Prolabo)27480.294
Szkiełka mikroskopoweThermoScientific (Menzel-Glä ser)J1800AMNZ
Szkiełka nakrywkoweMenzel-Glä ser22 x 50 mm #1,5
Aqua Poly/mocowaniePolysciences, Inc18606

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Front Mol. Neurosci. 4, 37(2011).
  2. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  3. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
  6. Castro, D. S. A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets. Genes Dev. 25, 930-945 (2011).
  7. Pacary, E. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, 1069-1084 (2011).
  8. Marteau, L. Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon. Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).
  9. Ramon Moliner, E. Comparative Methods in Neuroanatomy. , Springer. New york. (1970).
  10. Banks, G. T. Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse. J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).
  11. Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).
  12. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  13. Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. ong-term selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).
  14. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).
  15. Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX. Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In Utero ElectroporationDendrite VisualizationSpine AnalysisMouse Cerebral CortexHippocampus ElectroporationConfocal MicroscopyGenetic ManipulationPlasmid InjectionVibratome SectioningInducible Gene Expression

Powiązane artykuły