Artykuł metodologiczny

Nowoczesny osmometr nanolitrowy sterowany programem LabVIEW do badań nad białkami wiążącymi lód

22.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4189

⸱

4 lutego 2013

 , 
1Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition , The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food, and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Physics and Astronomy, Ohio University

W tym artykule

Podsumowanie

Białka wiążące lód (IBPs), znane również jako białka przeciwzamrożeniowe, hamują wzrost kryształków lodu i stanowią obiecujący dodatek do stosowania w krio konserwacji tkanek. Głównym narzędziem wykorzystywanym do badania białek IBPs jest osmometr nanolitrowy. Opracowaliśmy autorską platformę chłodzącą zamontowaną na mikroskopie optycznym, sterowaną za pomocą dedykowanej procedury w programie LabVIEW. Opisany tutaj osmometr nanolitrowy umożliwia ultrazieczulną manipulację temperaturą próbki.

Streszczenie

Białka wiążące lód (IBPs), w tym białka przeciwzamrażające, białka strukturyzujące lód, białka histerezy termicznej i białka hamujące rekrystalizację lodu, występują u organizmów przystosowanych do zimna i chronią je przed uszkodzeniami mrozowymi poprzez oddziaływanie z kryształami lodu. IBPs występują u wielu organizmów, w tym u ryb1, roślin2, 3, stawonogów4, 5, grzybów6 oraz bakterii7. IBPs adsorbują się na powierzchniach kryształów lodu i zapobiegają przyłączaniu się cząsteczek wody do sieci krystalicznej lodu w miejscu adsorpcji białka. Lód narastający na powierzchni kryształu pomiędzy zaadsorbowanymi IBPs wykazuje dużą krzywiznę, co obniża temperaturę, w której rosną kryształy lodu – zjawisko to nazywane jest efektem Gibbsa-Thomsona. Obniżenie to tworzy lukę (histereza termiczna, TH) między punktem topnienia a nierównowagowym punktem zamarzania, w obrębie której wzrost lodu zostaje zahamowany8-10, patrz Rycina 1. Jednym z głównych narzędzi stosowanych w badaniach nad IBPs jest osmometr nanolitrowy, który ułatwia pomiary aktywności TH roztworów IBPs. Osmometry nanolitrowe, takie jak instrument Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) i instrument Otago (Otago Osmometers, Dunedin, Nowa Zelandia), zostały zaprojektowane do pomiaru osmolarności roztworu poprzez pomiar obniżenia punktu topnienia kropli o objętości nanolitrowej. Urządzenia te były wykorzystywane do pomiaru osmolarności próbek biologicznych, takich jak łzy11, i okazały się użyteczne w badaniach nad IBPs. Ręczna kontrola tych osmometrów nanolitrowych ograniczała możliwości eksperymentalne. Szybkość zmian temperatury nie mogła być kontrolowana w sposób niezawodny, zakres temperatur w instrumencie Clifton był ograniczony do 4 000 mOsmol (około -7,5 °C), a rejestracja temperatury w funkcji czasu nie była dostępną opcją w tych urządzeniach.

Zaprojektowaliśmy specjalistyczny system nanolitrowego osmometru sterowanego komputerowo z wykorzystaniem platformy LabVIEW (National Instruments). Stolik chłodzący, opisany wcześniej9, 10, zawiera blok metalowy, przez który cyrkuluje woda, co sprawia, że pełni on funkcję radiatora, patrz Rysunek 2. Do bloku tego przymocowano chłodziarki termoelektryczne, które mogą być sterowane za pomocą komercyjnego kontrolera temperatury obsługiwanego przez moduły LabVIEW, patrz Rysunek 3. Dalsze szczegóły przedstawiono poniżej. Główną zaletą tego systemu jest precyzyjna kontrola temperatury, patrz Rysunek 4. Zautomatyzowane sterowanie temperaturą umożliwia koordynację stałej rampy temperaturowej z obrazem z mikroskopii wideo zawierającym dodatkowe szczegóły eksperymentalne.

Aby zbadać zależność aktywności TH od czasu, przetestowano hiperaktywne IBP o masie 58 kDa pochodzące z antarktycznej bakterii Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Białko to zostało znakowane ulepszonymi białkami fluorescencyjnymi zielonymi (eGFP) w konstrukcie opracowanym przez grupę Petera Daviesa (Queens University)10. Wykazano, że profil zmian temperatury wpływał na aktywność TH. Precyzyjna kontrola profilu temperatury w tych eksperymentach znacząco poprawiła pomiary TH. Nanolitrowy osmometr pozwolił dodatkowo zbadać hamowanie rekrystalizacji przez IBPs5, 13. Rekrystalizacja jest zjawiskiem, w którym duże kryształy rosną kosztem kryształów małych. IBPs skutecznie hamują rekrystalizację, nawet przy niskich stężeniach14, 15. Wykorzystano osmometr sterowany programem LabVIEW do ilościowego śledzenia rekrystalizacji lodu oraz do wymuszania stałej frakcji lodu za pomocą jednoczesnej analizy wideo obrazów w czasie rzeczywistym i sprzężenia zwrotnego temperatury z komory z próbką13. Obliczenia w czasie rzeczywistym oferują dodatkowe opcje kontroli podczas procedury eksperymentalnej. Opracowano stolik do mikroskopu odwróconego, przystosowany do mikroprzepływowych urządzeń z kontrolą temperatury, które zostaną opisane w innej publikacji16.

System stolika chłodzącego

Zespół modułu chłodzącego (Rysunek 2) składa się z zestawu chłodziarek termoelektrycznych, które chłodzą miedzianą płytkę. Ciepło jest odprowadzane z modułu poprzez przepływ zimnej wody przez zamkniętą komorę znajdującą się pod chłodzarkami termoelektrycznymi. Otwór o średnicy 4 mm w środku miedzianej płytki służy jako okno obserwacyjne. Wywiercono otwór w płaszczyźnie o średnicy 1 mm, aby dopasować termistor. Na miedzianej płytce umieszczono wykonaną na zamówienie miedzianą tarczkę (o średnicy 7 mm) z kilkoma otworami (o średnicy 500 μm) i wyrównano ją z oknem obserwacyjnym. Powietrze pompowano z natężeniem przepływu 35 ml/sec i osuszano przy użyciu Drierite (W.A. Hammond). Suche powietrze zastosowano w celu zapewnienia suchego środowiska w module chłodzącym. Moduł został połączony za pomocą 9-pinowego gniazda z kontrolerem temperatury (Model 3040 lub 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). Kontroler temperatury został połączony za pomocą kabla z kartą GPIB-PCI komputera (National instruments, Austin, Texas, USA).

Protokół

0. Procedury wstępne

  1. Szklana kapilara do wstrzykiwania roztworu. Za pomocą wyciągacza kapilar (Narishige, Tokio, Japonia) przygotować ostrą pipetę z wąskim otworem z mikro rurki kapilarnej ze szkła (Brand GMBH, Wertheim, Niemcy). Wielkość otworu należy zweryfikować, przepuszczając powietrze przez kapilarę, aby uzyskać drobne pęcherzyki w czystej wodzie. Jeśli kapilara jest zamknięta, można ją otworzyć poprzez przełamanie jej krawędzi. Można to osiągnąć, delikatnie dociskając lub zdrapując ją o ścianki probówki z wodą. Kapilara powinna być przygotowana w taki sposób, aby otwór był niemal zablokowany, ale jednocześnie wystarczająco otwarty, by umożliwić tworzenie się pęcherzyków o rozmiarach submilimetrowych.
  2. Czyszczenie miedzianych dysków. Miedziane dyski poddać sonikacji przez 10 min w 0,1% roztworze mydła Micro-90 (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), a następnie wypłukać wodą dwukrotnie destylowaną. Umieścić dyski w izopropanolu (technicznym) i ponownie sonikować przez 10 min. Na koniec wysuszyć dyski za pomocą przefiltrowanego powietrza. Ten etap czyszczenia jest krytyczny, aby uniknąć zanieczyszczenia IBP pomiędzy eksperymentami.
  3. Montaż dwuwarstwowego szkiełka nakrywkowego. Przygotowano zespół szkiełek nakrywkowych, aby umożliwić obserwację próbki bez kondensacji wilgoci na powierzchni szkiełka. Osiągnięto to poprzez umieszczenie ziarna Drierite (W.A. Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) (o średnicy 2 mm) pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi, które następnie skleiono pistoletem z klejem na gorąco. Taka konfiguracja zapobiegła kondensacji, która mogłaby zasłonić widok podczas chłodzenia próbki do niskich temperatur, oraz wyeliminowała konieczność nadmuchiwania okna obserwacyjnego suchym powietrzem.

1. Konfiguracja etapu chłodzenia

  1. Podłączyć wlot i wylot przepływu wody w stopniu chłodzącym do rurek Tygon o średnicy wewnętrznej 4 mm (Saint-Gobain, Paryż, Francja), a rurkę wlotową przepływu wody podłączyć do pompy wodnej.
  2. Do wlotu stopnia chłodzącego podłączyć rurkę Tygon o średnicy wewnętrznej 4 mm w celu doprowadzania suchego powietrza. Powietrze było osuszane przy użyciu kolumny Drierite zamontowanej w linii.
  3. Uruchomić pompy powietrza i wody. Należy pamiętać, że elementów chłodzących nie wolno uruchamiać bez radiatora.
  4. Włączyć kontroler temperatury, kamerę oraz procedurę LabVIEW.

2. Przygotowanie próbek

  1. Nanieś kroplę 3-4 μl oleju immersyjnego B (Cargille laboratories, Cedar Grove, New Jersey, USA) na tylną stronę miedzianej płytki o średnicy 7 mm z wywierconymi otworami o średnicy 500 μm.
  2. Umieść miedzianą płytkę na stoliku chłodzącym stroną z olejem immersyjnym skierowaną w dół.
  3. Połącz rurkę kapilarną (tępy koniec) z rurką Tygon o średnicy wewnętrznej 0,7 mm, która z drugiej strony jest połączona ze szklaną strzykawką o pojemności 2 ml (Poulten-Graf, Wertheim, Niemcy).
  4. Przed użyciem rurki kapilarnej sprawdź mały otwór kapilary, aby upewnić się, że ma on odpowiedni rozmiar (patrz: Procedury wstępne).
  5. Powoli wprowadź szklaną kapilarę do przygotowanej probówki z próbką białka IBP (2,4 μM MpIBP-GFP w 20 mM CaCl2 i 25 mM Tris-HCl przy pH 8, szczegóły przygotowania znajdują się w referencji10) i odciągnij tłok szklanej strzykawki, aż w szklanej kapilarze znajdzie się 0,1 μl roztworu białka.
  6. Rozpocznij nagrywanie wideo za pomocą oprogramowania LabVIEW.
  7. Wprowadź ostry koniec szklanej kapilary (zawierającej roztwór białka) do jednego z otworów w miedzianej płytce na stoliku chłodzącym.
  8. Obserwując obraz przez mikroskop (Olympus, Tokio, Japonia, obiektyw 10x), ostrożnie przebij końcówką szklanej kapilary warstwę oleju immersyjnego i (bardzo delikatnie) naciśnij szklaną strzykawkę, aby podać niewielką ilość (~10 nl) roztworu białka w celu utworzenia kropli o rozmiarze 200 μm.
  9. Przykryj otwór w stoliku chłodzącym podwójną warstwą szkiełek nakrywkowych (patrz: Procedury wstępne).

3. Pomiar aktywności TH

  1. Naciśnij przycisk chłodzenia i ustaw temperaturę na -40 °C.
  2. Początkowo kropla roztworu będzie przezroczysta. W niskich temperaturach, zazwyczaj w zakresie od -30 °C do -35 °C, kropla zmienia kolor, co wskazuje na zamarznięcie roztworu. Natychmiast po zamarznięciu próbki powoli zwiększaj temperaturę, aż główna masa lodu zacznie topnieć. Stopniowy wzrost temperatury jest niezbędny, aby uniknąć jej nadmiernego przekroczenia, co mogłoby doprowadzić do całkowitego stopienia próbki.
  3. Przełącz na obiektyw 50x i rozpocznij topnienie lodu poprzez regulację temperatury. Regulacja ta odbywa się w sposób interaktywny, a końcowe etapy są zazwyczaj wykonywane w małych krokach temperaturowych wynoszących 0,002 °C. Kontynuuj topnienie, aż pozostanie pojedynczy kryształ. Końcowy rozmiar kryształu powinien wynosić około 10 μm. Najwyższą temperaturę, przy której topnienie ustało, uznaje się za punkt topnienia; jest ona precyzyjnie wyznaczana na późniejszym etapie analizy wideo.
  4. Ustaw temperaturę na kilka setnych stopnia Celsjusza poniżej punktu topnienia kryształu i rozpocznij rampę temperatury z 10 min opóźnieniem. Dostosuj szybkość rampowania według uznania. W tym czasie kryształ będzie eksponowany na działanie IBPs.
  5. Po upływie 10 min czasu ekspozycji temperatura obniży się automatycznie pod kontrolą rutyny LabVIEW.
  6. Obserwuj kształt kryształu podczas obniżania temperatury. W pewnym momencie może zostać zaobserwowany gwałtowny rozpad kryształu lodu. Temperaturę, przy której to następuje, zapisuje się jako temperaturę rozpadu kryształu.
  7. Wykorzystaj analizę wideo do precyzyjnego wyznaczenia punktu topnienia oraz temperatury rozpadu. Najpierw za pomocą analizy wideo znajdź dokładny punkt topnienia. Należy pamiętać, że za punkt topnienia uznaje się najwyższą temperaturę, przy której topnienie ustało. Odnotuj ten punkt topnienia w programie do arkuszy kalkulacyjnych. Następnie wyznacz dokładną temperaturę rozpadu kryształu i również ją udokumentuj. Różnica między punktem topnienia a punktem zamarzania, czyli temperaturą rozpadu kryształu, stanowi aktywność histerezy termicznej roztworu IBP.

4. Pomiar aktywności TH zależnej od czasu

  1. Należy postępować zgodnie z protokołem opisanym w rozdziałach 3.1-3.3, aby przygotować pojedynczy kryształ lodu.
  2. Po utworzeniu kryształu należy ustawić pożądany czas opóźnienia rampy, a następnie uruchomić rampę.
  3. Po upływie czasu opóźnienia rampy temperatura będzie automatycznie spadać ze stałą prędkością (zgodnie z wymaganiami operatora).
  4. Należy odnotować temperaturę, przy której następuje pęknięcie kryształu. Następnie należy obliczyć czas ekspozycji (czas między utworzeniem kryształu a jego pęknięciem).
  5. Eksperyment należy powtórzyć dla różnych czasów opóźnienia i wykreślić aktywność TH jako funkcję czasu ekspozycji, aby ocenić zależność aktywności TH od czasu.

Wyniki

Pomiar zależności czasu TH

Nanolitrowy osmometr sterowany programem LabVIEW umożliwia precyzyjne pomiary aktywności TH. Stała szybkość obniżania temperatury pozwoliła na pomiar zależności czasu od TH. Precyzyjna kontrola temperatury zapewniona przez nanolitrowy osmometr była kluczowa dla tych eksperymentów. Czas ekspozycji kryształu lodu na IBPs w roztworze definiuje się jako okres od momentu powstania kryształu (koniec procesu topnienia) do gwałtownego wzrostu lodu wokół kryształu (rozprysk kryształu). Stwierdzono, że czas ekspozycji kryształów lodu na IBPs ma kluczowy wpływ na aktywność TH. Krótkie okresy ekspozycji na IBP (kilka sekund) powodowały niską aktywność TH w roztworze MpIBP-GFP (2,4 μM) (Rysunek 5). Aktywność TH wzrastała wraz z czasem ekspozycji na IBP, aż do osiągnięcia plateau przy 4 min ekspozycji na IBP. Przy wyższych stężeniach IBP plateau osiągano w krótszym czasie.

Schemat białka przeciwzamrożeniowego: cząsteczki AFP oddziałują z lodem, aby hamować jego wzrost.
Rycina 1. Schemat ilustrujący IBP zaadsorbowane na lodzie. Adaptacja za zgodą autorów 10.

Układ mikroskopu i chłodzenia termoelektrycznego; schemat i obrazy dla eksperymentów z wzbudzeniem optycznym.
Rysunek 2. Platforma chłodząca. A) Podłączona do rurek na mikroskopie. B) Bez górnego przewodu. C) Schemat blokowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek

Dynamika komórkowa, obraz mikroskopowy, system kontroli temperatury, ustawienie eksperymentu, analiza w czasie rzeczywistym.
Rysunek 3. Zrzut ekranu interfejsu LabVIEW. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Wykres analizy stabilności temperatury, wykres temperatury w funkcji czasu, pokazujący trendy fluktuacji.
Rysunek 4. Wykres stabilności temperatury. Sterownik temperatury został ustawiony tak, aby obniżać temperaturę o 0,01 °C co 15 sec.

Wykres histerezy termicznej przedstawiający zmianę temperatury w czasie, kluczowe dane dla analizy odpowiedzi cieplnej.
Rycina 5. MpIBP aktywność TH w funkcji czasu ekspozycji kryształów lodu na IBP. Każdy punkt czasowy stanowi średnią z 3-6 eksperymentów.

Dyskusja

Niniejsza praca demonstruje działanie sterowanego komputerowo nanolitrowego osmometru, który umożliwia dokładne pomiary aktywności TH przy nadzwyczajnej kontroli temperatury. W każdym systemie wrażliwym na temperaturę należy unikać niepożądanych gradientów temperatury. Aby uniknąć gradientów temperatury w przedstawionym tutaj aparacie, kropla roztworu testowego musi zostać umieszczona w centrum otworu w miedzianym dysku stopnia chłodzącego (krok 2.7). Dodatkowo pojedynczy kryształ powinien znajdować się w centrum kropli, a nie w pobliżu jej krawędzi (w większości przypadków dzieje się to samoistnie). Opisana zależność czasowa wskazuje, że szybkość chłodzenia może wpływać na odczyty TH. Sugerujemy zatem uwzględnienie w raporcie czasu, przez który kryształ był wystawiony na działanie roztworu przed chłodzeniem, a także szybkości chłodzenia. Zazwyczaj oczekiwano 10 min przed obniżaniem temperatury w krokach 0,01 °C co 4 sec.

Stolik chłodzący sterowany programem LabVIEW został przystosowany do pracy z mikroskopem odwróconym, co umożliwiło termiczną manipulację urządzeniami mikroprzepływowymi. System ten ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z wymianą roztworów z udziałem kryształków lodu oraz białek IBPs znakowanych eGFP9, 10, 16. System sterowany przez LabVIEW można dostosować do stolika Clifton poprzez podłączenie kontrolera temperatury 3,040 za pomocą dedykowanego adaptera elektrycznego. Taki system jest wykorzystywany w laboratorium Daviesa17. Oprogramowanie LabVIEW oraz projekt dedykowanego adaptera elektrycznego dla stolika Clifton są dostępne na zapytanie.

Podsumowując, opisaliśmy nanolitrowy osmometr, który umożliwia precyzyjną kontrolę i manipulację temperaturą oraz szybkością jej wzrostu i spadku (z czułością 0,002 °C), skoordynowaną z interfejsem wideo za pomocą procedury LabVIEW w celu analizy w czasie rzeczywistym. System ten pozwala na przeprowadzanie powtarzalnych eksperymentów z kontrolowaną szybkością zmian, które są istotne dla badania kinetyki oddziaływań IBP z lodem. Takie eksperymenty mogą pomóc w rozwiązaniu wielu długo dyskutowanych kwestii dotyczących mechanizmu działania IBP.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez ISF, NSF oraz ERC. Chcielibyśmy podziękować za pomoc techniczną przy przygotowaniu modułu temperaturowego Randy'emu Milfordowi, Michaelowi Korenowi, Dougowi Shaferowi i Jeremy'emu Dennisonowi. Pomoc w opracowaniu oprogramowania zapewnili Or Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy i Sumit Bhattachary. Dziękujemy naszym współpracownikom, prof. Peterowi L. Daviesowi i dr Laurie A. Graham za dostarczenie białka MpIBP oraz pomocne dyskusje. Dziękujemy również członkom laboratorium: dr Mayi Bar-Dolev, Yangzhongowi Qinowi, dr Yeliz Celik, dr Natalyi Pertayi, Ortal Mizrahy i Shlomit Guy za ich uwagi dotyczące użytkowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Olej immersyjny Typ BCargille Laboratories16484
DrieriteW.A. Hammond Drierite043063 2270g
Roztwór czyszczący Micro 90figure-materials-1 Cole-ParmerEW-18100-11
Wytciągacz kapilarNarishigePB-7
Szklane kapilaryBrand GNBH7493 21długość 75 mm, średnica 1,15
Kontroler temperaturyNewport, Irvine, California, United StatesModel 3040Model 3040
Mikroskop świetlnyOlympusModel BH2
Obiektyw 10xOlympusS Plan 10, 0,3, 160/0,17
Obiektyw 50xNikonCF plan, 50X/0,55 EPI ELWD
Kamera CCDProvideoCVC-140
Rurki TygonSaint-Gobain, Paris, FranceTygon Formulation S-50-HL Tubing
Strzykawka szklana (2 ml)Poulten-Graf, Wertheim, Germany7 10227
Karta GPIB-PCINational instruments, Austin, Texas, USA778032-01
Karta przechwytywania obrazu wideo IMAQ-PCI-1407National instruments, Austin, Texas, USA322156B-01
Oprogramowanie do projektowania systemów LabVIEWNational instruments, Austin, Texas, USAVersion 8
Oprogramowanie DiVx AuthorDiVx LLC, San Diego, CA, USA

Bibliografia

  1. DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
  2. Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
  3. Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
  4. Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
  5. Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
  6. Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
  7. Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
  8. Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
  9. Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
  10. Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
  11. Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
  12. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
  13. Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
  14. Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
  15. Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
  16. Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
  17. Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bia ka wi ce l dhistereza termicznasterowanie LabVIEWmikroskopia wideorurka kapilarnarampowanie temperaturygwa towny wzrost kryszta wczas ekspozycjihamowanie rekrystalizacji
Nowoczesny osmometr nanolitrowy sterowany programem LabVIEW do badań nad białkami wiążącymi lód
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.