Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Podsumowanie

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Streszczenie

Dopamina jest intensywnie badanym neuroprzekaźnikiem w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W istocie, jej zaangażowanie w aktywność lokomotoryczną i zachowania związane z nagrodą stymulowało przez pięć dekad badania nad deficytami molekularnymi związanymi z regulacją dopaminy. Większość tych analiz dotyczących regulacji dopaminy w mózgu koncentruje się na molekularnych podstawach jej regulacji w obszarach pól terminalnych szlaków nigrostriatalnego i mezoakumbensowego: prążkowiu oraz jądrze półleżącym. Ponadto badania te skupiały się na analizie zawartości dopaminy w tkance z normalizacją wyłącznie do masy mokrej tkanki. Badania białek regulujących dopaminę, takich jak białko hydroksylaza tyrozynowa (TH), fosforylacja TH, transporter dopaminy (DAT) oraz białko pęcherzykowego transportera monoamin 2 (VMAT2), często nie obejmują analizy zawartości dopaminy w tej samej próbce. Możliwość analizy zarówno zawartości dopaminy w tkance, jak i białek ją regulujących (w tym modyfikacji potranslacyjnych) nie tylko zwiększa potencjał interpretacji zależności dopaminy od poziomu białek i funkcji TH, DAT lub VMAT2, ale także poprawia ekonomię wykorzystania próbek. Przekłada się to na niższe koszty, a jednocześnie dostarcza wiedzy na temat molekularnej regulacji dopaminy w praktycznie każdym paradygmacie wybranym przez badaczy.

Analizy koncentrujemy na śródmózgowiu. Chociaż SN i VTA są zazwyczaj pomijane w większości badań nad regulacją dopaminy, jądra te można z łatwością wypreparować wraz z praktyką. Możliwe jest przeprowadzenie kompleksowego pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz poziomu TH, DAT lub VMAT2. Coraz więcej publikacji wskazuje na wpływ funkcji dopaminergicznej w SN i VTA na zachowanie oraz oddziaływanie substancji egzogennych lub procesów chorobowych w tych obszarach ^1-5. Ponadto związki takie jak czynniki wzrostu wywierają głęboki wpływ na dopaminę i białka regulujące jej poziom, w stosunkowo większym stopniu w SN lub VTA ^6-8. Dlatego niniejsza metodologia została przedstawiona jako punkt odniesienia dla laboratoriów, które chcą rozszerzyć swoje badania nad tym, jak konkretne zabiegi modulują zachowanie i regulację dopaminy. Przedstawiono tutaj wieloetapową metodę analizy zawartości dopaminy w tkance, poziomów białek TH, DAT lub VMAT2 oraz fosforylacji TH w istocie czarnej i VTA ze śródmózgowia gryzoni. Analiza fosforylacji TH może dostarczyć istotnych informacji nie tylko na temat regulacji aktywności TH, ale także kaskad sygnalizacyjnych, na które oddziałują jądra somatodendrytyczne w danym paradygmacie.

Przedstawimy technikę sekcji służącą do oddzielenia tych dwóch jąder oraz sposób przetwarzania próbek wyseczonej tkanki, który pozwala na uzyskanie profilu ujawniającego mechanizmy molekularne regulacji dopaminy in vivo, specyficzne dla każdego jądra (Rycina 1).

Protokół

1. Disekcja

1. Na podkładzie z kruszonego lodu schłodzić matrycę do mózgu gryzonia (przekroje czołowe oddzielone co 1 mm), szalkę Petriego zawierającą 5 żylet i skalpel z ostrzem nr 11. W osobnym pojemniku umieścić oznakowane probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml w suchym lodzie.
2. Badacz wybiera metodę eutanazji. Powtarzalne wyniki uzyskiwaliśmy, przeprowadzając bardzo krótką narkozę izofluranem. Idealnie byłoby użyć waporyzatora. Jeśli jednak nie jest on dostępny, stosujemy duży słoik z platformą. Umieszczając słoik w zatwierdzonym dygestorium, należy położyć nasączony izofluranem gazik pod platformą i odczekać 3-5 minut, aby izofluran nasycił wnętrze słoika. Umieścić szczura w środku i wyjąć go do dekapitacji natychmiast po utracie przytomności. Szybko wyizolować mózg (idealnie w czasie poniżej dwóch minut), opłukać pod zimną wodą i natychmiast umieścić w schłodzonej matrycy do mózgu gryzonia.
3. Minutę po umieszczeniu mózgu w matrycy, wsunąć zimne żyletki do schłodzonego mózgu, zaczynając około 2 mm rostralnie od skrzyżowania wzrokowego, jeśli oprócz jąder śródmózgowia do analizy wymagane jest prążkowie oraz jądro półleżące. Kontynuować wsuwanie zimnych żyletek przy każdym przekroju 1 mm, aż do osiągnięcia połowy mostu, przesuwając miejsce osadzenia każdej kolejnej żyletki, aby ułatwić późniejsze wyjmowanie poszczególnych ostrzy.
4. Podczas wyjmowania żyletek należy zlokalizować początek hipokampa. Gdy całkowicie otoczy on śródmózgowie, rozpocząć pobieranie przekrojów za pomocą ostrza skalpela nr 11, zgodnie z ilustracją na Rysunku 2.
5. Wyizolowaną tkankę natychmiast umieścić w schłodzonej probówce do mikrowirówki na suchym lodzie. W przypadku szczura należy spodziewać się możliwości wyizolowania SN i VTA z minimum dwóch i maksimum trzech przekrojów czołowych. Przechowywać tkanki w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia obróbki.

2. Analiza tkanek: HPLC w oznaczaniu dopaminy i jej metabolitów

Aby uzyskać pełne informacje na temat sprzętu HPLC oraz jego konserwacji, należy odnieść się do sekcji Analiza HPLC na końcu manuskryptu.

1. Delikatnie homogenizować tkankę bezpośrednio po wyjęciu z suchego lodu, używając lodowatego roztworu 0.1 M HClO₄-EDTA (0.1 M HClO₄ & 0.1 mM EDTA) ⁹, który zawiera N-metylodopaminę w stężeniu 20 ng/mL służącą jako standard wewnętrzny do oznaczenia odzysku próbki podczas analizy HPLC. Stosowany homogenizator to Branson Sonifier 150, z ustawieniem mocy na poziomie 10% mocy maksymalnej (1 z 10). Zalecane objętości do sonikacji są następujące:
   U szczura: SN = 250 μl (wycięcie jednostronne), 400 μl (wycięcie obustronne), VTA = 200 μl (wycięcie jednostronne), 400 μl (wycięcie obustronne).
   U myszy (tylko wycięcia obustronne): SN = 200 μl, VTA = 200 μl.
2. Po homogenizacji przechowywać próbki na suchym lodzie. Następnie próbki wirować (DuPont Sorvall Microspin 24S) z prędkością 12 000 RPM w celu osadzenia pelletu białkowego do późniejszych oznaczeń metodą western blot. Nadosady wstrzykiwać bezpośrednio do układu HPLC. Dla precyzyjnej analizy u szczura lub myszy zaleca się następujące objętości wtrysku: SN = 150 μl (z dowolnego przygotowania), VTA = 160 μl (z dowolnego przygotowania).
3. Roztwór wzorcowy (stock) przygotowuje się w stężeniu 1 mg/ml poprzez dodanie odpowiedniej ilości monoamin i metabolitów* dopaminy do 0.1 M kwasu nadchlorowego z 0.1 mM EDTA. Stężenie każdego związku wynosi 1 mg/ml, z wyjątkiem tryptofanu, którego stężenie wynosi 5 mg/ml. Roztwór wzorcowy dzieli się na alikwoty po 10 μl i przechowuje w zamrażarce ultraniskotemperaturowej do momentu użycia.
   *Wszystkie masy są skorygowane o formę solną związku, jeśli jest to dotyczy.
   Roztwór roboczy przygotować poprzez rozcieńczenie 10 μl alikwoty roztworu wzorcowego do 100 ml roztworu kwasu nadchlorowego. Stężenie roztworu roboczego wynosi 0.1 μg/ml, z wyjątkiem tryptofanu, którego stężenie wynosi 0.5 μg/ml. 50 μl tego roztworu roboczego wstrzykuje się do HPLC, co daje ilość na kolumnie wynoszącą 5 ng każdego składnika, z wyjątkiem tryptofanu, którego ilość wynosi 25 ng.
4. Oznaczanie odzysku dopaminy w alikwocie próbki:
   Oznaczenie odzysku dopaminy z alikwoty próbki składa się z kilku etapów.
5. Najpierw podzielić wysokość piku dopaminy w próbce przez wysokość piku dopaminy w standardzie i pomnożyć otrzymany stosunek przez całkowitą ilość (ng) dopaminy w standardzie. Stosowane stężenie standardu dopaminy wynosi 0.1 ng/μL, a analizowane jest 50 μL standardu. Zatem ilość dopaminy w standardzie wynosi 5 ng. W związku z tym do określenia odzysku dopaminy w danej próbce można użyć poniższego równania:
   (wysokość piku dopaminy w próbce/wysokość piku dopaminy w standardzie)*5 ng
6. Korekta ubytku próbki przy użyciu standardu wewnętrznego N-metylodopaminy:
   Rzeczywisty odzysk N-metylodopaminy oblicza się w ten sam sposób jak w przypadku dopaminy, dzieląc wysokość piku N-metylodopaminy w próbce przez wysokość piku N-metylodopaminy w standardzie i mnożąc ten stosunek przez całkowitą ilość (ng) N-metylodopaminy w standardzie. Podobnie jak w przypadku dopaminy, stężenie standardu N-metylodopaminy wynosi 0.1 ng/μL. Analizowane jest 50 μL standardu. Zatem ilość N-metylodopaminy w standardzie wynosi 5 ng. W związku z tym do określenia odzysku N-metylodopaminy w danej próbce można użyć poniższego równania:
   (wysokość piku N-metylodopaminy w próbce/wysokość piku N-metylodopaminy w standardzie)*5 ng
   Jednakże, ponieważ N-metylodopamina w każdej próbce nie pochodzi z samej próbki, lecz z buforu HPLC, należy obliczyć oczekiwaną ilość N-metylodopaminy w każdej próbce. Stężenie N-metylodopaminy w buforze HPLC wynosi 20 ng/mL lub 0.02 ng/μL, zatem oczekiwaną ilość N-metylodopaminy w każdej próbce wyznacza się, mnożąc stężenie N-metylodopaminy w buforze HPLC przez objętość alikwoty każdej próbki użytej do analizy HPLC. Jest to przedstawione w poniższym równaniu:
   (0.02 ng/μL)*(objętość alikwoty próbki użytej do analizy HPLC)
7. Różnicę między oczekiwaną a odzyskaną ilością N-metylodopaminy można następnie wykorzystać do skorygowania ilości odzyskanej dopaminy poprzez uwzględnienie ewentualnych strat próbki. Należy obliczyć stosunek oczekiwanej ilości N-metylodopaminy do odzyskanej ilości N-metylodopaminy i pomnożyć go przez ilość odzyskanej dopaminy. Zatem ogólne równanie dla ilości dopaminy w alikwocie próbki przedstawia się następująco:
   (wysokość piku dopaminy w próbce/wysokość piku dopaminy w standardzie)*(wysokość piku N-metylodopaminy w standardzie/wysokość piku N-metylodopaminy w próbce)* (0.02 ng/μL)*(objętość alikwoty próbki użytej do analizy HPLC)
8. Całkowita ilość odzyskanej dopaminy z próbki:
   Wartość dopaminy odzyskanej z alikwoty próbki jest następnie wykorzystywana do ekstrapolacji całkowitej ilości dopaminy w danej próbce. Odbywa się to poprzez podzielenie odzyskanej ilości (ng) DA przez objętość alikwoty i pomnożenie tej wartości przez całkowitą objętość buforu HPLC, w którym sonikowano próbkę. Określa to poniższe równanie:
   (ilość (ng) dopaminy w alikwocie próbki/objętość alikwoty próbki)*(całkowita objętość buforu HPLC, w którym sonikowano próbkę).
   Czytelnika odsyłamy do następujących badań ^2,4,10 w celu zapoznania się z kompleksową prezentacją oceny dopaminy i jej metabolitów w połączeniu z odczytami z białek regulujących poziom dopaminy nie tylko w SN i VTA, ale również w prążkowiu i jądrze półleżącym.

3. Analiza tkanki: całkowita zawartość białka i końcowa normalizacja wyników TH i DAT

1. Osady wytrąconego białka (uzyskane po traktowaniu buforem HPLC) umieść w lodzie, aby utrzymać temperaturę 4 °C. Upewnij się, że cały bufor został usunięty i zarchiwizowany (jeśli wymagana jest analiza potwierdzająca). Jeśli SN lub VTA mają być przetwarzane obustronnie (tylko szczury), dodaj do osadu 300 μL (SN) lub 200 μL (VTA) 1% SDS zawierającego 5 mM Tris (pH 8.3) i 1 mM EDTA, a następnie poddaj sonikacji. W przypadku przetwarzania tkanek z sekcji jednostronnych dodaj 150 μL roztworu SDS do osadów SN lub 100 μl do osadów VTA.
2. Próbki umieść w wodzie o temperaturze bliskiej wrzenia na ok. 5 minut, aby dokończyć denaturację białek, a następnie pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Na tym etapie upewnij się, że nakrętki są szczelnie zamknięte.
3. Oznacz stężenie białka w próbkach za pomocą testu BCA, stosując krzywą wzorcową białka (standard albuminy) w zakresie 2 - 40 μg białka. Próbkę o objętości 5 μl oznacz w trzech powtórzeniach i wykorzystaj wartość medianową do określenia ilości białka na podstawie krzywej wzorcowej. Podziel wynik przez objętość analizowaną, aby otrzymać stężenie białka. Należy pamiętać, że jest to pierwszy z dwóch kroków służących normalizacji wyników dla całkowitej zawartości TH, DAT i VMAT2 względem całkowitej odzyskanej ilości białka.
4. Przygotuj próbki z użyciem buforu do próbek (zawierającego ditiotreitol) do redukującej elektroforezy SDS na żelach z 10% akryloamidu. Idealnie końcowe całkowite stężenie białka powinno wynosić ~2 μg/μl. Wybór takiego stężenia ma na celu zmniejszenie objętości próbki niezbędnej do ostatecznego oznaczenia fosforylacji TH, ponieważ do precyzyjnego ilościowego określenia fosforylacji TH w ser31 i ser40 konieczne będzie nałożenie ~100 μg całkowitego białka. Jeśli po dodaniu buforu do próbek pojawi się żółty kolor, oznacza to, że próbka jest zbyt kwasowa. Dodawaj 1 M Tris (pH 8.2) w przyrostach 10 μl, aż do przywrócenia niebieskiego koloru.
5. Przygotuj próbki w następujący sposób do późniejszych oznaczeń białek regulujących dopaminę:
6. TH: W odniesieniu do skalibrowanego wzorca białka TH (wyrażonego w ng), oczekuje się, że stężenie TH (jako ng TH na całkowite μg białka) w SN będzie mieścić się w zakresie ~0.05-0.27 ng TH na μg całkowitego białka ^2,4,7,10,11. Przy liniowej krzywej wzorcowej TH w zakresie 0.5 - 5.0 ng TH i zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko TH (Millipore kat# AB152, rozcieńczenie 1:1000 w roztworze blokującym PVP T-20), która generuje liniową krzywą wzorcową, optymalna ilość nałożonego całkowitego białka z SN powinna wynosić ~10 μg. Stężenie TH w VTA mieści się w zakresie od ~0.4 do 1.0 ng TH na μg białka ^4,11. Zatem całkowita ilość białka nałożona dla VTA powinna wynosić ~5 μg.
7. DAT: Względne ilości DAT w SN lub VTA są znacznie mniejsze niż w odpowiadających im polach terminalnych prążkowia i jądra półleżącego ⁴. Względna ekspresja DAT znormalizowana do odzyskanego białka TH jest również znacznie niższa w SN i VTA. W związku z tym ilości białka niezbędne do ilościowego oznaczenia DAT w SN lub VTA muszą być znacznie większe w porównaniu do ilości próbek z pól terminalnych. Do precyzyjnej oceny DAT w VTA wymagane jest minimum 30 μg całkowitego białka, a do oceny w SN nominalna ilość 50 μg całkowitego białka. Stosowane przeciwciało pierwszorzędowe to Santa Cruz, kat# sc-1433.
8. VMAT2: Ekspresja VMAT2 znormalizowana do całkowitego białka jest większa w obszarach mezoakumbensowych niż w nigrostriatalnych. Jednak w stosunku do ekspresji TH, ekspresja VMAT2 jest największa w SN, a najmniejsza w prążkowiu ⁴. Przy użyciu Santa Cruz kat# sc-15314, nominalna ilość całkowitego białka ~40 μg jest najlepsza do ilościowego oznaczenia VMAT2.
9. Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE odpowiedniej ilości całkowitego białka na żelach z 10% akryloamidu. Do oznaczeń stosowany jest aparat elektroforetyczny Bio-Rad Protean II, który obsługuje duży format żelu. Przenieś białka na nitrocelulozę o rozmiarze porów 0.45 μm. Do transferu użyj kuwety Hoeffera ustawionej na co najmniej 27 V, co pozwala na przeprowadzenie transferu przez noc.
10. Pozostaw bloty do wyschnięcia przez co najmniej 30 minut, a następnie zabarw roztworem Ponceau S (1% Ponceau S w 5% lodowatym kwasie octowym) przez ~5 minut. Intensywnie odbarwiaj roztworem 0.2% HCl, aż poszczególne prążki białkowe staną się wyraźne, a tło zostanie usunięte. Uzyskaj obraz barwienia Ponceau S za pomocą programu Image J, aby dalej ilościowo określić względne obciążenia białkiem w każdej ścieżce i znormalizować wyniki dla TH, DAT lub VMAT2 (Rysunek 3).

4. Analiza tkanek: Specyficzna dla miejsca fosforylacja TH

Fosforylacja TH w pozycji ser31 lub ser40 może zwiększyć biosyntezę L-DOPA w komórkach katecholaminergicznych ¹². Chociaż nie ustalono, jaka ilość fosforylacji w każdym z tych miejsc jest niezbędna do zwiększenia biosyntezy L-DOPA w dopaminergicznych obszarach mózgu, takich jak SN i VTA, istnieją dowody na to, że fosforylacja ser31 odgrywa istotną rolę w regulacji biosyntezy L-DOPA ¹⁰ i współzmienia się z zawartością DA w tkankach prążkowia, jądra półleżącego, SN i VTA ^{2, 10}. Niemniej jednak, niezbędne jest uwzględnienie oznaczeń ser40, ponieważ liczne badania wykazują, że może ono wpływać na aktywność TH, szczególnie po osiągnięciu określonego progu fosforylacji ¹².

Choć fosforylacja ser19 sama w sobie nie wpływa na aktywność TH ^13,14, można ją uznać za wskaźnik sygnalizacji zależnej od Ca²⁺ w neuronach DA, biorąc pod uwagę, że zewnątrzkomórkowy Ca²⁺ jest niezbędny do zwiększenia fosforylacji ser19 w warunkach depolaryzacji ¹². Co więcej, istotna dodatnia korelacja fosforylacji ser19 z fosforylacją ser31 występuje wyłącznie w SN i VTA ¹⁰, co wskazuje, że stan fosforylacji ser19 może wpływać na fosforylację ser31, a tym samym pośrednio na biosyntezę L-DOPA.

Kwestie dotyczące ilości naniesionej próbki dla optymalnego oznaczania stechiometrii fosforylacji TH w konkretnych miejscach: Poniżej przedstawiono rozważania niezbędne do dokładnego i precyzyjnego określenia fosforylacji TH w konkretnych miejscach w wyizolowanych tkankach. Jeśli to możliwe, w ocenie fosforylacji TH w próbkach należy uwzględnić skalibrowany standard fosforylacji TH. Ilość naniesionej próbki musi uwzględniać wrodzoną stechiometrię w każdym miejscu fosforylacji, aby test pozwalał na ilościowe oznaczenie fosforylacji w dynamicznym zakresie roboczym stosowanego przeciwciała. Jako ostatnią uwagę, w ścieżkach krzywej wzorcowej należy również nanieść całkowitą ilość białka obecną w każdej próbce analizowanej w teście. Można to łatwo osiągnąć za pomocą białka nośnikowego (np. z wątroby szczura), które nie wykazuje ekspresji TH.

1. ser19. Spośród trzech miejsc fosforylacji, poziomy stechiometrii fosforylacji ser19 są najwyższe w SN i VTA, mieszcząc się w zakresie 0.15 - 0.25 ^2,10,11. Kolejną kwestią jest to, że w zastosowanej przez nas metodzie detekcji, ps ser19 jest ilościowo określany w zakresie liniowym między 0.5 a 5.0 ng phospho-ser19 ¹⁰. Biorąc pod uwagę te aspekty, całkowite obciążenie białkiem TH w zakresie od 5 do 10 ng (co daje szacunkowo 0.75 - 2.5 ng phospho-ser19 z próbki) zapewni wiarygodny pomiar fosforylacji TH w pozycji ser19. Stosujemy przeciwciało pierwszorzędowe Phosphosolutions (Kat. #p1580-19) w rozcieńczeniu 1:1000.
2. ser31. Poziomy stechiometrii fosforylacji ser31 są stosunkowo niższe w SN i VTA w porównaniu do odpowiadających im obszarów pól terminalnych, mieszcząc się w zakresie ~0.04 - 0.10 ^2,4,10,11. W zastosowanej przez nas metodzie detekcji, ps ser31 jest wykrywany w zakresie liniowym między 0.5 a 7.0 ng phospho-ser31 ¹⁰. Biorąc pod uwagę te aspekty, całkowite obciążenie białkiem TH w zakresie od 10 do 30 ng (co daje szacunkowo 0.50 - 3.0 ng phospho-ser31 z próbki) zapewni wiarygodny pomiar fosforylacji ser31TH. Przykład kwantyfikacji ser31 przedstawiono na Rysunku 4A. Nasze przeciwciało pierwszorzędowe to oczyszczone powinowactwem przeciwciało wewnętrzne, wyprodukowane przez 21^st Century Biochemicals (Boston, MA) i zwalidowane pod kątem specyficzności względem fosfo-epitopu przy użyciu naszych standardów wewnętrznych ².
3. ser40. Poziomy stechiometrii fosforylacji ser40 w SN i VTA mieszczą się w zakresie ~0.02 - 0.06 ^2,4,10,11. W zastosowanej przez nas metodzie detekcji, ps ser40 jest wykrywany w zakresie liniowym między 0.2 a 2.0 ng phospho-ser40 ¹⁰. Biorąc pod uwagę te aspekty, całkowite obciążenie białkiem TH w zakresie od 10 do 30 ng (co daje szacunkowo 0.20 - 1.8 ng phospho-ser40 z próbki) zapewni wiarygodny pomiar fosforylacji ser40TH. Przykład kwantyfikacji ser40 przedstawiono na rysunku 4B. Stosujemy przeciwciało pierwszorzędowe Phosphosolutions (Kat. #p1580-40) w rozcieńczeniu 1:1000.

5. Reprezentatywne wyniki

1. Dopamina w SN a VTA. W analizie ilościowej można zastosować trzy parametry pomiarowe dla dopaminy (lub jej metabolitów): ilość całkowitą odzyskaną z preparatu, ilość w przeliczeniu na białko całkowite oraz ilość w przeliczeniu na białko TH (przedstawiono dla prążkowia, SN, jądra półleżącego i VTA w poniższej Tabeli 1). Całkowity odzysk dopaminy w SN i VTA jest zbliżony i wynosi od 6-9 ng dla dwóch do trzech przekrojów koronalnych ². Normalizacja odzysku dopaminy do całkowitej zawartości białka wykaże, że w zależności od zastosowanej metody preparatyki, w VTA zawartość dopaminy w przeliczeniu na białko całkowite będzie większa, wynosząc średnio 6-8 ng / mg białka w SN oraz 9-10 ng / mg białka w VTA ^{2, 4}. Wreszcie, normalizacja dopaminy do całkowitej ilości odzyskanego TH powinna również ujawnić różnicę między SN a VTA, będąc większą w VTA ¹⁰, i mieszcząc się w zakresie od 0,2 do 0,8 ng dopaminy na ng białka TH w obu regionach ^2,10.

   Region DA	Całkowity odzysk DA	DA na mg białka	DA na ng TH
   prążkowie	214 ± 16	165 ± 13	0.56 ± 0.11
   SN	8.4 ± 0.8	6.1 ± 0.5	0.18 ± 0.03
   Jądro półleżące	60 ± 6	75 ± 4	0.77 ± 0.03
   VTA	6.0 ± 1.0	9.2 ± 1.4	0.22 ± 0.03

2. Białka całkowite: TH, DAT, VMAT2 Przy zastosowaniu skalibrowanego standardu białka TH do kwantyfikacji, z preparatu odzyskuje się więcej TH w SN niż w VTA (60 ng w SN i 26 ng w VTA ²). Jednak po normalizacji do białka całkowitego zależność ta ulega odwróceniu, a zawartość TH w przeliczeniu na białko całkowite w VTA jest od ~3 do 5 razy większa niż w SN (~0,32 ng / μg białka w VTA i ~0,09 w SN) ^4,10.
   Przewidywany odzysk DAT w SN i VTA jest podobny, z nieco większym odzyskiem w VTA w przeliczeniu na białko całkowite lub całkowity odzysk TH ⁴. Warto zauważyć, że białko DAT występuje w tych regionach w znacznie mniejszej ilości w porównaniu do odpowiadających im obszarów pól terminalnych ⁴.
   Odzysk VMAT2 w przeliczeniu na białko całkowite jest większy w VTA niż w SN ⁴. Jednak po normalizacji do białka TH, odzysk w SN jest nieco większy ⁴.
3. Specyficzna dla miejsca fosforylacja TH Z szeregu badań wynikają spójne rezultaty dotyczące ilości fosforylacji w pozycjach ser19, ser31 i ser40 w SN i VTA, a także w odniesieniu do odpowiadających im obszarów pól terminalnych. Fosforylacja ser19 jest wyraźnie większa w SN i VTA (~0,2-0,3) w porównaniu do prążkowia i jądra półleżącego (~0,05-0,15) ^2,4,7,10,11. Fosforylacja ser31 jest znacząco niższa w SN i VTA w porównaniu do ich odpowiadających pól terminalnych, wynosząc ~0,06 - 0,10 w tych regionach somatodendrytycznych ^2,4,7,10,11. Podczas hamowania aromatycznejdekarboksylazy kwasów za pomocą NSD-1015 następuje 2-krotny wzrost fosforylacji ser31 wyłącznie w VTA ¹⁰. Fosforylacja ser40 mieści się w zakresie od 0,02 do 0,05 w SN i VTA i zazwyczaj stechiometria ta nie różni się znacząco od wartości w odpowiadających im obszarach pól terminalnych ^2,4,7,10,11.

Rycina 1. Odczyty dopaminergiczne z jednej sekcji tkanki.

Rycina 2. Technika dyssekcji w celu izolacji neuropilu dopaminergicznego śródmózgowia. Technika oddzielania istoty czarnej (SN) od pola brzusznego nakrywki (VTA). 1. Usunąć nadległą korę oraz hipokamp (struktury te zostały już usunięte na powyższym obrazie). 2. Wykonać cięcie pionowe oddzielające pigmentowany obszar SN od VTA. 3. Wykonać cięcie poziome na linii środkowej lub w jej pobliżu, tuż powyżej najbardziej grzbietowej i bocznej części SN. 4. Ostrożnie oddzielić SN od reszty pnia mózgu. Po usunięciu SN, w podobny sposób oddzielić VTA od pozostałej części śródmózgowia. Uwaga: ten przekrój obserwuje się zazwyczaj w układzie współrzędnych względem Bregma, przy AP 5.7.

Rycina 3. druga (i końcowa) normalizacja całkowitego ładunku białka – barwienie Ponceau S do analizy w programie ImageJ. Barwienie białek Ponceau S podczas oznaczania całkowitej ilości TH w próbkach istoty czarnej szczura. Pierwsze pięć ścieżek od lewej stanowi krzywa wzorcowa dla całkowitego TH, do której dodano 28 μg białka z homogenatu wątroby szczura, aby odzwierciedlić ładunek białka z próbek istoty czarnej. Kolejna ścieżka zawiera markery masy cząsteczkowej (MW). Pozostałe ścieżki zawierają ~28 μg białka z próbek istoty czarnej szczura. Ładunki białka zostały określone na podstawie stężenia białka w każdej próbce wyznaczonego metodą BCA. Jednak pomimo teoretycznie równych ładunków, występują różnice w intensywności barwienia Ponceau S między próbkami, co wskazuje na niewielką zmienność stężeń białek; zostaje ona skorygowana poprzez normalizację z wykorzystaniem analizy w programie ImageJ w celu oceny ilości barwnika Ponceau S dla każdej próbki.

Rycina 4. Reprezentatywne wyniki fosforylacji TH w grupach kontrolnych i badanych. Reprezentatywne analizy Western blot fosforylowanej hydroksylazy tyrozynowej w pozycji ser31 (pTH) oraz ser40 pTH u szczurów rasy Wistar traktowanych solą fizjologiczną i metamfetaminą w poprzednim badaniu⁴. A. ser 31 pTH w próbkach istoty czarnej szczura. Skalibrowana krzywa wzorcowa ser 31 pTH mieści się w zakresie od 0.3 ng do 2.0 ng i znajduje się w liniowym zakresie detekcji. Na podstawie poprzedniej analizy Western blot całkowitego poziomu TH, dla każdej próbki naniesiono 6 ng całkowitego TH. B. ser40 pTH w próbkach brzusznej pola nakrywy szczura. Skalibrowana krzywa wzorcowa ser40 pTH mieści się w zakresie od 0.2 ng do 1.5 ng i znajduje się w liniowym zakresie detekcji. Na podstawie poprzedniej analizy Western blot całkowitego poziomu TH, dla każdej próbki naniesiono 9 ng całkowitego TH.

Dyskusja

Jak przedstawiono na Rysunku 1, opisane powyżej metody powinny pozwolić na uzyskanie wielu pomiarów dopaminy oraz regulujących ją białek TH, DAT i VMAT2 z jednej próbki SN lub VTA pobranej od szczura lub myszy. Ponownie podkreśla się, że korzyścią z zastosowania tego protokołu jest możliwość uzyskania przez badacza operacyjnie dopasowanych wyników dotyczących regulacji dopaminy in vivo w niemal każdym paradygmacie eksperymentalnym, co pozwala na znaczną oszczędność zasobów eksperymentalnych poprzez zmniejszenie ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System HPLC:
Podstawowy system składa się z pompy HPLC Shimadzu LC10-ADvp, automatycznego wtryskiwacza próbek Waters WISP 717, 250 X 4,4 mm 5 mikronów Spherosorb ODS-1 kolumny C18 z odwróconymi fazami (Waters), podwójna elektroda węglowa TL12 Bioanalytical Systems (BAS) TL12, dwa detektory elektrochemiczne BAS LC4B oraz system gromadzenia i integracji danych Waters Empower 2.
Kolumna jest utrzymywana na poziomie 30-45 stopni; C (nagrzewnica kolumnowa BAS LC22A). Faza ruchoma to 0,1 M fosforanu sodu (pH 3,0), 0,1 mM EDTA, 0,2-0,4 mM kwasu 1-oktanosulfonowego (Eastman-Kodak) i 0,35% acetonitrylu (v / v), przefiltrowane przez filtr 0,45 mikrona. Natężenie przepływu wynosi 1,2 ml/min. Czterolitrowe partie fazy ruchomej są zoptymalizowane pod kątem separacji poprzez regulację pH, kwasu oktanosulfonowego i temperatury kolumny. Faza ruchoma jest poddawana recyklingowi i jest stale przedmuchiwana helem gazowym w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu. Recykling fazy mobilnej jest prawie niezbędny do utrzymania dobrej rozdzielczości przez rozsądny okres czasu. Okres trwałości fazy ruchomej jest utrzymywany za pomocą przełącznika przepływu (kontrolowanego przez integratora) do przekierowania do marnowania pierwszych 2-7 minut każdego przebiegu.
Elektrody są utrzymywane na potencjałach około 0,78 i 0,95 V w stosunku do elektrody odniesienia Ag/AgC1. Elektroda o wyższym potencjale służy wyłącznie do oznaczania tryptofanu (i wzorca wewnętrznego NMDA). Potencjał 0,78 V zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu do wykrywania monoamin i związków innych niż tryptofan. Chromatogramy są przechowywane na dysku twardym stacji roboczej Empower, a następnie przetwarzane, a dane przesyłane bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu obliczenia ilości metabolitów i zestawienia danych grupowych.
Pompa: Shimadzu LC-10AD Komórka: BAS Cross Flow. Szklista węglowa elektroda robocza o potencjale 0,780 i 0,950 V. Detektor: BAS LC-4B pracujący w trybie dwukanałowym. Data Acq. System: Waters Empower Pro 2. Wtryskiwacz: Waters WISP 717 Kolumna: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μ Cząstka M, 4,4 mm X 250 mm.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau	S Fluka	81460
Bromofenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Białko Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce Odczynnik do oznaczania białek BCA	A Thermo-Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-białko A, aktywność specyficzna	Perkin-Elmer
Tabela 2. Specyficzne odczynniki.
10% SDS			10 g SDS, 100 ml DI H20
1% SDS (pH do 8,2)			10 ml 10%SDS 60,5 mg Trizma Base 37,22 mg EDTA 90 mL DI H20
Roztwór			1 g Siarczan miedzi II 25 ml DI H20
3X Bufor			do próbekTrizma Base 2,27 g SDS 6 g Ditiothreitol 0,463 g Glicerol 30 g Błękit bromofenolowy 10 mg D I H20 (początkowo dodać powyższe odczynniki do 40 ml H20 w cylindrze miarowym; następnie dodawać H20, aż objętość osiągnie 100 ml) HCl (dodawać w razie potrzeby, aby osiągnąć pH 6,85) Zamrażać w 50 probówkach o pojemności 2,0 ml. (na 100 ml): Objętość 3X potrzebnego bufora próbki = ½ objętość karty charakterystyki użytej w próbce.
1X Bufor			Rozcieńczyć 3X Bufor próbki do 1X bufor próbki przy użyciu DI H20
10X Bufor do biegania (4 l)			Baza Trizma 121,1 g Glicyna 577 g SDS 40 g
10X Bufor transferowy: (Składniki na 4 l)			Glicyna 360 g Baza Trizma 96 g
Ponceau			Ponceau S. 0,5 g Kwas octowy 5 ml DI H20 95 ml
.2% roztwór			HCl 5,2 ml HCl w 500 ml DI H20
PVP-T20 Roztwór blokujący (na 4 l)			PVP-40 40 g dPBS 38,2 g Tween20 2 g Tiomizol 0,4 g 1M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g Tris Zasada w 500 ml DI H20)- 50 ml
10X Bufor Blot (Składniki 4 l)			Tween 20 20 g Tris Baza 14 g Tris HCl 61 g
Tabela 3. Test białka i formuły Western Blotting.
standardy hydroksylazy tyrozyny: Skalibrowane standardy białka TH i fosforylacji stosowane przez to laboratorium pochodzą z ekstraktów komórkowych PC12, które analizowano pod kątem zawartości białka TH i stechiometrii fosforylacji w porównaniu z wcześniej skalibrowanymi wzorcami TH, które ostatecznie pochodziły z laboratorium dr Johna Haycocka 11.