Artykuł metodologiczny

Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

DOI:

10.3791/4173

⸱

15 listopada 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemocyty owadów pełnią wiele ważnych funkcji, zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, na wszystkich etapach rozwoju owadów. Nasza obecna wiedza na temat typów i funkcji hemocytów pochodzi z badań nad modelami genetycznymi owadów. W tym miejscu przedstawiamy metodę ekstrakcji, kwantyfikacji i wizualizacji hemocytów z dzikich gąsienic.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemocyty owadów (odpowiednik białych krwinek ssaków) odgrywają ważną rolę w wielu procesach fizjologicznych w całym cyklu życia owada 1. W stadiach larwalnych owadów należących do rzędów Lepidoptera (i motyle) oraz Diptera (muchówki) hemocyty powstają z gruczołu chłonnego (wyspecjalizowanego narządu krwiotwórczego) lub komórek embrionalnych i mogą być przenoszone do stadium dorosłego. Hemocyty embrionalne biorą udział w migracji komórek podczas rozwoju i regulacji chemotaksji podczas stanu zapalnego. Biorą również udział w apoptozie komórek i są niezbędne do embriogenezy 2. Hemocyty pośredniczą w ramieniu komórkowym wrodzonej odpowiedzi immunologicznej owada, która obejmuje kilka funkcji, takich jak rozprzestrzenianie się komórek, agregacja komórek, tworzenie guzków, fagocytoza i enkapsulacja obcych najeźdźców 3. Są również odpowiedzialne za koordynację specyficznych humoralnych mechanizmów obronnych owadów podczas infekcji, takich jak produkcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych i innych cząsteczek efektorowych 4, 5. Morfologia i funkcja hemocytów była badana głównie w genetycznych lub fizjologicznych modelach owadów, w tym muszki owocowej Drosophila melanogaster 6, 7, komarów Aedes aegypti i Anopheles gambiae 8, 9 oraz rogownicy tytoniowej Manduca sexta 10, 11. Obecnie jednak niewiele jest informacji na temat różnorodności, klasyfikacji, morfologii i funkcji hemocytów u niemodelowych gatunków owadów, zwłaszcza tych zebranych ze środowiska naturalnego12.

Tutaj opisujemy prosty i skuteczny protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic. Używamy gąsienic przedostatniego stadium rozwojowego Lithacodes fasciola (ślimaka żółtoramiennego) (ryc. 1) i Euclea delphinii (ślimak dębu kolczastego) (Lepidoptera: Limacodidae) i wykazujemy, że można wyizolować wystarczającą ilość hemocyfy (krwi owadów) i policzyć liczbę hemocytów z poszczególnych larw. Metoda ta może być stosowana do skutecznego badania typów hemocytów u tych gatunków, a także u innych pokrewnych gąsienic lepidoptera zebranych z pola, lub może być łatwo połączona z testami immunologicznymi przeznaczonymi do badania funkcji hemocytów po zakażeniu organizmami mikrobiologicznymi lub pasożytniczymi 13.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiału

  1. Przygotować igły (końcówka 1-2 μm i stożek 3-4 mm) za pomocą kapilar ze szkła borokrzemianowego i ściągacza do mikropipet. Ustawienia instrumentów: rampa: 561; prędkość: 20; ciepło: 560; opóźnienie: 1; uciąg: 100; Ciśnienie: 500.
  2. Przygotuj roztwór do pobrania: 60% pożywki Grace's Medium (GM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 20% buforem przeciwzakrzepowym (98 mM NaOH, 186 mM NaCI, 1,7 mM EDTA i 41 mM kwasu cytrynowego, pH 4,5). Powyższy roztwór jest przygotowywany świeży w sterylnych warunkach i przechowywany przez cały czas na lodzie.
  3. Przygotować roztwór buforowy do inkubacji: 90% GM uzupełnione 10% FBS. Roztwór ten jest również przygotowywany na świeżo i przez cały czas przechowywany na lodzie.
  4. Przygotować łącznie co najmniej 15 μl × liczby owadów zarówno do zbierania, jak i do roztworów inkubacyjnych.

2. Wstrzykiwanie gąsienic za pomocą roztworu do zbierania

  1. Znieczulenie przedostatnich larw stadium rozwojowego poprzez schładzanie ich na lodzie przez 20 minut przed ekstrakcją hemocytów.
  2. Załóż koniec czystej igły kapilarnej (rozmiar 16) do rurki podłączonej do szklanej strzykawki o pojemności 20 ml (Rysunek 2). Pozostawić probówkę zawierającą roztwór do pobierania otwartą na stole laboratoryjnym i powoli napełnić kapilar buforem. Kapilar jest zwykle wypełniany około 10-15 μl roztworu zbiorczego, w zależności od wielkości gąsienicy (około 1 μl roztworu na 10 mg całkowitej masy ciała gąsienicy = 0,01% całkowitej masy ciała). Oprzyj igłę na kulce gliny, którą umieszcza się obok mikroskopu preparacyjnego.
  3. Umieść gąsienicę na szalce Petriego. Owad powinien być umieszczony na boku tak, aby przetchlinki były dobrze widoczne (ryc. 3).
  4. Podczas oglądania pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj gąsienicę na miejscu za pomocą kleszczy i umieść igłę blisko jednej z przetchlink, gdzie naskórek owada jest na ogół bardziej miękki. Delikatnie dociśnij igłę kapilarną do ciała owada. Gdy igła wbije się w naskórek, wstrzyknąć całą objętość roztworu do gąsienicy (ryc. 3). Ważne jest, aby unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza do gąsienicy. Ciało gąsienicy pęcznieje (np. zwiększa objętość o 20%) po wstrzyknięciu, ale nie powinno pękać ani nie powinno się sączyć.
  5. Umieść gąsienicę z powrotem w lodzie, ustawiając owada grzbietowo, aby zapobiec wyciekaniu buforu z rany (ryc. 3).
  6. Powtórz kroki 2.1-2.4 dla każdej gąsienicy używanej do ekstrakcji hemolimfy. Na tym etapie pozwól wszystkim owadom schłodzić się na lodzie przez 30 minut, zanim przejdziesz dalej.

3. Ekstrakcja hemocytów

  1. Umieść gąsienicę na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym
    2. .
  2. Wykonaj płytkie (2-3 mm długości) nacięcie w tylnej części gąsienicy za pomocą sterylnego skalpela (ryc. 3). Uważaj, aby nie uszkodzić jelit ani innych narządów wewnętrznych; Celem jest dokładne nakłucie naskórka i pobranie mieszanki buforowo-hemolimfowej zawierającej hemocyty od poszczególnych owadów.
  3. Delikatnie ściśnij gąsienicę za pomocą elastycznych plastikowych kleszczyków, jednocześnie zbierając mieszankę do hemolimfy (około 10-20 μl) za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl, ponownie uważając, aby nie uszkodzić tkanek wewnętrznych (ryc. 3). Hemolimfę zbiera się z kropelki wyciśniętej z ciała gąsienicy. Wyrzuć szczątki gąsienicy.
  4. Zbierz hemolimfę z każdej pojedynczej gąsienicy do osobnych, oznakowanych silikonowanych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml.
  5. Dodać równą objętość roztworu inkubacyjnego (około 10-20 μl) do każdej próbki hemolimfy pobranej od pojedynczej gąsienicy. Próbki hemolimfy należy zawsze przechowywać na lodzie.
  6. Powtórz kroki 3.1-3.5 dla każdej gąsienicy użytej w doświadczeniu.

4. Kwantyfikacja hemocytów

  1. Wymieszać próbkę hemolimfy i roztwór inkubacyjny bezpośrednio przed liczeniem hemocytów. Zabieg ten pozwala na prawidłowe oddzielenie hemocytów i zapobiega zbrylaniu.
  2. Za pomocą czystej końcówki pipety przenieś 10 μl próbki hemolimfy zmieszanej z roztworem inkubacyjnym na hemocytometr.
  3. Za pomocą mikroskopu złożonego policz i zapisz liczbę hemocytów w co najmniej 15 dużych kwadratach (powierzchnia jednego kwadratu: 0,04 mm2, głębokość: 0,1 mm) centralnej siatki hemocytometru (ryc. 3). Dodaj te wartości, aby uzyskać całkowitą sumę liczby hemocytów w 15 kwadratach.
  4. Dokładnie wypłukać hemocytometr i jego szkiełko pokrywowe za pomocą butelki do mycia wodą destylowaną i dejonizowaną i wytrzeć do sucha chusteczką Kimwipes (Kimberly-Clark) między każdą próbką.
  5. Powtórzyć kroki 4.1-4.4 dla każdej próbki hemolimfy.
  6. Obliczyć średnią liczbę hemocytów na ml objętości hemolimfy dla każdej gąsienicy w następujący sposób:

Całkowita objętość każdego kwadratu siatki hemocytometru: (0,04 mm2 obszar) × (0,1 mm głębokość) = 0,004 mm3 × 15 kwadratów = 0,06 mm3 = całkowita objętość wszystkich 15 policzonych kwadratów.

(Suma całkowitej liczby hemocytów w 15 policzonych kwadratach / całkowita objętość wszystkich 15 policzonych kwadratów) x 2 współczynnik rozcieńczenia = liczba hemocytów/mm3 x 1,000 = liczba hemocytów/ml hemolimfy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany tutaj pozwala na pobranie minimalnej objętości 10-20 μl hemolimfy owadów z pojedynczych gąsienic. Hemocyty pobrane tą metodą są wolne od zlepiania się komórek, defektów melanizacji, resztek tkanek czy innych zanieczyszczeń. Dlatego hemocyty można łatwo obserwować i liczyć pod mikroskopem, a kilka owadów można zaobserwować w ciągu kilku hosurów. Zaobserwowaliśmy, że większość hemocytów w naszych próbkach składała się z plazmatocytów 3 (hemocyty rozprzestrzeniające się asymetrycznie) (ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody ekstrakcji hemocytów z ważnych z medycznego punktu widzenia owadów i owadów modelowych z rzędu Lepidoptera zostały już wcześniej opisane 9, 14. Metody ekstrakcji hemocytów są dostosowane do gatunku owada, etapu rozwoju owada i jego cech morfologicznych. Na przykład izolację hemolimfy od larw Manduca można łatwo przeprowadzić, przecinając zakrzywiony róg w pobliżu końca odwłoka 15. Ponieważ gąsienice ślimaków (Limacodidae) nie mają tej struktury brzusznej, opracowaliśmy odrębny protok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMS był wspierany przez Harlan Trust Fellowship (GWU) podczas tego badania. Finansowanie polowej kolekcji i hodowli L. fasciola i E. delphinii zostało zapewnione z grantu NSF DEB 0642438 dla JTL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-1000
Rurki ze szkła borokrzemianowegoSutter InstrumentsB100-50-10OD: 1.0, ID: 0.50 mm
Grace's MediumSigmaG8142
Płodowa surowica bydlęca Thermo Fisher ScientificSH3007102Inaktywowane termicznie
KleszczeDumont #511252-40
Hemocytometr NeubaueraHausser Scientific3200
Rurka plastikowaTri-TechTT-3-32ODOD: 3/32'', ID: 1/32'Szklana
strzykawka medycznaFortuna OptimaD-97877Objętość 50 ml
Igła z końcemMałe częściNE-162PL-2516 Gauge x 1" długość

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542(2007).
  3. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1(2008).
  4. Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373(2011).
  5. Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743(2011).
  6. Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651(2011).
  7. Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249(2011).
  8. Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218(2010).
  9. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891(2006).
  10. Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181(2010).
  11. Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840(2009).
  12. Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417(2006).
  13. Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).
  14. Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).
  15. Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695(2010).
  16. Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja hemocyt whemolimfa g sienicodpowied odporno ciowa owad wliczenie w komorze countingowejznieczulanie g sienictechnika p ytkiego naci ciawstrzykiwanie roztworu buforowegopobieranie hemolimfyanaliza g sienic dzikichkom rkowe testy odporno ciowe

Powiązane artykuły