Pomimo wyjątkowych właściwości mechanicznych i biochemicznych jedwabiu pająków, materiał ten nie może być pozyskiwany w dużych ilościach metodami konwencjonalnymi. W niniejszej pracy opisujemy efektywną strategię przędzenia sztucznych włókien jedwabiu pająka, co stanowi istotny proces dla badaczy analizujących produkcję jedwabiu pająków oraz jego zastosowanie jako biomateriałów nowej generacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z postępem społecznym i kurczeniem się zasobów, coraz ważniejsze staje się rozwijanie nowych technologii pozwalających na projektowanie biomateriałów nowej generacji o wysokich parametrach użytkowych. Opracowywanie tych nowych materiałów konstrukcyjnych musi być szybkie, kosztowo efektywne i opierać się na metodologiach przetwórstwa oraz produktach przyjaznych dla środowiska i zrównoważonych. Pająki przędą wiele różnych rodzajów nici o zróżnicowanych właściwościach mechanicznych, co stanowi bogate źródło materiałów inżynieryjnych nowej generacji dla biomimetyki, które mogą konkurować z najlepszymi materiałami syntetycznymi i naturalnymi. Ponieważ gromadzenie dużych ilości naturalnego jedwabiu pajęczego jest niepraktyczne, produkcja jedwabiu syntetycznego umożliwia naukowcom dostęp do nieograniczonych zasobów nici. W związku z tym, jeśli proces przędzenia zostanie usprawniony i dopracowany, sztuczne włókna pajęcze mogą znaleźć szerokie zastosowanie, od pancerzy ochronnych, szwów chirurgicznych, lin i kabli, przez opony i struny instrumentów muzycznych, aż po kompozyty dla lotnictwa i technologii kosmicznych. Aby udoskonalić proces produkcji syntetycznego jedwabiu i uzyskać włókna o niskiej zmienności właściwości materiałowych między poszczególnymi cyklami przędzenia, opracowaliśmy protokół przędzenia na mokro, który integruje ekspresję rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego w bakteriach, oczyszczanie i zagęszczanie białek, a następnie ekstruzję włókien oraz mechaniczną obróbkę po przędzeniu. Jest to pierwsza prezentacja wizualna ukazująca krok po kroku proces przędzenia i analizy sztucznych włókien jedwabnych w skali laboratoryjnej. Przedstawia ona również szczegółowe zasady minimalizowania zmienności między włóknami przędzionymi z tej samej masy przędzalniczej. Wspólnie metody te przyspieszą proces produkcji sztucznego jedwabiu, prowadząc do uzyskania włókien o wyższej jakości, które przewyższą naturalny jedwab pajęczy.
Wprowadzenie
Pajęcza sieć posiada nadzwyczajne właściwości mechaniczne, które przewyższają wiele materiałów wytworzonych przez człowieka, w tym stal wysokowytrzymałą, Kevlar i Nylon.1 Pająki przędą co najmniej 6-7 różnych typów włókien o zróżnicowanych właściwościach mechanicznych, z których każde charakteryzuje się różnym stopniem wytrzymałości na rozciąganie i rozciągliwością, aby pełnić określone funkcje biologiczne.2 Naukowcy intensywnie dążą do wykorzystania pajęczej sieci jako biomateriałów nowej generacji ze względu na ich wybitne właściwości mechaniczne, biokompatybilność oraz nietoksyczny i ekologiczny charakter.3,4 Ze względu na kanibalistyczną i jadowitą naturę pajęczaków, pozyskiwanie pajęczej sieci poprzez hodowlę nie jest praktyczną strategią pozwalającą na zaspokojenie zapotrzebowania niezbędnego do produkcji na skalę przemysłową. Dlatego naukowcy zwrócili się ku produkcji rekombinowanych białek jedwabiu w organizmach transgenicznych, połączonej z przędzeniem włókien syntetycznych in vitro z tych oczyszczonych białek.5-8 Ekspresja pełnowymiarowych rekombinowanych białek pajęczego jedwabiu była trudna technicznie ze względu na immanentne właściwości ich sekwencji genowych, do których należą: wysoce powtarzalna natura i długość fizyczna (>15 kb), wysoka zawartość par GC oraz stronnicze wykorzystanie kodonów alaniny i glicyny.9-11 Do tej pory większość laboratoriów koncentrowała się na ekspresji skróconych form głównych białek jedwabiu ampulacyjnego MaSp1 lub MaSp2, wykorzystując częściowe sekwencje cDNA lub geny syntetyczne.12-15 Przędzenie syntetycznej pajęczej sieci jest wymagającym procesem, który wymaga biegłości i wiedzy z kilku dyscyplin naukowych, a zawiłości procesu przędzenia nie zostały w pełni zaprezentowane szerokiej publiczności w formie wideo. W rzeczywistości tylko nieliczne laboratoria na świecie posiadają wiedzę specjalistyczną pozwalającą na ekspresję cDNA pajęczego jedwabiu, oczyszczanie białek jedwabiu, przędzenie włókien syntetycznych, przeprowadzanie wyciągania po przędzeniu, a na koniec badanie ich właściwości jako biomateriału.8, 16,17 Różne podejścia do przędzenia włókien syntetycznych obejmowały przędzenie na mokro i na sucho, a także metody elektroprzędzenia.16,18,19 Wszystkie te procedury mają jeden wspólny cel – opracowanie protokołu, który pozwoli na otrzymanie syntetycznej pajęczej sieci o właściwościach mechanicznych dorównujących naturalnym niciom, z myślą o wielkoskalowych procesach produkcji komercyjnej.
Opisujemy tutaj procedurę wytwarzania sztucznych pajęczych nici w skali laboratoryjnej przy użyciu metody przędzenia na mokro. W porównaniu z innymi metodami przędzenia, przędzenie na mokro pozwoliło uzyskać najbardziej spójne wyniki w analizie włókien. Przedstawiamy tę procedurę, zaczynając od ekspresji rekombinowanych białek jedwabiu w bakteriach, a następnie ich oczyszczania, po czym opisujemy etapy przygotowania białek do przędzenia, w tym metodę rozciągania włókien „surowych” (po przędzeniu), co pozwala na uzyskanie nici o właściwościach materiałowych zbliżonych do jakości naturalnych pajęczych jedwabi. Nasza metodologia została zaprojektowana tak, aby ściśle naśladować naturalny proces przędzenia włókien jedwabiu i w dużym stopniu opiera się na naszej wiedzy dotyczącej architektury i funkcji gruczołów produkujących jedwab u pająków tkających sieci koliste i nieregularne.20-22 Ponadto, na koniec przedstawiamy niezbędne kroki w celu określenia właściwości materiałowych włókien syntetycznych przy użyciu tensometru do wykreślenia krzywych naprężenie-odkształcenie, które pozwalają badaczom obliczyć wytrzymałość doraźną, odkształcenie krytyczne oraz udarność włókien. Ostatnim, lecz niezwykle istotnym aspektem jest fakt, że urządzenia do przędzenia, nawijania i wyciągania mogą zostać zbudowane samodzielnie z części dostępnych w handlu, zamiast zakupić złożony i kosztowny sprzęt wykonany na zamówienie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przegląd graficzny: Biomimetyka procesu przędzenia
Biomimetyka naturalnej ścieżki produkcji pajęczego jedwabiu: droga do wytwarzania jedwabiu syntetycznego. Na tym obrazie przedstawiono główną gruczoł ampullate pająka tkacz złotawy, Nephila clavipes, oraz komponenty wykorzystywane do naturalnej produkcji jedwabiu (biały tekst). Region ogona syntetyzuje duże ilości białek jedwabnych, które są transportowane do ampulli, będącej regionem magazynowania masy przędzalnej. Ta skoncentrowana masa jest wyciskana przez przewód przędzalny, gdzie roztwór ulega wymianom jonowym i dehydratacji przed ekstruzją włókna. Procesy biomimetyczne stosowane w naszym laboratorium są wskazane czerwonym tekstem. Produkcja rekombinowanego jedwabiu odbywa się przy użyciu bakterii transgenicznych, a następnie następuje oczyszczanie białka metodą chromatografii. Następnie oczyszczone białko poddawane jest liofilizacji w celu skoncentrowania materiału. Na koniec białko jest ponownie rozpuszczane w HFIP i wyciskane z igły strzykawki do kąpieli izopropanolowej.
1. Konstrukcja plazmidu i przygotowanie hodowli komórek bakteryjnych
- Przeprowadzić PCR, wykorzystując odpowiednie cDNA jedwabiu pająka i specyficzne zestawy starterów. Wyekstrahować z żelu i ligować amplifikowane cDNA do prokariotycznego wektora ekspresyjnego, np. pBAD/TOPO ThioFusion (Rys. 1A). Wektor ten posiada N-końcowy znacznik tioredoksyny ułatwiający solubilizację białek jedwabiu oraz C-końcowy znacznik 6x his do oczyszczania białek. Przetransformować produkty ligacji do kompetentnych komórek E. coli.
- Wyselekcjonować kolonie zawierające rekombinowany wektor klonujący i wykorzystać jedną kolonię do szczepienia 200 mL sterylnego LB z dodatkiem ampicyliny (Rys. 1B). Hodować kulturę przez noc do osiągnięcia nasycenia, inkubując w wytrząsacu orbitalnym przy 200 rpm w temperaturze 37 °C.
- Połączyć 200 mL nasyconej kultury z 800 mL świeżej kultury LB. Indukować ekspresję białka jedwabiu pająka przez 4 godziny poprzez dodanie 0,2% arabinozy (w/v). Należy pamiętać o utrzymaniu kultury pod selekcją antybiotykową.
- Odwirować komórki przy 16 000x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (Rys. 1C). Dla uproszczenia osadzić całą objętość w jednym naczyniu. W zależności od pojemności probówek do wirowania konieczne może być wykonanie kilku etapów centryfugacji. W razie potrzeby zlać ciecz po wirowaniu i ponownie osadzić pozostały materiał, aby cały osad komórkowy znalazł się w jednym naczyniu. Osady komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
- Przed utylizacją zużytej pożywki dodać wybielacz lub poddać autoklawowaniu w celu sterylizacji.
2. Lizaza komórek
- Do osadu komórkowego o objętości 1 L dodać 20 mL buforu lizującego 1x (Rys. 2A). Należy upewnić się, że osad komórkowy został całkowicie resuspendowany.
- Dodać lizozym do uzyskania stężenia 1 mg/mL, aby wspomóc dalszą lizę komórek. Na tym etapie można również dodać DNazę w celu trawienia DNA chromosomalnego, co pomoże zmniejszyć lepkość roztworu. Próbkę umieścić na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie mieszać przez 20 min.
- Sonicować roztwór z maksymalną mocą przez 1 minutę.
- W celu sklarowania roztworu odwirować go przy 16 000x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (Rys. 2B).
3. Oczyszczanie białka: chromatografia powinowactwa na kolumnie Ni-NTA
- Usunąć supernatant i przenieść go do czystej kolumny chromatograficznej o pojemności 25 mL. Upewnić się, że supernatant nie jest lepki i jest klarowny. Jeśli roztwór jest lepki i mętny, dodać więcej DNazy lub poddać go sonikacji i/lub ponownie odwirować supernatant (powtórzyć kroki 2.3-2.4).
- Do kolumny dodać 1 mL zawiesiny Ni-NTA (0,5 mL kulek). Szczelnie zamknąć korek i kranik, a następnie umieścić kolumnę na wstrząsacu na 1 godzinę w celu równoważenia, aby umożliwić związanie znacznika 6x his-tag z kulkami Ni-NTA (Rys. 3A).
- Ustawić kolumnę pionowo na statywie i odczekać około 2 minut, aż kulki Ni-NTA opadną. Gdy kulki całkowicie opadną, na dnie widoczna będzie jasnoniebieska warstwa.
- Zdjąć korek i pozwolić roztworowi przepłynąć przez kranik. Zebrać ten roztwór do dalszej analizy (Rys. 3B).
- Dodać 20 mL 1x buforu do płukania i odczekać, aż kulki opadną. Otworzyć kranik i pozwolić roztworowi przepłynąć. Zebrać ten roztwór w czterech alikwotach po 5 mL do dalszej analizy. Uwaga: Można zastosować dodatkowe objętości płukania w celu zmniejszenia ilości białek zanieczyszczających, jednak istnieje ryzyko zmniejszenia końcowej wydajności białka.
- Dodać 20 mL 1x buforu elucyjnego i odczekać, aż żywica opadnie. Otworzyć kranik i pozwolić roztworowi przepłynąć. Zebrać ten roztwór w czterech alikwotach po 5 mL do dalszej analizy. Uwaga: Jeśli elucja nie została zakończona, z żywicy Ni-NTA można zebrać dodatkowe objętości eluatu.
- Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -80 °C odpowiednio do krótkoterminowego lub długoterminowego przechowywania.
- Przeprowadzić frakcjonowanie próbek według wielkości za pomocą analizy SDS-PAGE. Wizualizować białka przy użyciu srebra lub Coomassie Brilliant Blue R-250 (Rys. 3C). Do kolejnych etapów należy używać wyłącznie czystych frakcji. Uwaga: Do potwierdzenia tożsamości oczyszczonego białka można zastosować analizę Western blot.
4. Dializa i liofilizacja
- Dializować próbki przeciwko co najmniej 100-krotnej objętości próbki (używając wody dejonizowanej) przez 2 dni. Wymieniać roztwór wody co 6 godzin w celu usunięcia wszystkich soli. Uwaga: Próg odcięcia masy cząsteczkowej membrany do dializy zależy od wielkości rekombinowanego białka jedwabiu.
- Zważyć sześć pustych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i zapisać ich masy. Przed ważeniem na potrzeby liofilizacji pomocne może być wykonanie małych otworów lub nacięć w zakrętkach probówek, aby ułatwić proces liofilizacji (Ryc. 4A).
- Po dializie przenieść 1 mL zdializowanej próbki do każdej z 6 wcześniej zważonych probówek do mikrowirówki (Ryc. 4B). Próbki zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie, a następnie wysuszyć za pomocą liofilizatora (Ryc. 4C).
- Po wysuszeniu przenieść kolejny 1 mL zdializowanej próbki do każdej z sześciu probówek. Powtarzać czynność, aż cała zdializowana próbka zostanie wysuszona w probówkach do mikrowirówki.
- Próbki liofilizowane można przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego magazynowania.
5. Przygotowanie przędzalnego roztworu polimeru
- Zważ każdą z probówek do mikrocentryfugi zawierającą wysuszony proszek białkowy. Odejmij początkową masę pustych probówek, aby otrzymać całkowitą masę suchego białka. Uwaga: W zależności od wydajności białka, może być konieczne oczyszczenie dodatkowego materiału do procesu wirowania.
- Oblicz objętość heksafluorizopropanolu (HFIP), którą należy dodać do każdej probówki, aby uzyskać stężenie od 200 mg/mL do 500 mg/mL, czyli od 20% do 50% masy w objętości. Dodaj odpowiednią ilość HFIP do każdej probówki (Rys. 4D). Uwaga: HFIP jest substancją wysoce lotną i toksyczną; należy pipetować ostrożnie i zakręcić probówkę tak szybko, jak to możliwe. HFIP należy obsługiwać pod wyciągiem laboratoryjnym.
- Zabezpiecz probówki Parafilmem i umieść na kołysce, aby rozpuścić białko. Co jakiś czas mieszaj w wortexie i wiruj, aby ułatwić solubilizację. Proces ten może trwać do 2 dni.
6. Przygotowanie strzykawki i konfiguracja aparatury
- Nabrać co najmniej 25 μL rozpuszczonego roztworu przędzalnego do strzykawki. Należy upewnić się, że nie występują żadne agregaty, ponieważ mogą one zapchać strzykawkę. Uwaga: Próbka ta jest niezwykle lepka, dlatego należy zachować ostrożność podczas pipetowania.
- Przetłoczyć roztwór pionowo do przodu strzykawki, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza (Rys. 5A). Uwaga: Pęcherzyki powietrza powodują niejednorodności w włóknie.
- Zamocować strzykawkę do pompy. Podnieść zlewkę o pojemności 400 mL wypełnioną 95% izopropanolem tak, aby końcówka strzykawki znajdowała się tuż pod powierzchnią alkoholu (Rys. 5B).
- Ustawić pompę strzykawkową na 15 μL/min i uruchomić program. Pozostawić otrzymane włókno w izopropanolu na 20 minut w celu pełnej równowagi. Uwaga: Włókna te mogą być nadal wykorzystane w analizie MS/MS do potwierdzenia tożsamości białek zawartych we włóknach.
7. Pobieranie osadu i próbek po wirowaniu
- Naklej dwustronną taśmę po obu stronach grzebienia w urządzeniu do nawijania. Urządzenie do nawijania powstało poprzez przyklejenie metalowych grzebieni do suwmiarki cyfrowej (Rys. 6A). Przymocuj urządzenie do nawijania do silnika (Rys. 6B). Zaleca się nawijanie nici z prędkością 2 rpm. Uwaga: szybsze tempo nawijania prowadzi do dużych różnic w jakości włókien i powtarzalności wyników.
- Za pomocą pęsety delikatnie chwyć jeden koniec włókna i powoli wyciągnij je z izopropanolu, mocując do krawędzi jednego z ramion grzebienia na szpuli (Rys. 6C). Kolejne kroki należy wykonać bez przerwy, aby zapobiec wysychaniu włókien.
- Włącz silnik i delikatnie prowadź włókno na urządzeniu do nawijania. Uwaga: podczas nawijania nie dopuszczaj do nakładania się włókien i ich piętrzenia.
- Po nawinięciu całego włókna odłącz szpulę od silnika i nałóż klej na krawędź każdego włókna jedwabnego na dwustronnej taśmie (Rys. 6D). Pozwala to na utrwalenie jedwabiu pająka na aparaturze. Uwaga: nałożenie kleju na dwustronną taśmę przed rozciąganiem po przędzeniu zapobiega przesuwaniu się całego włókna i umożliwia selektywne rozciąganie wewnętrznych segmentów włókien w obrębie ramion suwmiarki.
- Przymocuj szpulę do siłownika liniowego (Rys. 7A). Zmierz za pomocą suwmiarki początkową długość włókien. Należy pamiętać, że jest to długość wewnętrzna włókna; nie obejmuje ona długości zaklejonej i owiniętej wokół szpuli.
- Zanurz szpulę w kąpieli z 75% izopropanolu. Pozostaw włókna na 10 minut w celu osiągnięcia równowagi. Uwaga: w procesie przędzenia można zastosować inne roztwory odwadniające, takie jak metanol, aceton i siarczan amonu.
- Ustaw prędkość siłownika liniowego na 1,5 mm/sec. Na podstawie długości początkowej oblicz długość końcową dla pożądanego stopnia rozciągania po przędzeniu. Stopień rozciągnięcia można kontrolować za pomocą prędkości lub długości, w zależności od konfiguracji. Na przykład, przy długości początkowej 15 mm i pożądanym stopniu rozciągania po przędzeniu 3x, długość końcowa powinna wynosić 45 mm. Można to również obliczyć jako pracę siłownika liniowego przez 20 sekund przy prędkości 1,5 mm/sec.
- Po zakończeniu pożądanego rozciągania po przędzeniu powoli wyjmij szpulę z izopropanolu. Pozostaw krople izopropanolu do wyschnięcia przez 1 minutę, a następnie pobierz próbki (Rys. 7B). Próbki do celów testowych powinny zostać zamocowane na ramkach z brystolu lub folii.
- Jeśli wymagane są dalsze stopnie rozciągania po przędzeniu, ponownie zanurz szpulę w kąpieli z 75% izopropanolu. Pozostaw włókna na 10 minut w celu osiągnięcia równowagi, a następnie przejdź do kolejnego stopnia rozciągania po przędzeniu.
8. Badanie rozciągania
- Przed badaniami mechanicznymi należy pozwolić zebranym próbkom na wyrównanie parametrów do standardowych warunków laboratoryjnych przez co najmniej 1 godzinę. Należy zapisać wilgotność i temperaturę, ponieważ mogą one wpływać na właściwości mechaniczne włókien. Standardowe warunki wilgotności i temperatury powinny wynosić odpowiednio około 40% i 25 °C.
- Przykleić krawędzie brystolu lub folii, aby unieruchomić włókno na ramce. Należy odnotować rozmiar otworu w ramce. Jest to początkowa długość badanego włókna. Tutaj przedstawiono ramkę z otworem o wymiarach 1 inch (25,4 mm) (Rys. 8A).
- Za pomocą mikroskopu świetlnego z powiększeniem 100x lub większym należy dokonać pomiarów średnicy wzdłuż osi podłużnej włókna. Należy zapisać co najmniej 3 pomiary. Im większe zastosowane powiększenie i im więcej wykonanych pomiarów, tym lepsza dokładność.
- Mocno przymocować ramkę do ramy obciążeniowej tensometru (Rys. 8B). Przeciąć ramkę po obu stronach, tak aby naprężenie przenosiło się wyłącznie przez włókno. Wytarować tensometr i zebrać dane. Zaleca się standardową prędkość odkształcania na poziomie 2% na sekundę.
- Na podstawie zebranych danych oraz średniej średnicy można wykreślić krzywą naprężenie-odkształcenie.
- Przerwane włókno można teraz zamocować na uchwycie (stubie) skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) w celu przeprowadzenia analiz morfologicznych i pomiarów średnicy w punkcie zerwania. Segment włókna oddalony od punktu zerwania może służyć do oszacowania i sprawdzenia początkowej średnicy zmierzonej za pomocą mikroskopu świetlnego.
9. Reprezentatywne wyniki
Po kroku 3 poszczególne frakcje należy poddać analizie SDS-PAGE, a białka zwizualizować za pomocą barwienia srebrem lub Coomassie Brilliant Blue R-250. Przy standardowych warunkach dla kolumny Ni-NTA można uzyskać frakcje elucyjne o czystości >90% (Rys. 9). Niewielkie ilości białek zanieczyszczających można usunąć poprzez obszerną dializę. Używając 25 μL roztworu przędzalnego o stężeniu 20% (w/v), z ciągłego włókna nawiniętego na szpulę można zebrać co najmniej 30 oddzielnych próbek włókien (przy założeniu wykorzystania początkowej długości 13 mm). Właściwości mechaniczne można przeanalizować za pomocą testów tensometrycznych (Rys. 10). W zależności od zastosowanego w procesie przędzenia rekombinowanego białka jedwabiu, maksymalne współczynniki rozciągania po przędzeniu będą wymagały empirycznego oznaczenia. Zazwyczaj można osiągnąć współczynniki rozciągania po przędzeniu rzędu 4.0x bez przerwania włókna (Rys. 10). Przędzone włókna, przed lub po rozciąganiu, można analizować za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego w celu wizualizacji ultrastruktury (Rys. 11A,B). Przędzone włókna mogą być również wykorzystane do testów mechanicznych, wykazując wyniki o niskiej wariancji w obrębie grupy próbek o tym samym współczynniku rozciągania po przędzeniu (Rys. 10).
Rysunek 1. Ekspresja cDNA jedwabiu pająka w bakteriach. A) Wektor pBAD TOPO/Thio zawierający interesujące cDNA jedwabiu pająka jest transformowany do kompetentnych komórek E. coli. B) Pojedynczą kolonię inokuluje się do 200 mL LB i hoduje przez noc do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Po inokulacji dodaje się 800 mL świeżego LB, a kulturę indukuje się do ekspresji przy użyciu arabinozy. C) Po zakończeniu indukcji kulturę poddaje się wirowaniu w celu otrzymania pelletu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 2. Liza komórek bakteryjnych po indukcji białka jedwabiu pająka. A) Do osadu komórkowego dodaje się 20 ml buforu do lizy 1x oraz DNazę, następnie próbkę umieszcza się na wytrząsarce orbitalnej i poddaje sonikacji w celu lizy komórek. B) Lizat komórkowy jest wirowany w wirówce w celu oczyszczenia naddatku z debris komórkowych, a następnie naddatek zostaje zebrany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.
Rysunek 3. Oczyszczanie rekombinowanych białek pajęczej jedwabiu za pomocą chromatografii powinowactwa. A) Nadpływ lizatu komórkowego oraz kulki Ni-NTA są dodawane do kolumny chromatograficznej i inkubowane przez 1 godzinę. B) Po zebraniu frakcji przepływowej, kolejno zastosowano 20 mL buforu płuczącego i 20 mL buforu elucyjnego, zbierając frakcje o objętości 5 mL. C) Różne frakcje są analizowane metodą SDS-PAGE; czyste próbki zawierające docelowe białko są przenoszone do worka dializacyjnego i dializowane przeciwko wodzie DI do zakończenia procesu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 4. Przygotowanie oczyszczonego białka pajęczej jedwabiu do przędzenia na mokro. A) Produkt po dializie jest przenoszony do wcześniej zważonych probówek wirówkowych w alikwotach 1 mL. B) Alikwoty 1 mL są szybko mrożone w ciekłym azocie. C) Zamrożone próbki są liofilizowane, a następnie dodawane są kolejne próbki po dializie. D) Obliczana jest masa suchej substancji, a do suchego proszku dodaje się HFIP w celu przygotowania 20% (w/v) roztworu przędzalnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 5. Napełnianie szklanej strzykawki roztworem przędzalnym do procesu przędzenia na mokro. A) Trzymając strzykawkę pionowo, roztwór przędzalny jest wypychany do górnej części kolumny strzykawki w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. B) Napełniona strzykawka zostaje podłączona do pompy strzykawkowej i opuszczona do kąpieli z 95% izopropanolu tak, aby końcówka znajdowała się tuż nad powierzchnią kąpieli.
Rycina 6. Nawijanie syntetycznych włókien pajęczego jedwabiu na niestandardowe urządzenie nawijające. A) Urządzenie nawijające zostało zbudowane z suwmiary cyfrowej z przymocowanymi metalowymi grzebieniami. Po obu stronach grzebienia zastosowano dwustronną taśmę w celu przymocowania końców włókien. B) Szpula została przymocowana do silnika o niskiej prędkości za pomocą klipsa krokodylka. C) Włókno jest powoli wyciągane z kąpieli alkoholowej i nawijane na szpulę. D) Na krawędź każdego segmentu włókna nałożono klej, aby utrzymać je na miejscu. Przedstawiono dwa różne włókna otrzymane z różnych białek.
Rysunek 7. Wyciąganie włókien syntetycznych po przędzeniu przy użyciu własnoręcznie wykonanego urządzenia. A) Urządzenie do nawijania jest przymocowane do układu siłownika liniowego za pomocą żabek elektrycznych. B) Po etapie wyciągania po przędzeniu szpula zostaje wyjęta z kąpieli. Krople izopropanolu odparowują przed zebraniem włókien.
Rysunek 8. Montaż syntetycznych włókien jedwabiu na tekturze do badań mechanicznych. A) Zebrane włókna są montowane na tekturowych ramkach z wycięciem o wymiarach 1" x 1". Włókna są początkowo utrzymywane na miejscu za pomocą taśmy dwustronnej, a następnie utrwalone klejem. B) Tekturowa ramka jest mocowana do tensometru. Następnie boki są wycinane tak, aby naprężenie działało tylko na włókno.
Rysunek 9. Frakcjonowanie wielkościowe oczyszczonych frakcji rekombinowanego białka MaSp1 za pomocą analizy SDS-PAGE, a następnie wizualizacja poprzez barwienie srebrem. Marker białkowy przedstawiono w kDa. Dwie próbki z płukania wykazują niespecyficzne wiązanie z kuleczkami, natomiast próbki z elucji wskazują na konieczność zebrania 6 frakcji w celu zapewnienia całkowitego odzysku białka.
Rycina 10. Krzywe naprężenie-odkształcenie włókien przędzonych z rekombinowanych białek TuSp1.8 Kolory reprezentują włókna poddane różnym współczynnikom wyciągania po przędzeniu, w zakresie od 2,5x do 6x. Włókna wykazują niewielką zmienność w obrębie swojej grupy współczynnika; wraz ze wzrostem współczynników wyciągania po przędzeniu zwiększa się wytrzymałość włókna, natomiast zmniejsza się jego rozciągliwość.
Rysunek 11. Obrazy z rozpylnej mikroskopii elektronowej włókien przędzionych z rekombinowanych białek TuSp1. A) Przy powiększeniu 500x widoczna jest gładka powierzchnia zewnętrzna. B) Przy powiększeniu 5000x można zaobserwować gęsty rdzeń wewnętrzny w miejscu naturalnego przełamania włókna.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Włókna syntetyczne przędzone zgodnie z tą metodologią wykazują właściwości mechaniczne z tego samego rzędu wielkości co włókna naturalne. Dzięki zmechanizowaniu procesów nawijania i wyciągania po przędzeniu, co ogranicza wpływ błędu ludzkiego, zmienność eksperymentalna między próbkami jest lepiej kontrolowana i znacznie zredukowana.
Nasza metodologia stwarza możliwość zbadania właściwości mechanicznych innych włókien przędzionych z białek rekombinowanych, kodowanych przez cDNA innych członków ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez granty NSF RUI MCB-0950372 oraz DMR-1105310 zatytułowane odpowiednio „Molecular Characterization of Black Widow Spider Silks” oraz „Mechanical Behavior of Spider Glue Silks”.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do ekspresji pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| Odczynnik do lizy komórek FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Agaroza Ni-NTA | Qiagen | 30210 | Zawiera instrukcje dotyczące buforów |
| Zestaw do barwienia srebrem ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| Liofilizator FreeZone | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Heksafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Strzykawka | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Igła | Hamilton | 7780-01 | Rozmiar 26s Gauge, igła z tępym końcem, zdejmowalna |
| Pompa strzykawkowa | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Suwmiarka cyfrowa | Carrera | CP5906 | Zakres 0-150 mm |
| Pinceta ze stali nierdzewnej | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Silnik | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, prędkość 2 rpm |
| Siłownik liniowy | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, zakres 6 cali |
| Mikroskop sekcyjny | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Cyfrowa kamera do mikroskopu | Leica Microsystems | DFC320 | Oprogramowanie: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Nożyczki Vannasa | World Precision Instruments | 500260 | |
| Mikrotensometr | Aurora Scientific | 310C | System dwutrybowy 5N |
Bibliografia
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382(2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
