Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

25.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4171

⸱

10 sierpnia 2012

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Toxicology, & Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Streszczenie

Dopamina jest intensywnie badanym neuroprzekaźnikiem w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W istocie, jej zaangażowanie w aktywność lokomotoryczną i zachowania związane z nagrodą stymulowało przez pięć dekad badania nad deficytami molekularnymi związanymi z regulacją dopaminy. Większość tych analiz dotyczących regulacji dopaminy w mózgu koncentruje się na molekularnych podstawach jej regulacji w obszarach pól terminalnych szlaków nigrostriatalnego i mezoakumbensowego: prążkowiu oraz jądrze półleżącym. Ponadto badania te skupiały się na analizie zawartości dopaminy w tkance z normalizacją wyłącznie do masy mokrej tkanki. Badania białek regulujących dopaminę, takich jak białko hydroksylaza tyrozynowa (TH), fosforylacja TH, transporter dopaminy (DAT) oraz białko pęcherzykowego transportera monoamin 2 (VMAT2), często nie obejmują analizy zawartości dopaminy w tej samej próbce. Możliwość analizy zarówno zawartości dopaminy w tkance, jak i białek ją regulujących (w tym modyfikacji potranslacyjnych) nie tylko zwiększa potencjał interpretacji zależności dopaminy od poziomu białek i funkcji TH, DAT lub VMAT2, ale także poprawia ekonomię wykorzystania próbek. Przekłada się to na niższe koszty, a jednocześnie dostarcza wiedzy na temat molekularnej regulacji dopaminy w praktycznie każdym paradygmacie wybranym przez badaczy.

Analizy koncentrujemy na śródmózgowiu. Chociaż SN i VTA są zazwyczaj pomijane w większości badań nad regulacją dopaminy, jądra te można z łatwością wypreparować wraz z praktyką. Możliwe jest przeprowadzenie kompleksowego pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz poziomu TH, DAT lub VMAT2. Coraz więcej publikacji wskazuje na wpływ funkcji dopaminergicznej w SN i VTA na zachowanie oraz oddziaływanie substancji egzogennych lub procesów chorobowych w tych obszarach 1-5. Ponadto związki takie jak czynniki wzrostu wywierają głęboki wpływ na dopaminę i białka regulujące jej poziom, w stosunkowo większym stopniu w SN lub VTA 6-8. Dlatego niniejsza metodologia została przedstawiona jako punkt odniesienia dla laboratoriów, które chcą rozszerzyć swoje badania nad tym, jak konkretne zabiegi modulują zachowanie i regulację dopaminy. Przedstawiono tutaj wieloetapową metodę analizy zawartości dopaminy w tkance, poziomów białek TH, DAT lub VMAT2 oraz fosforylacji TH w istocie czarnej i VTA ze śródmózgowia gryzoni. Analiza fosforylacji TH może dostarczyć istotnych informacji nie tylko na temat regulacji aktywności TH, ale także kaskad sygnalizacyjnych, na które oddziałują jądra somatodendrytyczne w danym paradygmacie.

Przedstawimy technikę sekcji służącą do oddzielenia tych dwóch jąder oraz sposób przetwarzania próbek wyseczonej tkanki, który pozwala na uzyskanie profilu ujawniającego mechanizmy molekularne regulacji dopaminy in vivo, specyficzne dla każdego jądra (Rycina 1).

Protokół

1. Disekcja

  1. Na podłożu z kruszonego lodu schłodzić matrycę do mózgu gryzonia (przekroje wieńcowe rozmieszczone co 1 mm), płytkę Petriego zawierającą 5 żyletki oraz skalpel z ostrzem nr 11. W osobnym pojemniku umieścić opisane probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml w suchym lodzie.
  2. Badacz wybiera metodę eutanazji. Otrzymujemy powtarzalne wyniki, przeprowadzając bardzo krótką anestezję izofluranem. Idealnie byłoby zastosować parownik. Jeśli jednak nie jest on dostępny, używamy dużego słoja szklanego z platformą. Umieściwszy słój w zatwierdzonym dygestorium, należy położyć nasączony izofluranem gazik pod platformą i odczekać 3-5 minut, aby izofluran nasycił wnętrze słoja. Włożyć szczura do słoja i wyjąć go do dekapitacji natychmiast po utracie przytomności przez zwierzę. Szybko wyciąć mózg (idealnie w czasie poniżej dwóch minut), opłukać pod zimną wodą i natychmiast umieścić w schłodzonej matrycy do mózgu gryzonia.
  3. Minutę po umieszczeniu mózgu w matrycy, wsunąć zimne żyletki w schłodzony mózg, zaczynając około 2 mm rostralnie od skrzyżowania wzrokowego, jeśli do analizy – poza jądrami śródmózgowia – potrzebne są również prążkowie i jądro półleżące. Kontynuować wsuwanie zimnych żyletek w każdy przekrój 1 mm, aż do osiągnięcia połowy mostu, przesuwając miejsce umieszczenia każdej kolejnej żyletki tak, aby ułatwić późniejsze wyjmowanie poszczególnych ostrzy.
  4. Podczas wyciągania żyletek zlokalizować początek hipokampa. Gdy ten całkowicie otoczy śródmózowie, rozpocząć pobieranie przekrojów za pomocą ostrza skalpela nr 11, zgodnie z ilustracją na Rysunku 2.
  5. Wypreparowaną tkankę niezwłocznie umieścić w wstępnie schłodzonej probówce do mikrocentryfugi na suchym lodzie. W przypadku szczura można oczekiwać możliwości wypreparowania SN i VTA z minimum dwóch i maksimum trzech przekrojów wieńcowych. Przechowywać tkanki w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia obróbki.

2. Analiza tkanek: HPLC dla dopaminy i metabolitów

Aby uzyskać pełne informacje na temat sprzętu i konserwacji HPLC, należy zapoznać się z sekcją HPLC analysis na końcu rękopisu.

  1. Gently homogenizuj tkankę natychmiast po wyjęciu z suchego lodu, używając lodowatego roztworu 0.1 M HClO4-EDTA (0.1 M HClO4 & 0.1 mM EDTA) 9, który zawiera N-metylodopaminę w stężeniu 20 ng/mL służącą jako standard wewnętrzny do wyznaczenia odzysku próbki podczas analizy HPLC. Jako homogenizatora używamy urządzenia Branson Sonifier 150 przy ustawieniu mocy na 10% mocy maksymalnej (1 z 10). Zaleca się następujące objętości sonikacji:
    u szczura: SN = 250 μl (wycinek jednostronny), 400 μl (wycinek obustronny), VTA = 200 μl (wycinek jednostronny), 400 μl (wycinek obustronny).
    u myszy (tylko wycinki obustronne): SN = 200 μl, VTA = 200 μl.
  2. Po homogenizacji przechowuj próbki na suchym lodzie. Następnie próbki wiruj (DuPont Sorvall Microspin 24S) przy 12 000 RPM, aby osadzić pellet białkowy do późniejszych oznaczeń metodą western blot. Nadosady wstrzykuj bezpośrednio do HPLC. Dla precyzyjnej analizy u szczura lub myszy zaleca się następujące objętości wtrysku: SN = 150 μl (z dowolnego przygotowania), VTA = 160 μl (z dowolnego przygotowania).
  3. Standard zapasowy przygotowuje się w stężeniu 1 mg/ml poprzez dodanie odpowiedniej ilości monoamin i metabolitów* dopaminy do kwasu nadchlorowego 0.1 M i EDTA 0.1 mM. Stężenie każdego związku wynosi 1 mg/ml, z wyjątkiem tryptofanu, którego stężenie wynosi 5 mg/ml. Standard zapasowy dzieli się na aliquoty po 10 μl i przechowuje w zamrażarce ultraniskotemperaturowej do momentu użycia.
    *Wszystkie masy zostały skorygowane o formę solną związku, jeśli dotyczy.
    Standard roboczy przygotuj poprzez rozcieńczenie 10 μl aliquotu standardu zapasowego w 100 ml roztworu kwasu nadchlorowego. Stężenie standardu roboczego wynosi 0.1 μg/ml, z wyjątkiem tryptofanu, który wynosi 0.5 μg/ml. Do HPLC wstrzykuje się 50 μl tego standardu roboczego, co odpowiada ilości na kolumnie wynoszącej 5 ng każdego składnika, z wyjątkiem tryptofanu, którego ilość wynosi 25 ng.
  4. Wyznaczanie odzysku dopaminy w aliquocie próbki:
    Wyznaczenie odzysku dopaminy z aliquotu próbki obejmuje kilka etapów.
  5. Najpierw podziel wysokość piku dopaminy w próbce przez wysokość piku dopaminy w standardzie i pomnóż ten stosunek przez całkowitą ilość (ng) dopaminy w standardzie. Nasze standardowe stężenie dopaminy wynosi 0.1 ng/μL i analizowane jest 50 μL standardu. Zatem ilość dopaminy w standardzie wynosi 5 ng. W związku z tym do wyznaczenia odzysku dopaminy w danej próbce można użyć poniższego równania:
    (wysokość piku dopaminy w próbce/wysokość piku dopaminy w standardzie)*5 ng
  6. Korekcja strat próbki przy użyciu standardu wewnętrznego N-metylodopaminy:
    Rzeczywisty odzysk N-metylodopaminy oblicza się w ten sam sposób co dopaminę, dzieląc wysokość piku N-metylodopaminy w próbce przez wysokość piku N-metylodopaminy w standardzie i mnożąc ten stosunek przez całkowitą ilość (ng) N-metylodopaminy w standardzie. Podobnie jak w przypadku dopaminy, nasze standardowe stężenie N-metylodopaminy wynosi 0.1 ng/μL. Analizowane jest 50 μL standardu, zatem ilość N-metylodopaminy w standardzie wynosi 5 ng. Do wyznaczenia odzysku N-metylodopaminy w danej próbce można użyć poniższego równania:
    (wysokość piku N-metylodopaminy w próbce/wysokość piku N-metylodopaminy w standardzie)*5 ng
    Ponieważ jednak N-metylodopamina w każdej próbce nie pochodzi z samej próbki, lecz z buforu HPLC, oblicza się spodziewaną ilość N-metylodopaminy w każdej próbce. Stężenie N-metylodopaminy w buforze HPLC wynosi 20 ng/mL lub 0.02 ng/μL, zatem spodziewaną ilość N-metylodopaminy w każdej próbce wyznacza się, mnożąc stężenie N-metylodopaminy w buforze HPLC przez objętość aliquotu każdej próbki użytej do analizy HPLC. Jest to przedstawione w poniższym równaniu:
    (0.02 ng/μL)*(objętość aliquotu próbki użytego do analizy HPLC)
  7. Różnica między spodziewaną a odzyskaną ilością N-metylodopaminy może służyć do korekty ilości odzyskanej dopaminy poprzez uwzględnienie wszelkich strat próbki. Należy po prostu obliczyć stosunek spodziewanej ilości N-metylodopaminy do odzyskanej ilości N-metylodopaminy i pomnożyć go przez ilość odzyskanej dopaminy. Ogólne równanie dla ilości dopaminy w aliquocie próbki przedstawiono poniżej:
    (wysokość piku dopaminy w próbce/wysokość piku dopaminy w standardzie)*(wysokość piku N-metylodopaminy w standardzie/wysokość piku N-metylodopaminy w próbce)*(0.02 ng/μL)*(objętość aliquotu próbki użytego do analizy HPLC)
  8. Całkowita ilość dopaminy odzyskana z próbki:
    Wartość dopaminy odzyskanej z aliquotu próbki jest następnie wykorzystywana do ekstrapolacji całkowitej ilości dopaminy w danej próbce. Odbywa się to poprzez podzielenie odzyskanej ilości (ng) DA przez objętość aliquotu i pomnożenie tej wartości przez całkowitą objętość buforu HPLC, w którym sonikowano próbkę. Opisuje to poniższe równanie:
    (ilość (ng) dopaminy w aliquocie próbki/objętość aliquotu próbki)*(Całkowita objętość buforu HPLC, w którym sonikowano próbkę).
    Czytelnika odsyłamy do następujących badań 2,4,10 w celu uzyskania kompleksowej prezentacji oceny dopaminy i jej metabolitów w połączeniu z odczytami białek regulujących poziom dopaminy nie tylko w SN i VTA, ale także w prążkowiu i jądrze półleżącym.

3. Analiza tkanek: całkowita zawartość białka i końcowa normalizacja wyników TH oraz DAT

  1. Umieścić wytrącone granulki białkowe (pozyskane po traktowaniu buforem HPLC) w lodzie, aby utrzymać temperaturę 4 °C. Należy upewnić się, że cały bufor został usunięty i zarchiwizowany (jeśli wymagana jest analiza potwierdzająca). Jeśli SN lub VTA mają być przetwarzane obustronnie (tylko szczur), należy dodać do granulki 300 μL (SN) lub 200 μL (VTA) 1% SDS zawierającego 5 mM Tris (pH 8,3) i 1 mM EDTA, a następnie poddać sonikacji. W przypadku przetwarzania tkanek z wycięć jednostronnych dodać 150 μL roztworu SDS do granulek SN lub 100 μl do granulek VTA.
  2. Próbki umieścić w wodzie o temperaturze bliskiej wrzenia na ok. 5 minut, aby dokończyć denaturację białek, a następnie pozwolić im ostygnąć do temperatury pokojowej. Na tym etapie należy upewnić się, że zakrętki są szczelnie zamknięte.
  3. Oznaczyć stężenie białka w próbkach za pomocą testu BCA, uwzględniając krzywą standardową białka (standard albuminy) w zakresie 2 - 40 μg białka. Analizować objętość 5 μl próbki w trzech powtórzeniach i użyć wartości mediany do określenia ilości białka względem krzywej standardowej. Podzielić tę wartość przez objętość analizowanej próbki, aby otrzymać stężenie białka. Należy pamiętać, że jest to pierwszy z dwóch kroków służących do normalizacji wyników dla całkowitej zawartości TH, DAT i VMAT2 względem całkowitego odzyskanego białka.
  4. Przygotować próbki z użyciem buforu do próbek (zawierającego ditiotreitol) do redukującej elektroforezy SDS na żelach akrylamidowych 10%. Optymalne końcowe całkowite stężenie białka powinno wynosić ok. 2 μg/μl. Wybór takiego stężenia ma na celu zmniejszenie objętości próbki niezbędnej do ostatecznego oznaczenia fosforylacji TH, ponieważ do precyzyjnego ilościowego określenia fosforylacji TH w pozycjach ser31 i ser40 niezbędne będzie nałożenie ok. 100 μg całkowitego białka. Jeśli po dodaniu buforu do próbek pojawi się żółty kolor, oznacza to, że próbka jest zbyt kwasowa. Należy dodać 1 M Tris (pH 8,2) w przyrostach po 10 μl, aż do przywrócenia niebieskiego koloru.
  5. Przygotować próbki w następujący sposób do kolejnych oznaczeń białek regulujących poziom dopaminy:
  6. TH: W stosunku do skalibrowanego standardu białka TH (wyrażonego w ng), stężenie TH (jako ng TH na całkowite μg białka) w SN powinno mieścić się w zakresie ok. 0,05-0,27 ng TH na μg całkowitego białka 2,4,7,10,11. Przy zastosowaniu liniowej krzywej standardowej TH w zakresie 0,5 - 5,0 ng TH oraz przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko TH (Millipore kat# AB152, rozcieńczenie 1:1000 w roztworze blokującym PVP T-20), które daje liniową krzywą standardową, optymalna ilość całkowitego białka z SN powinna wynosić ok. 10 μg. Stężenie TH w VTA mieści się w zakresie od ok. 0,4 do 1,0 ng TH na μg białka 4,11. Zatem całkowita ilość białka dla VTA powinna wynosić ok. 5 μg.
  7. DAT: Względne ilości DAT w SN lub VTA są znacznie mniejsze niż w odpowiadających im obszarach pól terminalnych prążkowia i jądra skorupowego 4. Względna ekspresja DAT po normalizacji do odzyskanego białka TH jest również znacznie niższa w SN i VTA. W związku z tym ilości białka niezbędne do ilościowego oznaczenia białka DAT w SN lub VTA muszą być znacznie większe w porównaniu do ilości próbek z obszarów pól terminalnych. Do precyzyjnej oceny DAT w VTA wymagane jest minimum 30 μg całkowitego białka, a do oceny w SN nominalna ilość to 50 μg całkowitego białka. Wykorzystane przeciwciało pierwszorzędowe to Santa Cruz, kat# sc-1433.
  8. VMAT2: Ekspresja VMAT2, po normalizacji do całkowitego białka, jest większa w obszarach mesoaccumbens niż w obszarach nigrostriatalnych. Jednak w stosunku do ekspresji TH, ekspresja VMAT2 jest największa w SN i najmniejsza w prążkowiu 4. Przy użyciu Santa Cruz kat# sc-15314, nominalna ilość całkowitego białka wynosząca ok. 40 μg jest najlepsza do ilościowego oznaczenia VMAT2.
  9. Przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE odpowiedniej ilości całkowitego białka na żelach akrylamidowych 10%. Do oznaczeń wykorzystywany jest aparat do elektroforezy Bio-Rad Protean II w dużym formacie żelu. Przenieść białka na nitrocelulozę o rozmiarze porów 0,45 μm. Do transferu należy użyć komory Hoeffer ustawionej na co najmniej 27 V, co pozwala na przeprowadzenie transferu w ciągu nocy.
  10. Pozostawić bloty do wyschnięcia przez co najmniej 30 minut, a następnie zabarwić roztworem Ponceau S (1% Ponceau S w 5% lodowatym kwasie octowym) przez ok. 5 minut. Intensywnie odbarwić roztworem 0,2% HCl, aż poszczególne prążki białkowe staną się wyraźne, a tło zostanie usunięte. Wykonać obraz zabarwienia Ponceau S za pomocą programu Image J, aby dalej ilościowo ocenić względne obciążenie białkiem w każdej ścieżce i znormalizować wyniki dla TH, DAT lub VMAT2 (Rysunek 3).

4. Analiza tkanek: Miejscowa fosforylacja TH

Fosforylacja TH w obrębie ser31 lub ser40 może zwiększać biosyntezę L-DOPA w komórkach katecholaminergicznych 12. Chociaż nie ustalono ilości fosforylacji w każdym z tych miejsc, która byłaby niezbędna do zwiększenia biosyntezy L-DOPA w dopaminergicznych obszarach mózgu, takich jak SN i VTA, istnieją dowody na to, że fosforylacja ser31 odgrywa istotną rolę w regulacji biosyntezy L-DOPA 10 i współzmienia się z zawartością DA w tkankach prążkowia, jądra przymózgowia, SN i VTA 2, 10. Niemniej jednak konieczne jest uwzględnienie oznaczeń ser40, ponieważ liczne badania wykazują, że może ono wpływać na aktywność TH, szczególnie po osiągnięciu określonego progu fosforylacji 12.

Choć fosforylacja ser19 sama w sobie nie wpływa na aktywność TH 13,14, można ją uznać za wskaźnik sygnalizacji zależnej od Ca2+ w neuronach DA, biorąc pod uwagę, że pozakomórkowy Ca2+ jest niezbędny do zwiększenia fosforylacji ser19 w warunkach depolaryzacji 12. Ponadto istotna dodatnia korelacja fosforylacji ser19 z fosforylacją ser31 występuje wyłącznie w SN i VTA 10, co wskazuje, że stan fosforylacji ser19 mógłby wpływać na fosforylację ser31, a tym samym pośrednio na biosyntezę L-DOPA.

Rozważania dotyczące ilości próbki dla optymalnego oznaczania stechiometrii fosforylacji TH w konkretnych miejscach: Poniżej przedstawiono rozważania niezbędne do dokładnego i precyzyjnego oznaczania fosforylacji TH w konkretnych miejscach w wypreparowanych tkankach. Jeśli to możliwe, w ocenie fosforylacji TH w próbce należy uwzględnić skalibrowany standard fosforylacji TH. Ilość naniesionej próbki musi uwzględniać naturalną stechiometrię w każdym miejscu fosforylacji, tak aby test oznaczał fosforylację w dynamicznym zakresie pracy użytego przeciwciała. Jako ostatnią uwagę, w ścieżkach krzywej wzorcowej należy również nanieść całkowitą ilość białek endogennych obecnych w analizowanej próbce. Można to łatwo osiągnąć, stosując białko nośne (np. wątrobę szczura), które nie wykazuje ekspresji TH.

  1. ser19. Spośród trzech miejsc fosforylacji, poziomy stechiometrii fosforylacji ser19 są najwyższe w SN i VTA, mieszcząc się w zakresie 0,15 - 0,25 2,10,11. Kolejną kwestią jest fakt, że w zastosowanej przez nas metodzie detekcji ps ser19 jest ilościowany w zakresie liniowym od 0,5 do 5,0 ng phospho-ser19 10. Biorąc pod uwagę te uwarunkowania, całkowite obciążenie białkiem TH w ilości od 5 do 10 ng (co daje szacunkowo 0,75 - 2,5 ng phospho-ser19 w próbce) zapewni wiarygodny pomiar fosforylacji ser19 TH. Stosujemy przeciwciało pierwszorzędowe Phosphosolutions (Cat. #p1580-19) w rozcieńczeniu 1:1000.
  2. ser31. Poziomy stechiometrii fosforylacji ser31 są porównawczo niższe w SN i VTA w zestawieniu z odpowiadającymi im obszarami pól terminalnych, mieszcząc się w zakresie ~0,04 - 0,10 2,4,10,11. W naszej metodzie detekcji ps ser31 jest wykrywany w zakresie liniowym od 0,5 do 7,0 ng phospho-ser31 10. Biorąc pod uwagę te uwarunkowania, całkowite obciążenie białkiem TH w ilości od 10 do 30 ng (co daje szacunkowo 0,50 - 3,0 ng phospho-ser31 w próbce) zapewni wiarygodny pomiar fosforylacji ser31TH. Przykład ilościowego oznaczenia ser31 przedstawiono na Rysunku 4A. Nasze przeciwciało pierwszorzędowe to oczyszczone powinowactwem przeciwciało wewnętrzne, wyprodukowane przez 21st Century Biochemicals (Boston, MA) i zwalidowane pod kątem swoistości do fosfo-epitopu przy użyciu naszych standardów wewnętrznych 2.
  3. ser40. Poziomy stechiometrii fosforylacji ser40 w SN i VTA mieszczą się w zakresie ~0,02 - 0,06 2,4,10,11. W naszej metodzie detekcji ps ser40 jest wykrywany w zakresie liniowym od 0,2 do 2,0 ng phospho-ser40 10. Biorąc pod uwagę te uwarunkowania, całkowite obciążenie białkiem TH w ilości od 10 do 30 ng (co daje szacunkowo 0,20 - 1,8 ng phospho-ser40 w próbce) zapewni wiarygodny pomiar fosforylacji ser40TH. Przykład ilościowego oznaczenia ser40 przedstawiono na rysunku 4B. Stosujemy przeciwciało pierwszorzędowe Phosphosolutions (Cat. #p1580-40) w rozcieńczeniu 1:1000.

5. Reprezentatywne wyniki

  1. Dopamina w SN i VTA. W analizie ilościowej można zastosować trzy wskaźniki poziomu dopaminy (lub jej metabolitów): całkowitą ilość odzyskaną z wyizolowanego fragmentu tkanki, ilość w przeliczeniu na białko oraz ilość w przeliczeniu na białko TH (przykłady dla prążkowia, SN, jądra półleżącego i VTA przedstawiono w Tabeli 1 poniżej). Całkowita odzyskana ilość dopaminy w SN i VTA jest zbliżona i wynosi od 6-9 ng dla dwóch do trzechy izolatów z przekrojów czołowych 2. Normalizacja ilości odzyskanej dopaminy do całkowitego białka wykaże, że w zależności od zastosowanej metody izolacji, VTA będzie charakteryzować się wyższym poziomem dopaminy na całkowite białko, średnio 6-8 ng / mg białka w SN i 9-10 ng / mg białka w VTA 2, 4. Wreszcie, normalizacja ilości dopaminy do całkowitej odzyskanej ilości TH powinna również ujawnić różnicę między SN a VTA, przy czym wartość ta będzie wyższa w VTA 10, oscylując między 0,2 a 0,8 ng dopaminy na ng białka TH w obu regionach 2,10.
    Region DACałkowita odzyskana ilość DADA na mg białkaDA na ng TH
    prążkowie214 ± 16165 ± 130,56 ± 0,11
    SN8,4 ± 0,86,1 ± 0,50,18 ± 0,03
    Jądro półleżące60 ± 675 ± 40,77 ± 0,03
    VTA6,0 ± 1,09,2 ± 1,40,22 ± 0,03
  2. Białka całkowite: TH, DAT, VMAT2 Korzystając z kalibrowanego standardu białka TH do ilościowego oznaczenia, z izolacji w SN odzyskuje się więcej TH niż w VTA (60 ng w SN i 26 ng w VTA 2). Jednak po normalizacji do białka zależność ta ulega odwróceniu i poziom TH na całkowite białko w VTA jest około 3- do 5-krotnie wyższy niż w SN (~0,32 ng / μg białka w VTA i ~0,09 w SN) 4,10.
    Przewidywana ilość odzyskanego DAT w SN i VTA jest podobna, przy czym w VTA odzyskuje się go nieco więcej w przeliczeniu na całkowite białko lub całkowite odzyskane TH 4. Warto zaznaczyć, że białko DAT występuje w tych regionach w znacznie mniejszym stopniu niż w odpowiadających im obszarach pól terminalnych 4.
    Odzysk VMAT2 w przeliczeniu na całkowite białko jest wyższy w VTA niż w SN 4. Jednak po normalizacji do białka TH, w SN odzyskuje się go nieco więcej 4.
  3. Miejscowo swoista fosforylacja TH W licznych badaniach uzyskano spójne wyniki dotyczące ilości fosforylacji ser19, ser31 i ser40 w SN i VTA, a także w relacji do odpowiadających im obszarów pól terminalnych. Fosforylacja ser19 jest wyraźnie wyższa w SN i VTA (~0,2-0,3) w porównaniu do prążkowia i jądra półleżącego (~0,05-0,15) 2,4,7,10,11. Fosforylacja ser31 jest znacznie niższa w SN i VTA w porównaniu do ich odpowiadających pól terminalnych, wynosząc ~0,06 - 0,10 pomiędzy tymi regionami somatodendrytycznymi 2,4,7,10,11. Podczas hamowania aromatycznejydekarboksylazy za pomocą NSD-1015 następuje 2-krotny wzrost fosforylacji ser31 wyłącznie w VTA 10. Fosforylacja ser40 mieści się w zakresie od 0,02 do 0,05 w SN i VTA, a stechiometria ta zazwyczaj nie różni się istotnie od wartości w odpowiadających polach terminalnych 2,4,7,10,11.

Schemat homogenizacji tkanek i analizy HPLC dla oznaczeń białek i metabolitów dopaminy.
Rysunek 1. Odczyty dopaminergiczne z jednej sekcji tkanki.

Schemat przekroju mózgu, badanie anatomiczne, oznaczone struktury, edukacyjny materiał referencyjny z anatomii.
Rycina 2. Technika dysekcji w celu wyizolowania neuropilu dopaminergicznego śródmózgowia. Technika wycinania istoty czarnej (SN) z pola brzusznego nakrywy (VTA). 1. Usuń nadległą korę oraz hipokamp (struktury te zostały już usunięte na powyższym obrazie). 2. Wykonaj pionowe cięcie oddzielające pigmentowany obszar SN od VTA. 3. Wykonaj poziome cięcie w linii środkowej lub w jej pobliżu, tuż nad grzbietową i najbardziej boczną częścią SN. 4. Ostrożnie oddziel SN od reszty pnia mózgu. Po usunięciu SN w podobny sposób oddziel VTA od reszty śródmózgowia. Uwaga: ten przekrój jest zazwyczaj obserwowany w współrzędnych względem Bregmy na poziomie AP 5.7.

Żel do elektroforezy białek, próbki z wątroby szczura i substancji ciemnej, analiza prążków.
Rycina 3. druga (i końcowa) normalizacja całkowitego ładunku białka – barwienie Ponceau S do analizy w programie ImageJ. Barwienie białek Ponceau S dla oznaczenia całkowitego poziomu TH w próbkach z substancji ciemnej szczura. Pierwsze pięć ścieżek od lewej to standardowa krzywa całkowitego TH, do której dodano 28 μg białka z homogenatu wątroby szczura, aby odzwierciedlić ładunek białka z próbek substancji ciemnej. Następna ścieżka zawiera markery masy cząsteczkowej (MW). Pozostałe ścieżki zawierają ~28 μg białka z próbek substancji ciemnej szczura. Ładunki białka oparto na stężeniu białka w każdej próbce, wyznaczonym metodą BCA. Jednak mimo teoretycznie równych ładunków, występują różnice w intensywności barwienia Ponceau S między próbkami, co wskazuje na niewielką zmienność stężeń białek; zostaje ona skorygowana poprzez normalizację z wykorzystaniem analizy ImageJ w celu oceny ilości barwnika Ponceau S dla każdej próbki.

Analiza Western blot, poziomy TH i pTH, obszary mózgu szczura, substantia nigra, pole brzuszne nakrywki.
Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki fosforylacji TH w grupach kontrolnych i traktowanych. Reprezentatywne analizy Western blot dla fosforylowanej tyrozynohydroksylazy w pozycji ser31 (pTH) oraz ser40 pTH u szczurów Wistar traktowanych solą fizjologiczną i metamfetaminą z poprzedniego badania4. A. ser 31 pTH w próbkach z substantia nigra szczura. Skalibrowana krzywa standardowa ser 31 pTH obejmuje zakres od 0,3 ng do 2,0 ng i mieści się w liniowym zakresie detekcji. Na podstawie wcześniejszej analizy Western blot całkowitego poziomu TH, do każdej próbki naniesiono 6 ng całkowitego TH. B. ser40 pTH w próbkach z pola brzusznego nakrywki szczura. Skalibrowana krzywa standardowa ser40 pTH obejmuje zakres od 0,2 ng do 1,5 ng i mieści się w liniowym zakresie detekcji. Na podstawie wcześniejszej analizy Western blot całkowitego poziomu TH, do każdej próbki naniesiono 9 ng całkowitego TH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak przedstawiono na Rysunku 1, opisane powyżej metody powinny pozwolić na uzyskanie wielu pomiarów dopaminy oraz regulujących ją białek TH, DAT i VMAT2 z jednej próbki SN lub VTA pobranej od szczura lub myszy. Ponownie podkreśla się, że korzyścią z zastosowania tego protokołu jest możliwość uzyskania przez badacza operacyjnie dopasowanych wyników dotyczących regulacji dopaminy in vivo w niemal każdym paradygmacie eksperymentalnym, co pozwala na znaczną oszczędność zasobów eksperymentalnych poprzez zmniejszenie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Finansowanie niniejszej pracy, zgodnie z cytowaniami 2,10, zostało zapewnione częściowo z grantów badawczych przyznanych MF Salvatore przez American Federation for Aging Research, The Edward P. Stiles Trust Fund oraz Biomedical Research Foundation of Northwest Louisiana, a także BS Pruett z funduszy Ike Muslow Predoctoral Fellowship w LSU Health Sciences Center-Shreveport.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

System HPLC:

Podstawowy system składa się z pompy HPLC Shimadzu LC10-ADvp, automatycznego injektora próbek Waters WISP 717 oraz kolumny Spherosorb ODS- o wymiarach 250 x 4,4 mm i wielkości cząstek 5 mikronów.1 kolumny C18 w odwróconej fazie (Waters), podwójnej elektrody z węgla szklistego Bioanalytical Systems (BAS) TL12, dwóch detektorów elektrochemicznych BAS LC4B oraz systemu zbierania i integracji danych Waters Empower 2.

Kolumnę utrzymuje się w temperaturze 30–45°C °C (podgrzewacz kolumny BAS LC22A). Faza ruchoma składa się z 0,1 M fosforanu sodu (pH 3,0), 0,1 mM EDTA, 0,2–0,4 mM kwasu 1-oktanosulfonowego (Eastman-Kodak) oraz 0,35% acetonitrylu (v/v), przefiltrowanych przez filtr o porach 0,45 mikrona. Szybkość przepływu wynosi 1,2 ml/min. Czterolitrowe partie fazy ruchomej są optymalizowane pod kątem rozdziałów poprzez regulację pH, stężenia kwasu oktanosulfonowego oraz temperatury kolumny. Faza ruchoma jest recyrkulowana i stale przepłukiwana helem w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu. Recyrkulacja fazy ruchomej jest niemal niezbędna do utrzymania dobrej rozdzielczości przez odpowiednio długi czas. Trwałość fazy ruchomej jest zapewniona dzięki zastosowaniu przełącznika przepływu (sterowanego przez integrator), który przekierowuje pierwsze 2–7 min każdego pomiaru do odpadu.

Elektrody utrzymuje się na potencjałach wynoszących około 0,78 V i 0,95 V względem elektrody odniesienia Ag/AgCl. Elektrodę o wyższym potencjale wykorzystuje się wyłącznie do oznaczania tryptofanu (oraz wewnętrznego standardu NMDA). Potencjał 0,78 V zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu podczas detekcji monoamin i związków innych niż tryptofan. Chromatogramy są zapisywane na dysku twardym stacji roboczej Empower, a następnie przetwarzane, po czym dane są przenoszone bezpośrednio do arkusza Excel w celu obliczenia ilości metabolitów i zestawienia danych grupowych.

Pompa: Shimadzu LC-10AD
Ogniwo: BAS Cross Flow. Elektroda robocza z węgla szklistego przy potencjale 0,780 i 0,950 V.
Detektor: BAS LC-4B pracujący w trybie dwukanałowym.
System akwizycji danych: Waters Empower Pro 2.
Iniektor: Waters WISP 717
Kolumna: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μCząstka M, 4,4 mm x 250 mm.

siarczan dodecylu sodu (SDS)J.T. Baker4095-02
Trizma bazaSigmaT1503-1KG
Trizma HCl SigmaT3253-1KG
GlicerolSigmaG8773-500 ml
PVP-40SigmaPVP40-1KG
dPBS Gibco21600-069
Tween20 SigmaP1379-500 ml
Glicyna SigmaG8898-1KG
Ponceau S Fluka81460
błękit bromofenolowy SigmaB8026-5G
Ditiotreitol SigmaD-9163
Standard białkowy 2 mg BSASigmaP5619-25VL
Odczynnik A do oznaczania białek metodą BCA firmy PierceThermo-Fisher Scientific23223
Standard białka Precision PlusBio Rad161-0373
[125I]-białko A, aktywność właściwaPerkin-Elmer

Tabela 2. Odczynniki specyficzne.

10% SDS10 g SDS, 100 mL wody dejonizowanej (DI H2O)20
1% SDS (pH do 8,2)10 ml 10% SDS, 60,5 mg Trizma Base, 37,22 mg EDTA, 90 ml wody dejonizowanej (DI H2O)20
Roztwór siarczanu(II) miedzi 1 g siarczanu(VI) miedzi(II), 25 ml wody dejonizowanej20
Bufor do próbek 3X Trizma Base 2,27 g SDS 6 g Ditiotreitol 0,463 g Glicerol 30 g Błękit bromofenolowy 10 mg H2O (woda destylowana)20 (początkowo dodać powyższe odczynniki do 40 ml H20 w cylindrze miarowym; następnie dodać H20 aż do osiągnięcia objętości 100 ml) HCl (dodawać w ilości niezbędnej do osiągnięcia pH 6,85) Zamrozić roztwór w probówkach o pojemności 2,0 ml. (przygotowuje 100 ml): Wymagana objętość 3X Sample Buffer = ½ objętość SDS zastosowana w próbce.
Bufor do próbek 1XRozcieńczyć 3X bufor do próbek do stężenia 1X, używając wody dejonizowanej (DI H2O)20
Bufor do elektroforezy 10X (do przygotowania 4 l)Trizma (zasada) 121,1 g Glicyna 577 g SDS 40 g
Bufor transferowy 10X: (na 4 L)Glicyna 360 g Trizma Base 96 g
PonceauPonceau S, 0,5 g kwas octowy, 5 ml wody dejonizowanej20,95 ml
0,2% roztwór HCl5,2 ml HCl w 500 ml wody dejonizowanej (DI H2O)20
Roztwór blokujący PVP-T20 (do przygotowania 4 l)PVP-40 40 g dPBS 38,2 g Tween20 2 g Tio Mersol 0,4 g 1M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g Tris Base w 500 ml wody DI)20)- 50 ml
Bufor do Western blot 10X (na 4 L)Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Tabela 3. Wzory do oznaczania białka i analizy Western blotting.

Standardy tyrozynohydroksylazy: Skalibrowane standardy białka TH oraz jego fosforylacji stosowane w tym laboratorium pochodzą z ekstraktów komórek PC12, w których przeanalizowano zawartość białka TH oraz stechiometrię fosforylacji w odniesieniu do wcześniej skalibrowanych standardów TH, które pierwotnie pochodziły z laboratorium dr. Johna Haycocka. 11.

Bibliografia

  1. Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
  2. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466(2009).
  3. Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
  4. Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
  5. Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
  6. Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
  7. Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
  8. Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
  9. Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
  10. Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867(2012).
  11. Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
  12. Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
  13. Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
  14. Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekcja tkanekanaliza HPLCWestern blothydroksylaza tyrozynowatransporter dopaminypęcherzykowy transporter monoaminfosforylacja białek
Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.