Hemocyty owadów pełnią wiele istotnych funkcji, zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, na wszystkich etapach rozwoju owada. Nasza obecna wiedza na temat typów i funkcji hemocytów pochodzi z badań nad genetycznymi modelami owadów. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę izolacji, kwantyfikacji i wizualizacji hemocytów z dzikich gąsienic.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hemocyty owadów (odpowiedniki białych krwinek u ssaków) odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych w całym cyklu życiowym owada 1. W stadiach larwalnych owadów należących do rzędów Lepidoptera (motyle i ćma) oraz Diptera (muchówki), hemocyty powstają w gruczole limfy (wyspecjalizowanym organie hematopoetycznym) lub z komórek embrionalnych i mogą być zachowane aż do stadium imago. Embrionalne hemocyty biorą udział w migracji komórek podczas rozwoju oraz w regulacji chemotaksji w czasie stanu zapalnego. Uczestniczą one również w apoptozie komórkowej i są niezbędne dla embriogenezy 2. Hemocyty pośredniczą w komórkowym ramieniu wrodzonej odpowiedzi odpornościowej owadów, która obejmuje szereg funkcji, takich jak rozprzestrzenianie się komórek, agregacja komórek, tworzenie guzków, fagocytoza i enkapsulacja obcych intruzów 3. Odpowiadają one także za koordynację swoistych humoralnych mechanizmów obronnych owadów podczas infekcji, takich jak produkcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych i innych cząsteczek efektorowych 4, 5. Morfologię i funkcję hemocytów badano głównie na genetycznych lub fizjologicznych modelach owadów, w tym na muszce owocówce, Drosophila melanogaster 6, 7, komarach Aedes aegypti i Anopheles gambiae 8, 9 oraz omacnicy tytoniowej, Manduca sexta 10, 11. Obecnie jednak dysponujemy niewielką ilością informacji na temat różnorodności, klasyfikacji, morfologii i funkcji hemocytów u gatunków owadów niemodelowych, szczególnie tych pobranych z natury 12.
W niniejszym opracowaniu opisujemy prosty i wydajny protokół izolacji hemocytów z dzikich gąsienic. Wykorzystujemy gąsienice przedostatniego stadium larwalnego Lithacodes fasciola (mola żółtoramiennego) (Rysunek 1) oraz Euclea delphinii (mola dębowego) (Lepidoptera: Limacodidae) i wykazujemy, że z poszczególnych larw można wyizolować wystarczające objętości hemolimfy (krwi owadziej) i przeprowadzić zliczenie liczby hemocytów. Metoda ta może być wykorzystana do efektywnego badania typów hemocytów u tych gatunków, jak i u innych spokrewnionych gąsienic motyli zebranych w terenie, lub może zostać łatwo połączona z testami immunologicznymi zaprojektowanymi do badania funkcji hemocytów po zakażeniu organizmami mikrobiologicznymi lub pasożytniczymi 13.
Protokół
1. Przygotowanie materiałów
- Przygotować igły (końcówka 1-2 μm i zwężenie 3-4 mm) przy użyciu kapilar z borokrzemowego szkła oraz mikropipetowego wyciągacza. Ustawienia urządzenia: ramp: 561; velocity: 20; heat: 560; delay: 1; pull: 100; pressure: 500.
- Przygotować roztwór do zbierania: 60% pożywki Grace'a (GM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 20% buforu przeciwkrzepliwego (98 mM NaOH, 186 mM NaCI, 1.7 mM EDTA oraz 41 mM kwasu cytrynowego, pH 4.5). Powyższy roztwór należy przygotować na świeżo w warunkach sterylnych i przez cały czas przechowywać w lodzie.
- Przygotować roztwór buforu inkubacyjnego: 90% GM uzupełnionej o 10% FBS. Ten roztwór również należy przygotować na świeżo i przez cały czas przechowywać w lodzie.
- Przygotować łącznie co najmniej 15 μl × liczbę owadów zarówno dla roztworu do zbierania, jak i roztworu inkubacyjnego.
2. Iniekcja gąsienic roztworem do pobierania
- Zanurz larwy w ostatnim stadium przed poczwarkowaniem w lodzie na 20 min w celu znieczulenia przed ekstrakcją hemocytów.
- Włóż tępy koniec czystej igły kapilarnej (rozmiar 16G) do rurki połączonej ze szklaną strzykawką o pojemności 20 ml (Rysunek 2). Pozostaw probówkę z roztworem do zbierania otwartą na blacie laboratoryjnym i powoli napełnij kapilarę buforem. Kapilara jest zazwyczaj napełniana około 10-15 μl roztworu do zbierania, w zależności od wielkości gąsienicy (około 1 μl roztworu na 10 mg całkowitej masy ciała gąsienicy = 0,01% całkowitej masy ciała). Oprzyj igłę o grudkę gliny umieszczoną obok mikroskopu stereoskopowego.
- Umieść gąsienicę w szalce Petriego. Owad powinien być ułożony na boku tak, aby przetchlinki były wyraźnie widoczne (Rysunek 3).
- Obserwując pod mikroskopem stereoskopowym, unieruchom gąsienicę pęsetą i umieść igłę blisko jednej z przetchlinek, gdzie kutykula owada jest zazwyczaj miększa. Delikatnie dociśnij igłę kapilarną do ciała owada. Po przebiciu kutykuli wstrzyknij całą objętość roztworu do gąsienicy (Rysunek 3). Ważne jest, aby uniknąć wstrzyknięcia pęcherzyków powietrza do gąsienicy. Ciało gąsienicy spuchnie (np. zwiększy objętość o 20%) po iniekcji, ale nie powinno pęknąć ani przeciekać.
- Przenieś gąsienicę z powrotem na lód, układając owada grzbietem do góry, aby zapobiec wyciekaniu buforu z miejsca nakłucia (Rysunek 3).
- Powtórz kroki 2.1-2.4 dla każdej gąsienicy wykorzystywanej do ekstrakcji hemolimfy. Na tym etapie pozwól wszystkim owadom chłodzić się na lodzie przez 30 min przed kontynuacją procedury.
3. Izolacja hemocytów
- Umieść gąsienicę w szalce Petri pod mikroskopem stereoskopowym.
- Wykonaj płytkie nacięcie (o długości 2-3 mm) w tylnej części ciała gąsienicy za pomocą sterylnego skalpela (Rycina 3). Należy uważać, aby nie uszkodzić jelita ani innych organów wewnętrznych; celem jest ostrożne przebicie kutykuli i pobranie mieszaniny buforu z hemolimfą zawierającej hemocyty od poszczególnych owadów.
- Delikatnie uciśnij gąsienicę za pomocą giętkich plastikowych pęsety, pobierając mieszaninę hemolimfy (około 10-20 μl) końcówką pipety o pojemności 10 μl, ponownie dbając o to, aby nie uszkodzić tkanek wewnętrznych (Rycina 3). Hemolimfę pobiera się z kropli wyciśniętej z ciała gąsienicy. Pozostałości gąsienicy należy wyrzucić.
- Pobierz hemolimfę od każdej gąsienicy do oddzielnych, oznakowanych, silikonizowanych probówek do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml.
- Do każdej próbki hemolimfy pobranej od pojedynczej gąsienicy dodaj taką samą objętość roztworu inkubacyjnego (około 10-20 μl). Próbki hemolimfy należy przez cały czas przechowywać w lodzie.
- Powtórz kroki 3.1-3.5 dla każdej gąsienicy wykorzystanej w eksperymencie.
4. Ilościowe oznaczanie hemocytów
- Wymieszaj próbkę hemolimfy z roztworem inkubacyjnym bezpośrednio przed zliczeniem hemocytów. Zabieg ten umożliwia prawidłowe rozdzielenie hemocytów i zapobiega ich zlepianiu się.
- Za pomocą czystego końcówki do pipety przenieś 10 μl próbki hemolimfy wymieszanej z roztworem inkubacyjnym na hemocytometr.
- Używając mikroskopu złożonego, zlicz i zapisz liczbę hemocytów w co najmniej 15 dużych polach (powierzchnia jednego pola: 0,04 mm2, głębokość: 0,1 mm) środkowej siatki hemocytometru (Rysunek 3). Zsumuj te wartości, aby uzyskać całkowitą liczbę hemocytów w 15 polach.
- Między każdą próbką dokładnie wypłucz hemocytometr oraz szkiełko nakrywkowe, używając butelki z wodą destylowaną i dejonizowaną, a następnie wytrzyj do sucha za pomocą chusteczek Kimwipes (Kimberly-Clark).
- Powtórz kroki 4.1–4.4 dla każdej próbki hemolimfy.
- Oblicz średnią liczbę hemocytów na ml objętości hemolimfy dla każdej gąsienicy w następujący sposób:
Całkowita objętość każdego kwadratu siatki komory countingowej: (pole 0.04 mm2) × (głębokość 0.1 mm) = 0.004 mm3 × 15 kwadratów = 0.06 mm3 = całkowita objętość wszystkich 15 przeliczonych kwadratów.
(Suma całkowitej liczby hemocytów w policzonych 15 polach / całkowita objętość wszystkich 15 policzonych pól) x 2 czynnik rozcieńczenia = liczba hemocytów/mm3 x 1 000 = liczba hemocytów/ml hemolimfy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany tutaj protokół umożliwia pobranie minimalnej objętości 10-20 μl hemolimfy owadziej od poszczególnych gąsienic. Hemocyty pobrane tą metodą są wolne od zlepiania się komórek, wad melanizacji, resztek tkankowych lub innych zanieczyszczeń. Dzięki temu hemocyty można łatwo obserwować i liczyć pod mikroskopem, a w ciągu kilku godzin można zbadać wiele osobników. Zaobserwowaliśmy, że większość hemocytów w naszych próbkach stanowiły plazmatocyty 3 (hemocyty rozprzestrzeniające się asymetrycznie) (Rysun...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metody izolacji hemocytów z owadów o znaczeniu medycznym oraz modelowych owadów z rzędu motyli (Lepidoptera) były raportowane wcześniej 9, 14. Metody ekstrakcji hemocytów są dostosowywane do gatunku owada, jego stadium rozwojowego oraz cech morfologicznych. Na przykład izolację hemolimfy z larw Manduca można łatwo przeprowadzić poprzez odcięcie zakrzywionego rogu w pobliżu końca odwłoka 15. Ponieważ gąsienice z rodziny Limacodidae nie posiadają tej struktury odwłokowej, opracowaliśmy odrębn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
TMS otrzymał wsparcie w ramach stypendium Harlan Trust Fellowship (GWU) podczas niniejszego badania. Finansowanie zbiorów terenowych oraz hodowli L. fasciola i E. delphinii zostało zapewnione z grantu NSF DEB 0642438 przyznanego JTL.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wytciągacz do mikropipet | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Szklane rurki borokrzemowe | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Pożywka Grace'a | Sigma | G8142 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Inaktywowana termicznie |
| Pinceta Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hemocytometr Neubauera | Hausser Scientific | 3200 | |
| Przewody plastikowe | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Szklana strzykawka medyczna | Fortuna Optima | D-97877 | Objętość 50 ml |
| Igła stromo zakończona | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" długości |
Bibliografia
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542(2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1(2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373(2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743(2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651(2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249(2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218(2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891(2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181(2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840(2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417(2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695(2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
