Oczyszczanie zygot S. cerevisiae metodą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

W celu oczyszczenia zygot S. cerevisiae, zmodyfikowano komórki haploidalne o przeciwnych typach matingowych tak, aby wykazywały ekspresję czerwonych lub zielonych białek fluorescencyjnych, a następnie poddano je wspólnej inkubacji w celu umożliwienia tworzenia zygot i frakcjonowania zgodnie z protokołem opartym na cytometrii przepływowej. Wysoce wzbogacona frakcja umożliwia późniejsze badania „omiczne”, odzyskanie początkowego potomstwa oraz systematyczne badanie morfogenezy zygot.

Streszczenie

Zygoty są kluczowymi ogniwami pośrednimi między stanem haploidalnym a diploidalnym w cyklu życiowym wielu organizmów, w tym drożdży (Rysunek 1) ¹. Zygoty S. cerevisiae powstają w wyniku fuzji komórek haploidalnych o różnych typach kojarzenia (MATa, MATalpha) i dają początek odpowiednim stabilnym diploidom, które w wyniku niezwykle asymetrycznych podziałów mitotycznych sukcesywnie generują nawet 20 diploidalnych potomków ². Tworzenie zygot jest sterowane przez złożony ciąg zdarzeń: w procesie tym rozpuszczalne czynniki kojarzenia wiążą się z pokrewnymi receptorami, wyzwalając kaskady sygnałowe pośredniczone przez receptory, co ułatwia przerwanie cyklu komórkowego i kulminuje w fuzji komórka-komórka. Zygoty mogą być uznane za model funkcji komórek progenitorowych lub macierzystych.

Mimo że na temat powstawania zygot uzyskano wiele informacji, a same zygoty służyły do badania kwestii komórkowo-molekularnych o ogólnym znaczeniu, niemal wszystkie badania opierały się na mieszaninach kopulacyjnych, w których zygoty były wymieszane z przeważającą populacją komórek haploidalnych ^3-8. W związku z tym wiele aspektów biochemii powstawania zygot oraz dalszego życia zygoty pozostaje niezbadanych.

Opisy oczyszczania zygot drożdżowych przedstawiają protokoły oparte na ich właściwościach sedymentacyjnych ⁹; jednak ta procedura oparta na sedymentacji nie pozwoliła nam uzyskać czystości na poziomie bliskim 90%. Ponadto posiada ona wadę polegającą na wystawieniu komórek na działanie hipertonicznego sorbitolu. Opracowaliśmy zatem uniwersalną procedurę oczyszczania. W tym celu pary komórek haploidalnych wykazujących ekspresję czerwonych lub zielonych białek fluorescencyjnych poddano wspólnej inkubacji w celu umożliwienia formowania zygot, zebrano je w różnych odstępach czasu, a otrzymane zygoty oczyszczono za pomocą protokołu sortowania opartego na cytometrii przepływowej. Technika ta zapewnia wygodną wizualną ocenę czystości i stopnia dojrzewania. Średnia czystość frakcji wynosi około 90%. W zależności od czasu zbioru można odzyskać zygoty o różnym stopniu dojrzałości. Oczyszczone próbki stanowią dogodny punkt wyjścia dla badań „omicznych”, odzyskiwania pierwotnego potomstwa oraz systematycznego badania tej komórki progenitorowej.

Protokół

1. Wzrost komórek haploidalnych

1. Hodować komórki S. cerevisiae szczepu S288C (BY4741) w warunkach standardowych ¹⁰.
2. Przeprowadzić transformację haploidów w celu ekspresji jednego z dwóch wyraźnych markerów fluorescencyjnych ¹⁰. Wybranymi markerami są rozpuszczalne GFP ekspresowane w cytoplazmie (pEG220, URA3/YIp, linearyzowane za pomocą BglII ¹¹) oraz pojedyncze białko rybosomalne RPL25 połączone z mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, od A. Johnston). Przewiduje się, że równoważne protokoły oczyszczania dwukolorowego mogą wykorzystywać inne silnie fluorescencyjne białka syntetyzowane przez haploidalne komórki rodzicielskie. Alternatywnie można zastosować znakowanie ściany komórkowej fluorescencyjnymi lektynami.
3. W dniu poprzedzającym oczyszczanie zygot, zaszczepić kultury o objętości 5 ml każdego typu komórek i hodować je z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 23 °C, aż do osiągnięcia wartości A600 nieprzekraczającej 1.0. Transformanty GFP (ATY4442) hodować w pełnym medium syntetycznym z dodatkiem 2% glukozy (CSM-glucose), a transformanty RPL25-mCherry (ATY4552) w syntetycznym medium selektywnym pozbawionym uracylu ¹⁰. Utrzymywać równoległe kultury każdego typu komórek z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.

2. Przeprowadzenie krzyżowania

1. Dostosuj gęstość optyczną (A600) każdej próbki do wartości 1,0 w świeżej pożywce. [1 jednostka gęstości optycznej ~ 3 x 10⁷ komórek/ml]
2. Wymieszaj równe objętości obu kultur, krótko wierzcieksuj 3 razy, a następnie wierzcieksuj raz dłużej przez 10 s.
3. Przygotuj płytki z pożywką CSM z glukozą. Płytki są identyczne z tymi używanymi do rutynowej hodowli i zostały wysuszone przez 45 min po wylaniu i zestaleniu agaru ¹⁰.
4. Nanieś do dwudziestu kropel mieszaniny o objętości 40 µl każda w odległości 1 cm od krawędzi powierzchni płytek CSM z glukozą. W momencie naniesienia pierwszych kropel na powierzchnię uruchom stoper, aby mierzyć upływ czasu. Po wchłonięciu cieczy (około 30 min) przykryj płytki i pozostaw je w temperaturze pokojowej.

3. Przygotowanie do zbioru

1. Zebierz próbki po 1,75-2,5 h w temperaturze 23 °C, wielokrotnie wypłukując pojedyncze wysuszone kropelki z płytki przy użyciu 150 ml zimnego CSM-glucose, utrzymując płytki w lodzie. Wypłukuj obszar z kropelkami 10-20 razy tym samym medium, aby zmaksymalizować odzysk. Zbierz materiał do probówek Falcon 15 ml w lodzie.
2. Sonicuj próbki za pomocą sonikatora sondowego 10 razy przy amplitudzie 60% przy użyciu sonikatora Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) w lodzie.
3. Zweryfikuj w mikroskopie fazowym, czy pozostało niewielka liczba agregatów lub czy nie ma ich wcale. Na tym etapie spodziewane jest, że od 15-50% komórek utworzyło zygoty.
4. Pozostaw probówkę z komórkami w pozycji pionowej, bez poruszania, w lodzie przez 10 min jako dodatkowy środek ostrożności (aby umożliwić osadzenie się agregatów).
5. Odzyskaj górne 90% objętości i przefiltruj ją przez siatkę nylonową (probówka BD Falcon z polipropylenu z nakrętką z filtrem (Ref 352235)). W typowym eksperymencie 10⁷ komórek odzyskanych z jednej płytki zostało na tym etapie rozcieńczone w 4 ml CSM-glucose.

4. Cytometria przepływowa

1. Przeprowadź sortowanie komórek przy użyciu cytometru przepływowego Sony iCyt Reflection Model, (Highly Automated Parallel Sort) HAPS1 z końcówką 100 µm. Do wzbudzenia GFP należy użyć niebieskiego lasera argonowo-jonowego o mocy 250 mW i długości fali 488 nm. Do wzbudzenia mCherry należy użyć lasera o mocy 100 mW i długości fali 561 nm. Choć nie mamy doświadczenia w pracy z innymi urządzeniami, przewidujemy, że Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx lub Beckman Coulter MoFlo XDP będą odpowiednie, jeśli zostaną wyposażone w właściwe lasery.
2. Parametry sortowania ustal na podstawie wykresu rozproszenia przedniego względem tylnego (forward vs. back scatter), aby wyznaczyć bramkę dla żywych komórek. Stwórz wykres emisji z użyciem filtra pasmowo-przepustowego 615 +/- 30 nm (mCherry) względem filtra pasmowo-przepustowego 525 +/- 25 nm (GFP), aby podzielić zdarzenia na cztery kwadranty: „Red+ Green-”, „Red+ Green+”, „Red- Green-” oraz „Red- Green+” (Rycina S2). Jako wzorzec do wyznaczenia kwadrantu „Red- Green-” wykorzystaj komórki niefluorescencyjne.
3. Sortuj komórki przy ciśnieniu osłony 21,5 psi, częstotliwości tworzenia kropel 43 400 drops/sec oraz ciśnieniu próbki 20,5 psi.
4. Sortowanie wstępne („tryb odzyskiwania” - Recovery Mode): Zbieraj próbki do schłodzonych probówek Eppendorf zawierających 250 µl zimnego CSM-glucose. Wirowarkuj przez 10 s z maksymalną prędkością w chłodzonej mikrowirowarce (Tomy MRX-150, 15 000 rpm) i odessaj roztwór przepływowy (Flow cytometry sheath solution (PBS z 1 mM EDTA) BioSure nr kat. 1027). Resuspenduj w 500 µl zimnego CSM-glucose.
5. Drugie sortowanie („tryb czystości” - Purity Mode): Przeprowadź sortowanie analogicznie jak w przypadku sortowania wstępnego, korzystając z opcji „purity mode”. Odwirowuj oczyszczone komórki i resuspenduj osady w 500 µl-1,0 µl CSM-glucose. Inkubuj przez 15 min w płytkach 24-dołkowych w temperaturze 23 °C, aby umożliwić regenerację metaboliczną.

5. Mikroskopia DeltaVision

1. Przygotować podkładki agarozowe w następujący sposób: zawiesinę 1,5% agarozy (UltraPure Agarose, Invitrogen, nr katalogowy 15510-07) w pożywce CSM-glucose doprowadzić do wrzenia, krótko wymieszać w wortexie, a następnie nanieść 0,3 ml roztworu agarozy na powierzchnię poziomych standardowych szkiełek przedmiotowych i natychmiast przykryć je drugim szkiełkiem (nie wywierając nacisku).
2. Po schłodzeniu przez 10 min ostrożnie usunąć górne szkiełko, przesuwając je poziomo, dbając o zachowanie gładkiej powierzchni i niezakłócenie warstwy agarozy. (Po usunięciu górnego szkiełka próbkę komórek należy nanieść w ciągu 1-2 min. Przechowywane w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej bez zdejmowania górnego szkiełka, podkładki można przechowywać do jednego dnia przed użyciem).
3. Osadzić próbki i nanieść 1 ml alikwotów osadu na podkładki agarozowe (nie dotykając powierzchni). Natychmiast przykryć próbkę kwadratowym szkiełkiem nakrywkowym nr 1. Odciąć nadmiar agarozy za pomocą żyletki jednostronnej. Uszczelnić preparaty wazeliną naniesioną za pomocą strzykawki.
4. Wykonać obrazowanie za pomocą systemu Deltavision (Applied Precision) z użyciem obiektywu immersyjnego 100x bez binningu (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞/0.17/FN26.5).
5. Dokonać dekonwolucji stosów z (z-stacks) przy użyciu programu softWoRx 5.0.0 (http://www.api.com/softworx.asp) i przeprowadzić minimalne przetwarzanie. Kolejne płaszczyzny z gromadzono zazwyczaj w odstępach 0,2-0,4 mikrona).

6. Reprezentatywne wyniki

Poziomy intensywności fluorescencji w transformowanych komórkach haploidalnych: Poziom fluorescencji w haploidach przedstawiono na Rysunku S1. Przed krzyżówką badanie w epifluorescencji wykazało, że zasadniczo wszystkie transformanty GFP były zielone, a wszystkie transformanty mCherry, choć często słabiej świecące, były czerwone. Aby upewnić się, że wszystkie komórki wykorzystane do krzyżówki były rzeczywiście fluorescencyjne, zastosowano subpopulację o najsilniejszym sygnale fluorescencyjnym.

Wydajność: Po wstępnej sortowaniu próbka Red+ Green+ (Ryc. S2) zazwyczaj zawiera 8-20% początkowej liczby komórek oraz nadmierną liczbę komórek haploidalnych, co może wynikać z utrzymującej się adhezji międzykomórkowej. Ponieważ pojedyncze sortowanie nie zapewnia wysokiego stopnia wzbogacenia, częściowo oczyszczoną próbkę należy poddać sonikacji sondą dwa razy przy amplitudzie 60%, a następnie ponowić sortowanie. (Sortowania odzyskiwania trwają zazwyczaj od 1 do 2 godz., natomiast drugie sortowanie wymaga jedynie 15 min). Wśród komórek poddanych drugiemu sortowaniu, próbki Red+ Green+ zawierały 23-52% komórek wejściowych.

Badanie mikroskopowe w kontraście fazowym: Badanie za pomocą mikroskopii fazowej wykazało, że czystość końcowego preparatu zygot wynosiła średnio około 90% w 21 preparatach (zakres od 86% do 91%). Zanieczyszczenia stanowiły zielone lub czerwone haploidy bądź pary haploidów pozostających w kontakcie ze sobą. Rycina 3 przedstawia w formie tabeli procent zygot bez pączków, z pączkami środkowymi (Med), bocznymi (Lat) lub końcowymi (Term), liczbę sparowanych haploidów tego samego koloru ("2Same") lub różnych kolorów ("2Hap"), a także pojedynczych haploidów (Hap). Gdy komórki zebrano po 1,75 hr, ponad 50% nie wykazywało pączkowania, a pozostałe podkategorie (z pączkami środkowymi, bocznymi lub końcowymi) były reprezentowane w równym stopniu. Po 2,5 hr w każdej z czterech kategorii (bez pączków, z pączkami środkowymi, bocznymi lub końcowymi) znajdowała się w przybliżeniu taka sama liczba zygot.

Obserwacje mikroskopowe (Rycina 4):

Struktura zygot wydaje się pozostać niezmieniona podczas procesu oczyszczania. W zależności od czasu trwania krzyżowania, populacja wykazywała różne proporcje zygot niepączkujących i pączkujących, co wyjaśniono powyżej. Ponieważ zarówno zielone, jak i czerwone haploidy wykazywały znaczną zmienność w intensywności sygnału fluorescencyjnego, niektóre zygoty były w przeważającej mierze czerwone, a inne zielone, co można zaobserwować, porównując obrazy jednobarwne z obrazami połączonymi na Rysunku 4. Należy również zauważyć, że GFP (MW 26kDa) przedostaje się do jądra i może w nim występować nawet wtedy, gdy jądra nie uległy jeszcze fuzji. Wakuole wyróżniają się jako czarne, niefluorescencyjne sfery.

Produkt końcowy oczyszczania stanowi zróżnicowaną populację na różnych etapach rozwoju. Zygoty oznaczone jako A nie przeszły fuzji. Zygoty typu B nie są wypączkowane. Typ C posiada mały pączek. Typ D ma większy pączek, a zygoty typu E są tuż przed cytokinezą. Należy również zauważyć, że wiele z wcześniejszych zygot nadal wykazuje niefluorescencyjną środkową linię podziału (*), a wakuolarną „strukturę dziedziczenia” (I) ¹² często można dostrzec, jak rozciąga się z zygoty do pączka. W niektórych przypadkach sygnał zielony uległ redystrybucji do partnera w znacznie większym stopniu niż sygnał czerwony. Odzwierciedla to opóźnienie transferu charakterystyczne dla polisomów (Tartakoff, w przygotowaniu).

Zaczynając od pary 5 ml kultur logarytmicznych komórek haploidalnych, otrzymujemy około 1-2 x 10⁶ zygot, co jest ilością wystarczającą do wielu analiz immunoblottingowych z wykorzystaniem procedur detekcji chemiluminescencyjnej. Stosując protokoły izolacji fenolowo-chloroformowej, ekstrahujemy około 1,5 mg RNA z tej liczby komórek.

Ponieważ oczyszczone zygoty zostały schłodzone, przed dalszą analizą zalecamy inkubację w 23 °C w pożywce wzrostowej.

Rycina 1. Chronologia powstawania zygoty. Zygoty jako etap pośredni między haploidami a diploidami. Schemat przedstawia klasyczną aktywację (tworzenie tzw. shmoo) haploidów, ich fuzję oraz powstawanie pierwszego pąka. Pąki mogą być środkowe (M), boczne (L) lub końcowe (T).

Rycina 2. Schemat protokołu oczyszczania zygot. Po inkubacji na powierzchni płytek agarowych w pożywce kompletnej z glukozą, mieszaninę komórek odzyskano poprzez przemywanie, a następnie poddano pierwszemu sortowaniu w „trybie odzyskiwania” (recovery mode), po którym nastąpiło drugie sortowanie w „trybie czystości” (purity mode). Kolor żółty oznacza, że w zygotach widoczne były sygnały mCherry i GFP.

Rycina 3. Odmiany zygot w oczyszczonych frakcjach. Mieszaniny kojarzone zbierano po 1,75 lub 2,5 hr w celu odzyskania frakcji wzbogaconych w zygoty stosunkowo wczesne w porównaniu do zygot stosunkowo bardziej dojrzałych. Dla każdego punktu czasowego przeprowadzono osiem niezależnych eksperymentów, oznaczonych odrębnymi kolorami. Wykresy przedstawiają względną liczbę zygot o przestrzennie odmiennych wzorach tworzenia pączków. Biorąc pod uwagę krótki czas inkubacji (mniej niż 2,5 hr w temperaturze pokojowej), wszystkie zaobserwowane pączki stanowią początkowe zdarzenia pączkowania zygotycznego.

Rysunek 4. Analiza frakcji wzbogaconych za pomocą systemu DeltaVision. Typowe pole widzenia zbadano za pomocą mikroskopii Deltavision. Ilustracje przedstawiają kolory czerwony i zielony jednocześnie lub pojedynczo. Kolor czerwony odpowiada znacznikowi polisomalnemu (Rpl25p-mCherry), a zielony cytozolowemu GFP. Zwróć uwagę na wysokie wzbogacenie zygot oraz oznaczone struktury subkomórkowe: wakuole (v), pączki (b), jądro (n), „strukturę dziedziczenia” wakuol (i) oraz przegrodę (*), która wydaje się oddzielać domeny rodzicielskie w stosunkowo wczesnych zygotach. Zmienny kolor ogólny odzwierciedla względną intensywność haploidów, które uległy fuzji. W przypadkach, w których dwie domeny rodzicielskie zachowują odrębny kolor, równowaga znaczników (cytoplazmatyczne GFP, polisomy znakowane mCherry) była niepełna. Trwające badania time-lapse wykazują, że rozpuszczalne GFP redystrybuuje się przed polisomami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Uzupełniające legendy

Rycina S1. Fluorescencja komórek haploidalnych. Po lewej: zbadano komórki wykazujące ekspresję polizomów znakowanych mCherry w celu wykrycia sygnału zielonego. Prostokątne okno ustawiono tak, aby wykluczyć komórki negatywne. Wykres środkowy: przeanalizowano komórki wykazujące ekspresję cytosolowego GFP, co wykazało wyraźnie jasną, główną populację komórek pozytywnych. Po prawej: przeanalizowano komórki wykazujące ekspresję polizomów znakowanych mCherry. Prostokąt (identyczny z tym po lewej stronie) obejmuje najjaśniejsze komórki i pozwala na wykluczenie wszystkich komórek negatywnych. Oznaczenie „R2” wskazuje odsetek komórek odzyskanych wewnątrz wskazanego prostokąta.

Rycina S2. Rozkład komórek w pierwszym i drugim sortowaniu. Te dwukolorowe wykresy wskazują proporcję komórek Green+ Red+ w prawym górnym kwadrancie (R5). Proporcja ta wzrasta do 52% w drugim sortowaniu. Oś pozioma: sygnał zielony. Oś pionowa: sygnał czerwony.

Dyskusja

Dostępność oczyszczonych zygot powinna ułatwić badania biochemiczne, w tym transkryptomikę, proteomikę i lipidomikę, a także badanie mechanizmów, dzięki którym zygoty wchodzą ponownie w cykl komórkowy, przebudowują ścianę komórkową, pączkują i przekazują cechy dziedziczne itp. Alternatywnie zygoty można generować, zaczynając od szczepów z charakterystycznymi mutacjami u jednego lub obojga rodziców. Co więcej, oczyszczone zygoty, podobnie jak komórki haploidalne lub diploidalne, można mrozić w medium zawierającym 15% glic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pEG220, URA3/YIp, kodujący cytoplazmatyczne GFP 11)	E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, kodujący RPL25 połączony z mCherry	A. Johnston
Sonikator Fisher FB120	Fisher Scientific
Probówka polipropylenowa z nakrętką z filtrem	BD Falcon	Ref 352235
Chłodzona mikrowirówka	Tomy	MRX-150
Płyn osłonowy do cytometrii przepływowej	Biosure	1027
Cytometr przepływowy iCyt Reflection Model	Sony
Mikroskop dekonwolucyjny DeltaVision	Applied Precision
Pionowy mikroskop epifluorescencyjny	Leica
Agaroza UltraPure	Invitrogen	15510-07
Formuła glukozy CSM Uwagi: W przypadku szalek z agarem należy dodać 2% agaru (Difco)	10