Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Podsumowanie

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca²⁺ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Streszczenie

Opisano tutaj metodę pomiaru kurczliwości wyizolowanych mięśni szkieletowych. Parametry takie jak siła mięśnia, moc mięśnia, kinetyka skurczu, podatność na zmęczenie oraz regeneracja po zmęczeniu mogą zostać uzyskane w celu oceny konkretnych aspektów procesu sprzężenia wzbudzenie-skurcz (ECC), takich jak pobudliwość, mechanizm skurczowy i zdolność gospodarki Ca²⁺. Metoda ta eliminuje wpływ nerwów i ukrwienia, koncentrując się na samym wyizolowanym mięśniu szkieletowym. Rutynowo stosujemy tę metodę do identyfikacji komponentów genetycznych, które zmieniają właściwości skurczowe mięśni szkieletowych poprzez modulację szlaków sygnalizacyjnych Ca²⁺. Przedstawiamy tutaj nowo zidentyfikowany fenotyp mięśnia szkieletowego, i.e., alternans mechaniczny, jako przykład różnorodnych i bogatych informacji, jakie można uzyskać za pomocą testu kurczliwości mięśni in vitro. Połączenie tego testu z analizami pojedynczych komórek, podejściami genetycznymi i analizami biochemicznymi może dostarczyć istotnych informacji na temat mechanizmów ECC w mięśniach szkieletowych.

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe przyczepiają się do kości szkieletu i generują siły skurczowe pod kontrolą ośrodkowego układu nerwowego. Sprzężenie wzbudzenie-skurcz (ECC) odnosi się do procesu przekształcania bodźca elektrycznego w odpowiedź mechaniczną. Sygnalizacja Ca²⁺ jest niezbędnym elementem funkcji skurczowej w mięśniach szkieletowych. Efektywna mobilizacja Ca²⁺ z siateczki sarkoplazmatycznej (SR) stanowi istotny komponent ECC w komórkach mięśniowych^{1, 2}, a zmiany w wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca²⁺ leżą u podstaw odpowiadającej im dysfunkcji skurczowej w szeregu chorób mięśni^3-5. Prawidłowa ocena kurczliwości mięśni jest niezbędna i stanowi uzupełnienie obrazowania Ca²⁺ oraz innych testów, umożliwiając uzyskanie wiedzy na temat funkcji mięśni szkieletowych nie tylko na poziomie skurczu, ale także na poziomie kinetycznym. Można również wyznaczyć siłę i prędkość, aby określić istotną właściwość, jaką jest moc mięśnia, oraz stan procesu ECC w różnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Ta płodna dziedzina badań ma bardzo bogatą historię, a w ciągu dwóch tysiącleci pojawiło się wiele teorii skurczu mięśni⁶. Nowoczesne badania nad mięśniami prawdopodobnie rozpoczęły się w latach 1674-1682 od mikroskopowych obserwacji poprzecznych prążków i miofibryli w włóknach mięśniowych przeprowadzonych przez Leeuwenhoeka⁶. Prawie wiek później Luigi Galvani zauważył, że mięsień żaby kurczy się gwałtownie, gdy podczas wyładowania iskry z oddalonej maszyny elektrycznej jego nerw zostanie dotknięty skalpelem^7-9. Skurcz można było wywołać również poprzez połączenie nerwu kończyny z mięśniem za pomocą przewodnika metalowego. Szczegóły złożonego mechanizmu sygnalizacji elektrycznej postulowanego przez Galvani'ego zostały ostatecznie sformułowane przez Hodgkina, Huxleya i Katza w ich słynnym równaniu^{10, 11}, które stało się fundamentem elektrofizjologii. Wyjątkowe obserwacje Ringera dotyczące wpływu pozakomórkowego Ca²⁺ na kurczliwość serca żaby i mięśni szkieletowych^12-15 stanowią pierwszy istotny krok w uznaniu Ca²⁺ za kluczowy regulator kurczliwości mięśni^{16, 17}. Od lat 80. XX wieku do dziś nastąpił gwałtowny rozwój odkryć w dziedzinie kurczliwości mięśni dzięki wprowadzeniu protokołów badania kurczliwości i męczliwości mięśni szkieletowych u myszy¹⁸. Jones i Edwards jako pierwsi zasugerowali, że przerywane zmęczenie o niskiej częstotliwości (redukcja siły wywołana wysiłkiem)¹⁹ wiąże się ze zmianami w mechanizmie ECC, a nie w aparacie kurczliwym. Pod koniec lat 80. i na początku lat 90. Kolkeck et al²⁰, Kolbeck i Nosek ²¹ oraz Reid ²² wykorzystywali mięsień przepony z modeli gryzoni do badania wpływu teofilin, kortykosteronu i wolnych rodników na kurczliwość mięśni szkieletowych, podczas gdy Brooks i Faulkner jako pierwsi donieśli o pomiarach powtarzalnej siły i mocy w mięśniach szybkich i wolnych u myszy²². Ponadto Lannegren, Westerblad, Lamb i Westerblad jako pierwsi bezpośrednio powiązali kurczliwość ex vivo z wewnątrzkomórkową regulacją Ca²⁺ i zaczęli kwestionować rolę kwasicy w zmęczeniu mięśni^{23, 24}.

Od początku lat 2000. nasze laboratoria wniosły znaczący wkład w zrozumienie funkcji nowych genów o rolach modulacyjnych i regulacyjnych w procesie sprzężenia elektromechanicznego (ECC) mięśni, które odgrywają kluczową rolę w kurczliwości, męczliwości i starzeniu się mięśni, wykorzystując kombinację badań kurczliwości całych mięśni mysich, monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ w nienaruszonych i pozbawionych błony (skinned) włóknach mięśniowych oraz manipulacji molekularno-genetycznych^{3-5, 25-29}.

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano protokół eksperymentalny służący do pomiaru kurczliwości izolowanych mięśni brzuchatych łydki (soleus) oraz prostowników długich palców (EDL) myszy, które odpowiadają odpowiednio mięśniowi głównie wolnowłóknistemu oksydacyjnemu (włókna mięśniowe typu I i IIa) oraz mięśniowi głównie szybkowłóknistemu glikolitycznemu (włókna mięśniowe typu IIb i IIx) o odmiennych właściwościach kurczliwych. W tym protokole izolowano nienaruszone kompleksy mięsień-ścięgno i umieszczano je w systemie komory ADI PowerLab Radnotti, zasilanej czystym tlenem lub mieszaniną tlenu (95%) i CO₂ (5%). Siły skurczu generowano za pomocą stymulacji elektrycznej zy stimulatora Grass, a ich detekcję przeprowadzano przy użyciu przetwornika siły zintegrowanego z systemem ADI PowerLab/400, co umożliwia dostosowanie rutyn makro w celu sterowania akwizycją, zbieraniem, digitalizacją i przechowywaniem danych. Układ ten pozwala na pomiar siły mięśniowej, mocy mięśniowej, a także zależności siły od częstotliwości, zmęczenia mięśni, regeneracji po zmęczeniu mięśniowym, prędkości oraz ogólnych właściwości kinetycznych skurczu mięśni. Ponadto za pomocą tych doświadczeń można monitorować wpływ leków na skurcz mięśni.

Zalety tej metody polegają na usunięciu komponentów neuronalnych i naczyniowych z mięśnia szkieletowego, co pozwala na bezpośrednią ocenę właściwości wewnętrznych kurczącego się mięśnia. Ponadto testy kurczliwości ex vivo umożliwiają manipulację środowiskiem zewnątrzkomórkowym otaczającym izolowane mięśnie, co pozwala na zastosowanie manipulacji farmakologicznych w odniesieniu do różnych kanałów i transporterów przepuszczalności jonowej w celu określenia ich roli fizjologicznej w funkcjonowaniu mięśni szkieletowych.

Ten układ ex vivo pozwolił nam niedawno odkryć wyraźne zjawisko alternans w niektórych preparatach mięśni mutantów, które powiązano ze zmienionymi właściwościami gospodarki wewnątrzkomórkowej Ca²⁺⁴. Alternans definiuje się jako fluktuujące epizody serii skurczów o zmiennej sile podczas fazy spadkowej profilu zmęczeniowego. Podczas tych zdarzeń siły skurczu chwilowo wzrastają powyżej poprzedniego poziomu siły podczas stymulacji zmęczeniowej, co może wynikać z uwalniania większej ilości Ca²⁺ lub zwiększonej wrażliwości aparatu kurczliwego na Ca^2+  30. Podanie kwasu cyklopiazonowego (CPA), odwracalnego blokera ATPase wapniowej siateczki sarkoplazmatycznej i endoplazmatycznej (SERCA), kofeiny, agonisty kanału ryodanynowego (RyR), a także powtarzane stymulacje zmęczeniowe mogą indukować alternans mechaniczne⁴, co sugeruje, że zjawisko to jest bezpośrednio związane z modulacją procesu sprzężenia E-C. Przedstawienie metody indukcji i rejestracji alternans mechanicznych w układzie do badania kurczliwości in vitro służy jako przykład pokazujący zróżnicowane parametry eksperymentalne, jakie można uzyskać za pomocą tego systemu lub układów podobnych, w zależności od indywidualnych zainteresowań badawczych.

Metoda ta może być interesująca dla badaczy zajmujących się fizjologią mięśni. Podobny układ można zastosować również w przypadku izolowanych kompleksów mięsień szkieletowy-ścięgno/więzadło z innych lokalizacji anatomicznych, a także dla pojedynczych włókien i pasków mięśniowych.

Protokół

Skład roztworu:

Roztwór Tyrode'a z 2,5 mM Ca²⁺: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ i 10 mM glukozy

Roztwór Tyrode'a 0 mM Ca²⁺: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM kwas etylenoglikolowy tetraoctowy (EGTA) i 10 mM glukozy

Uwaga: roztwór kąpielowy powinien być nasycony 100% O₂ w przypadku stosowania powyższego roztworu, natomiast w przypadku stosowania buforów wodorowęglanowych w celu utrzymania stałego pH, powinien być nasycony 95% O₂ z 5% CO₂. Do buforu kąpielowego dodaje się 2,5 mM Ca²⁺, aby odtworzyć poziom Ca²⁺ występujący w przestrzeni zewnątrzkomórkowej; dodanie 10 mM glukozy jest istotne, ponieważ mitochondria w tych mięśniach nadal funkcjonują, nieprzerwanie produkując ATP w obecności glukozy.

1. Przygotowanie eksperymentu kurczliwości Ex Vivo przy użyciu systemu ADI PowerLab

1. Schematyczny rysunek 4-kanałowego systemu kurczliwości ex vivo przedstawiono na Rysunku 1. Komputer steruje stymulatorem w celu generowania impulsów prostokątnych, które są filtrowane przez jednostkę izolacyjną, aby dotrzeć do pary platynowych przewodów otaczających każdy izolowany kompleks mięsień-ścięgno. Jest to również nazywane stymulacją polową. Skurcz mięśnia reagujący na stymulację był wykrywany przez przetwornik siły, a sygnał z niego generowany był wzmacniany, filtrowany i przesyłany z powrotem do komputera za pomocą przetwornika A/C (kondycjonowanie sygnału). Sygnał jest następnie cyfryzowany i może zostać zapisany do późniejszych analiz.
2. Aby przygotować się do eksperymentu kurczliwości ex vivo, należy najpierw włączyć stymulator polowy, przetwornik A/C (w tym przypadku ADI Power Lab) lub podobne oprogramowanie (np. LabView), a następnie komputer.
3. Otwórz oprogramowanie Chart4 (lub inną wersję oprogramowania kompatybilną z systemem) i zainicjuj zadanie 4-kanałowe; prawidłowa komunikacja oprogramowania z urządzeniem jest sygnalizowana rozpoczęciem konfiguracji sprzętu, a przycisk START w oprogramowaniu staje się aktywny; funkcja 4-kanałowa umożliwia jednoczesny pomiar pary mięśni od myszy typu dzikiego i mutantów, lub 2 mięśni EDL i 2 mięśni soleus od tej samej myszy; może być ona również stosowana do innych mięśni, takich jak przepona (cała przepona, półprzepona lub paski mięśnia przeponowego) oraz mięsień piszczelowy przedni; może być także wykorzystywana do preparatów mięśnia sercowego i wiązek mięśniowych, szczególnie w przypadku stosowania mięśni szczura. W takim przypadku wielkość mięśni może ograniczać dyfuzję tlenu, dlatego wiązki mięśniowe są lepszym wyborem. Jednakże przygotowanie wiązek mięśniowych wymaga eksperckich technik sekcji.
4. Kalibracja przetwornika siły: służy ona zapewnieniu porównywalności zbiorów danych generowanych na różnych kanałach i w różnym czasie. Najpierw rozpocznij rejestrację, kolejno zawieś obciążniki 1 g, 2 g i 5 g na haczyku próbki przetwornika siły, zatrzymaj rejestrację, oblicz odpowiadające im zmiany w mV widoczne w każdym kanale oprogramowania Chart4, nanieś ΔmV i wagę na wykres, aby sprawdzić liniowość i wyznaczyć współczynnik przeliczeniowy między mV a gramami siły. Zalecamy przeprowadzanie tych kalibracji na początku lub na końcu każdego eksperymentu, aby zapewnić uzyskanie specyficznej kalibracji dla każdego konkretnego doświadczenia.
5. Sprawdź prawidłowe podłączenie rurki teflonowej, odprowadź wszelkie ciecze obecne w przewodach kąpieli tkankowej, przemyj komory trzy razy lub więcej wodą ddH₂O i napełnij 20~25 ml 2,5 mM roztworem Tyrode’a z Ca²⁺. Ca²⁺ i glukoza są dostarczane w roztworze kąpielowym, aby pomóc utrzymać integralność błony, optymalne obciążenie SR jonami Ca²⁺ oraz zapewnić łatwo dostępny poziom energii do generowania ATP przez sam mięsień, ponieważ mitochondria pozostają w tych preparatach w pełni funkcjonalne.
6. Sprawdź prawidłowe podłączenie zasilania tlenem, otwórz butlę z tlenem i dostosuj przepływ tlenu, aby zapewnić dyfuzyjne i jednorodne bąbelkowanie w komorze. Poziomy tlenu można łatwo wyznaczyć jako funkcję siły skurczu w czasie. Można również zainstalować przepływomierz, szczególnie jeśli badaczy interesuje analiza efektów hipoksji lub hiperoksji. W przypadku wystąpienia hipoksji w mięśniach siła naturalnie spada. Hiperoksja również może uszkodzić mięśnie, ale jej efekty mogą być trudniejsze do wykrycia, ponieważ większość eksperymentów jest przeprowadzana w sztucznych warunkach hiperoksycznych, aby zrekompensować brak normalnego dopływu krwi do mięśni. W większości systemów możliwe jest napowietrzanie różnych komór taką samą ilością tlenu poprzez utrzymanie stałego przepływu tlenu do każdej komory.
7. Dostosuj czułość wszystkich kanałów, aby zapewnić maksymalną rozdzielczość siły bez nasycania kanału. Czułość kanału może znacznie różnić się w zależności od wieku zwierzęcia, temperatury eksperymentalnej, manipulacji genetycznych, wielkości mięśnia, szczepu myszy oraz umiejętności eksperymentatora w zakresie prawidłowej sekcji mięśni bez ich uszkodzenia. W naszym doświadczeniu, przy pomiarze siły skurczu mięśnia soleus, czułość waha się od 0,5 do 10 mV/cm, natomiast w przypadku EDL czułość może wynosić od 1 do 20 mV/cm.
8. Należy opracować protokół stymulacji zmęczeniowej. W oprogramowaniu Chart4 można użyć makra. Aby zaprogramować nowe makro: w oprogramowaniu Chart4 kliknij „start measuring”, następnie kliknij „Macro”, „Macro Command”, „start recording”, „begin repeat”, wybierz żądaną częstotliwość stymulacji, a następnie „end repeat”. W protokole equilibracji stymulacja jest powtarzana co minutę przez 30 min, a w protokole zmęczeniowym stymulacja jest powtarzana co 2 s przez 5 min. Te zmiany w periodyczności stymulacji bezpośrednio wpływają na cykl pracy, który jest również funkcją czasu trwania stymulacji. Parametry te można zmieniać, aby testować różne aspekty kurczliwości i podatności na zmęczenie.

2. Przygotowanie nienaruszonych pęczków mięśniowych

1. Disekcja mięśnia EDL: mysz zostaje uśmiercona zgodnie z wytycznymi NIH i instytucjonalnymi protokołami IACUC dotyczącymi zwierząt. Uśmiercenie myszy odbywa się poprzez zwichnięcie szyjnego kręgu. Myszy układa się następnie w pozycji bocznej. Mięsień EDL jest mięśniem szybkim glikolitycznym o bladoróżowo-białym kolorze. Ma około 10-13 mm długości i waży 8-11 mg u myszy typu dzikiego C57BL/6. Funkcjami EDL jest prostowanie palców 2-5 oraz zgięcie grzbietowe stopy w stawie skokowym. Jest on unerwiony przez nerw strzałkowy. Aby wypreparować EDL, należy wykonać powierzchowne nacięcie skóry i rozciąć powięź między mięśniem piszczelowym przednim a tylną grupą mięśniową, a następnie zlokalizować przyczep początkowy (proksymalny), gdzie więzadło łączy się z kłykciem bocznym kości piszczelowej i górnymi 3/4 przedniej powierzchni kości strzałkowej (brzeg międzykostny). Przeciąć więzadło delikatnymi nożyczkami okulistycznymi tak daleko dystalnie od mięśnia, jak to możliwe; procedura ta uwalnia proksymalny przyczep początkowy mięśnia EDL. Chwycić więzadło tępą pęsetą i powoli pociągnąć, aby uwolnić EDL. Może być konieczne przecięcie części perymysium otaczającego EDL oraz innych mięśni wokół EDL; jest to krok krytyczny, ponieważ podczas tego delikatnego etapu może dojść do uszkodzenia mięśnia EDL. Następnie należy przejść do obszaru przyczepu końcowego, gdzie cztery ścięgna dystalne przyczepiają się do środkowych i dalszych paliczek palców 2-5. Przeciąć ścięgna tak daleko od mięśni, jak to możliwe.
2. Przenieść wyizolowany mięsień EDL do naczynia do dysekcji zawierającego izotoniczny roztwór Tyrode'a. Niektóre modele zwierzęce mutacyjne, transgeniczne i knockout mają bardzo kruche mięśnie, dlatego przed pomiarami kurczliwości konieczne jest zastosowanie roztworu Tyrode'a wolnego od Ca²⁺, aby zapobiec uszkodzeniom mięśni indukowanym przez Ca²⁺. Następnie za pomocą węzła chirurgicznego mocno związać oba końce mięśnia EDL tak daleko dystalnie od mięśnia, jak to możliwe. Dobrym punktem odniesienia jest zawiązanie węzła nieco powyżej połowy długości więzadła lub ścięgna. Do tej procedury należy użyć nici chirurgicznej o rozmiarze 6-0, a następnie przenieść mięsień EDL do komory kąpieli tkankowej nasyconej O₂, zamocować mięsień w rowku próbki przetwornika siły oraz na nieruchomym haczyku na dnie komory kąpieli; powtórzyć proces dla drugiej kończyny. Zaczynamy również stosować nową metodę, w której mięśnie są utrzymywane za pomocą zacisków zamiast szwów. Jeśli głównym celem jest badanie właściwości kinetycznych i/lub wyznaczenie mocy mięśnia, zaleca się, aby szew był jak najkrótszy lub aby zastąpić go metalowym prętem.
3. Disekcja mięśnia płaszczyznowego: mięsień płaszczyznowy jest głównie mięśniem wolnym oksydacyjnym o intensywnie czerwonym kolorze. Jest on o ok. 1 mm krótszy od EDL, ale waży nieco więcej niż EDL. Jest unerwiony przez nerw piszczelowy i odpowiada za zgięcie podeszwowe stopy. Aby wypreparować mięsień płaszczyznowy, należy uzyskać dostęp do tylnej bocznej strony nogi, odsunąć mięsień brzuchaty łydki, który zazwyczaj przykrywa mięsień płaszczyznowy, i zidentyfikować mięsień o ciemnoczerwonym kolorze. Przy przyczepie początkowym (proksymalnym) przeciąć więzadła łączące się z proksymalną połową tylnej części kości piszczelowej wzdłuż linii mięśnia płaszczyznowego oraz proksymalną 1/3 tylnej części kości strzałkowej; następnie, przy przyczepie końcowym (dystalnym), przeciąć ścięgno piętowe, które przyczepia się do tylnej części kości piętowej. Ostrożnie uwolnić mięsień płaszczyznowy i odpowiednio zamocować go w komorze kąpieli, analogicznie do mięśnia EDL.

3. Pomiar kurczliwości izolowanych mięśni szkieletowych

1. Po zamontowaniu mięśni w oddzielnych komorach kąpieli tkankowej należy rozpocząć rejestrację. Większość podobnych systemów umożliwia zerowanie linii bazowej zapisu siły. Funkcja ta jest zazwyczaj powiązana z wzmacniaczem, a w przypadku systemu PowerLab jest to funkcja wzmacniacza mostkowego. Ułatwia ona obserwację zmian linii bazowej i zapewnia wygodny sposób analizowania wszystkich skurczów mięśni od zera. Izolowane mięśnie są następnie stymulowane impulsami prostokątnymi, których parametry mogą się znacznie różnić w zależności od wielkości komory, grubości drucików platynowych, odległości między drucikami, a nawet składu roztworu eksperymentalnego. Zastosowaliśmy natężenie prądu 60 mA (zauważyliśmy, że natężenia powyżej 350 mA wydają się szkodliwe dla preparatów mięśniowych) oraz serie stymulacyjne o czasie trwania 350, 500 i 1000 ms, w zależności od celów konkretnego protokołu. Pojedyncze impulsy prostokątne powinny mieć czas trwania od 0,3-1 ms.
2. Kolejnym krokiem jest wybór częstotliwości stymulacji zdolnej do wywołania stymulacji tetanicznej zlanej (np. ~100 Hz, aby umożliwić wytworzenie maksymalnej siły w mięśniu EDL i ~60 Hz w mięśniu soleus), przy jednoczesnym powolnym i ostrożnym rozciąganiu mięśni w celu zidentyfikowania ich optymalnej długości. Podczas ostrożnego rozciągania mięśni należy odczekać 30 s i stymulować z częstotliwością 100 Hz; odczekać 30 s i ponownie rozciągnąć, a następnie powtórzyć stymulację, aż do momentu, w którym siła nie będzie już wzrastać.
3. Mięśnie te przeszły znaczące zmiany środowiskowe. Zaleca się, aby mięśnie mogły zaadaptować się do nowego środowiska, co w naszych protokołach nazywamy „ekwilibracją”. Ekwilibruj mięśnie przy tej samej częstotliwości stymulacji, której użyto w fazie rozciągania, 100 Hz przez 20-30 min, aż przynajmniej 5 kolejnych skurczów tetanicznych będzie całkowicie stabilnych (bez spadków, bez wzrostów, ze stabilną linią bazową). Periodyczność serii stymulacyjnych (100 Hz, czas trwania 500 ms, pojedynczy impuls 1 ms) podczas ekwilibracji wynosi 1 min, co odpowiada cyklowi pracy 1,66%, czyli stymulacji niewywołującej zmęczenia. W tym kontekście cykl pracy 1,66% oznacza, że z całkowitego czasu 100%, mięśnie pracują przez 1,66% czasu; poprzez zwiększenie cyklu pracy można w końcu doprowadzić do zmęczenia mięśni. Jeśli mimo to mięśnie zdrowej myszy typu dzikiego wykazują profil zmęczeniowy w tym okresie ekwilibracji, możliwe jest, że zostały uszkodzone podczas sekcji, w komorach/mięśniach występuje hipoksja lub nadmierna elektroliza poprzez elektrody stymulujące generuje wolne rodniki. Westerblad sugerował wcześniej, że prądy większe niż 400 mA indukują powstawanie wolnych rodników²³. Oczywiście zaleca się stosowanie platyny najwyższej jakości, ponieważ inne metale z pewnością doprowadzą do powstawania wolnych rodników i toksyczności mięśniowej.
4. Należy uzyskać zależność siły od częstotliwości (FF), stymulując mięśnie następującymi częstotliwościami stymulacji: 1-140 Hz (w przyrostach 5-10 Hz), z periodycznością 30-60 s podczas prowadzenia eksperymentów w 25 °C. Przy prowadzeniu eksperymentów w 37 °C należy rozszerzyć FF do wyższych częstotliwości, do 300 Hz dla mięśnia przepony, 180-200 Hz dla mięśnia soleus i 220-250 Hz dla mięśnia EDL. Następnie należy zidentyfikować częstotliwość stymulacji, która generuje maksymalną siłę tetaniczną (T_max) oraz około ½ maksymalnej siły tetanicznej (1/2 T_max); czasem trudno jest uzyskać dokładną wartość ½ T_max dla obu mięśni, EDL i soleus, jeśli używa się tylko jednego źródła stymulacji, ze względu na wewnętrzne różnice między tymi mięśniami. Rozwiązaniem jest zidentyfikowanie częstotliwości, która generuje 30-70% T_max. Uzasadnieniem dla tych częstotliwości stymulacji jest to, że T_max dostarcza ważnych informacji o zdarzeniach/modulacji aparatu kurczliwego, podczas gdy ½ T_max dostarcza informacji bardziej istotnych dla regulacji Ca²⁺ i procesu ECC. Aby mieć pewność, że osiągnięto maksymalną siłę, do roztworu kąpieli można dodać 10-20 mM kofeiny podczas stymulacji mięśnia. Jeśli osiągnięto maksymalną siłę, w obecności kofeiny siła nie wzrośnie. FF przesuwa się w prawo, a siły mają tendencję do bycia nieco wyższymi przy wyższych temperaturach eksperymentalnych. Korzystając z tego systemu, można zastosować dowolne inne częstotliwości stymulacji, jeśli jest to pożądane. Wyraźny profil kurczliwy szybkiego mięśnia glikolitycznego EDL oraz wolnego mięśnia oksydacyjnego soleus przedstawiono na Rysunku 2.
5. Po ekwilibracji należy zmęczyć mięśnie przy ½ T_max przez 5 min, z odstępem stymulacji 2 s i cyklem pracy 25% (Rysunek 3). Uważa się, że ten konkretny protokół zmęczeniowy lepiej odzwierciedla wkład uwalniania Ca²⁺ z siateczki sarkoplazmatycznej w kurczliwość mięśni³¹.
6. Przywrócić sprawność mięśnia przy ½ T_max przez 30 min lub do momentu, gdy siła będzie stabilna, w odstępach 1 min. Można teraz przeprowadzić dodatkowy protokół zmęczeniowy z użyciem stymulacji T_max, która w przekonaniu badaczy odzwierciedla stan aparatu kurczliwego³¹. Inną opcją jest rozszerzenie protokołu zmęczeniowego o przeplatanie serii stymulacyjnych generujących T_max i ½ T_max podczas zmęczenia oraz regeneracja mięśni przy użyciu tego samego rodzaju stymulacji.
7. Powtórzyć FF zgodnie z opisem w kroku 3.4; uzasadnieniem jest fakt, że różnice fenotypowe między różnymi szczepami, modelami chorobowymi lub terapiami lekowymi można zaobserwować, analizując FF przed i po zmęczeniu. Zgłaszaliśmy na przykład wcześniej, że po zmęczeniu FF młodych mięśni typu dzikiego przesuwa się w lewo, podczas gdy w mięśniach starszych przesuwa się w prawo, co sugeruje odmienne efekty modulujące zmęczenie mięśni szkieletowych w zależności od wieku.
8. Aby zbadać wkład napływu zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w kurczliwość mięśni, roztwór kąpieli można zmienić na roztwór niezawierający Ca²⁺, lecz zawierający 0,1 mM EGTA (roztwór Tyrode'a 0 mM Ca²⁺)³². Alternatywnie w roztworze kąpieli można zastosować różne blokery kanałów sterowanych zapasami (store-operated channels). Kilka przykładów to: 2-aminoetylo difenyloborynat (2-APB), SKF96365, 3,5-bis(trifluorometylo)pirazol 2 (BTP-2) i azumolen itp.^{33, 34}. Kofeinę można wykorzystać do zbadania funkcji receptora ryanodynowego, a KCl do oceny ogólnych właściwości depolaryzacyjnych tych preparatów. Inne leki mogą być również użyte do zbadania istotnej modulacji siły podczas zmęczenia przez pompy Na⁺, K⁺ oraz Na⁺-K⁺³⁵. Większość tych leków ma stosunkowo niewielkie rozmiary i wydaje się szybko dyfundować do tych preparatów mięśniowych, co potwierdzają ich natychmiastowe efekty. Brak efektu jakiegokolwiek leku nie oznaczakoniecznie, że lek jest nieskuteczny; czasami konieczne są dodatkowe testy z użyciem dawek znacznie wyższych niż te stosowane w eksperymentach na pojedynczych włóknach mięśniowych.
9. Jedno z unikalnych zastosowań tego systemu ex vivo doprowadziło do niedawnego odkrycia alternans mechanicznych w mięśniach tric-a^{-/-4, 30}. Alternans definiuje się jako fluktuujące epizody wyrzutów siły kurczliwej podczas fazy spadkowej profilu zmęczeniowego. Podczas tych zdarzeń siła kurczliwa może chwilowo wzrosnąć powyżej poprzedniego poziomu siły podczas stymulacji zmęczeniowej, ponieważ albo uwalniane jest więcej Ca²⁺, albo aparat kurczliwy stał się bardziej wrażliwy na Ca²⁺. Wyrzut siły kurczliwej musi być o 50% wyższy niż poprzednia siła, a wyrzuty te powinny być widoczne co najmniej 10 razy podczas 5-minutowego procesu stymulacji zmęczeniowej. Alternans mechaniczne nie są powszechne w mięśniach szkieletowych myszy typu dzikiego, ale mogą występować w niektórych mięśniach mutantów z zaburzeniem wewnątrzkomórkowego procesu sygnalizacji Ca²⁺, takich jak mięśnie z Trimeric Intracellular Cation Channel typu A (tric-a)^-/-4. Alternans mechaniczne można wywołać poprzez stymulacje zmęczeniowe, traktowanie kofeiną i kwasem cyklopiazonowym (CPA), patrz Rysunek 3 w celu uzyskania reprezentatywnego zapisu tych alternans mechanicznych. Natura tego zjawiska jest dość intrygująca, gdyż mięsień ulegający zmęczeniu wydaje się zdolny do chwilowego wytworzenia większej siły. W naszej poprzedniej publikacji, w połączeniu z analizą Ca²⁺ w pojedynczych komórkach, wykazano, że pojawienie się alternans jest wynikiem przeładowania SR Ca²⁺ i niestabilności SR. Wierzymy, że głębsze zrozumienie alternans może prowadzić do lepszego zrozumienia procesu ECC.
10. Na koniec eksperymentu należy zmierzyć długość i wagę poszczególnych mięśni za pomocą skalibrowanego suwmiarki i wagi analitycznej, zamrozić mięsień błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w -80 °C, ponieważ w tych mięśniach można przeprowadzić analizy biochemiczne. Mięśnie te mogą być również poddane mechanicznemu usuwaniu błon (mechanical skinning) w celu szczegółowego zbadania procesu ECC lub chemicznemu usuwaniu błon (chemical skinning) w celu określenia podstawowych właściwości kurczliwych w nieobecności mechanizmów regulacyjnych ECC.
11. Zarejestrowana siła mięśnia (mV) jest najpierw przeliczana na siłę w gramach na podstawie wyników kalibracji, a następnie normalizowana do fizjologicznej powierzchni przekroju poprzecznego (PCSA) przy użyciu następującego wzoru: siła mięśnia (N/cm²) = (siła (g) x długość mięśnia (cm) x 1,06)/(waga mięśnia (g) x 0,00981)^5,36. Alternatywnie, siła mięśnia może być normalizowana do całkowitej zawartości białka lub całkowitej zawartości aktyny w poszczególnym mięśniu przy użyciu testu białka Bradforda/ilościowego oznaczenia barwienia błękitem Coomassie. W określonych warunkach, w których masa mięśniowa może być poważnie dotknięta przez choroby, starzenie się lub terapie lekowe, normalizacja siły w oparciu o masę mięśnia, zawartość białka i/lub aktyny może zapewnić bardziej stabilny odczyt.

4. Reprezentatywne wyniki

Typowe siły skurczu mięśnia EDL i mięśnia kłubowego w temperaturze pokojowej w odpowiedzi na stymulację o niskiej, średniej i wysokiej częstotliwości przedstawiono na Rysunku 2. Skurcz EDL indukowany stymulacją 5 Hz pozostaje w formie pojedynczych drgań ze względu na szybkie działanie ATP-azy SERCA Ca²⁺ oraz wewnętrzne właściwości wrażliwości aparatów kurczliwych na Ca²⁺, podczas gdy skurcz mięśnia kłubowego przy 5 Hz zaczyna się zlewać (wolniejsza ATP-aza i wyższa wrażliwość aparatów kurczliwych na Ca²⁺), ale wartości szczytowe sił są wciąż oddzielone. Przy stymulacji 20 Hz skurcze EDL są częściowo zlane, podczas gdy w przypadku mięśnia kłubowego powstaje całkowicie zlana siła tężcowa. Przy częstotliwości stymulacji wywołującej stymulację T_max, która w temperaturze pokojowej może wynosić od 80-110 Hz dla EDL i 60-90 Hz dla mięśnia kłubowego, odnotowuje się szybki wzrost i szybki zanik siły tężcowej w EDL, co jest przeciwstawne do powolnych charakterystyk mięśnia kłubowego. Rysunek 2B wykazuje, że krzywa siła-częstotliwość mięśnia EDL jest przesunięta w prawo w porównaniu z mięśniem kłubowym, co wskazuje, że mięśnie kłubowe są bardziej wrażliwe na uwalnianie Ca²⁺ przy dowolnej danej częstotliwości stymulacji ze względu na obecność wolnych izoform miozyny i troponiny. Ponadto aparat kurczliwy odpowiada stosunkowo większą siłą w mięśniu kłubowym przy niższych częstotliwościach. Rysunek 3 przedstawia normalny profil zmęczenia mięśnia EDL (panel górny) i mięśnia kłubowego (panel środkowy). Należy zwrócić uwagę na szybszy spadek siły skurczu podczas stymulacji zmęczeniowej w mięśniu EDL oraz większy spadek siły na koniec 5-minutowego protokołu zmęczeniowego. Na koniec, na Rysunku 3 (panel dolny) przedstawiono typowy profil alternans mechaniczny mięśnia mutantowego, który zdefiniowano jako chwilowe wyrzuty siły podczas fazy spadkowej profilu zmęczenia mięśnia. Wyrzut siły skurczu musi być o 50% wyższy od poprzedniej siły, a wyrzuty powinny pojawić się co najmniej 10 razy podczas 5-minutowego procesu stymulacji zmęczeniowej.

Rycina 1. Schemat 4-kanałowego systemu kurczliwości ex vivo. Impulsy prostokątne są generowane przez komputer sterujący stymulatorem Grass. Dwie jednostki izolacji stymulacji filtrują bodziec pochodzący z jednostki stymulatora elektrycznego w celu usunięcia wszelkich fluktuacji sygnału elektrycznego i ustanowienia stabilnego sygnału w postaci fali prostokątnej. Ten przefiltrowany sygnał elektryczny jest przesyłany do 4 komór kąpielowych zawierających elektrody z drutu platynowego otaczające każdy izolowany mięsień. Ostatecznie to prąd przepływający między dwiema elektrodami (tzw. stymulacja polowa) generuje potencjał czynnościowy, indukując skurcz mięśnia. Skurcz ten jest wykrywany przez specjalistyczne przetworniki siły, przesyłany do wzmacniaczy mostkowych, filtrowany, uśredniany (kondycjonowanie sygnału) i rejestrowany przez oprogramowanie komputerowe za pomocą przetwornika A/D.

Rycina 2. Reprezentatywne siły skurczu mięśnia EDL i mięśnia soleus. (A) Siły skurczu indukowane przez 5 Hz (panel górny), 20 Hz (panel środkowy) oraz maksymalna siła tetaniczna (T_max) (panel dolny); wstawka przedstawia zapis siły skurczu uszkodzonego mięśnia; (B) reprezentatywny zestaw pokazujący poszczególne skurcze zależności siły od częstotliwości w EDL (FF, panel górny) oraz wykreśloną krzywą wynikającą z FF (panel dolny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 3. Reprezentatywny profil zmęczeniowy i mechaniczny alternans. Typowy profil zmęczeniowy z szybkim spadkiem dla mięśnia EDL (panel górny) oraz profil zmęczeniowy z wolnym spadkiem dla mięśnia płaszczowatego (panel środkowy). Stymulacja zmęczeniowa prowadzi do wystąpienia mechanicznego alternansu w mięśniu tric-a^-/- z zaburzonymi właściwościami gospodarki Ca²⁺ (panel dolny).

Dyskusja

Pomiar siły skurczu oraz podatności na zmęczenie jest istotny dla ogólnej oceny funkcji mięśni szkieletowych. Głównym celem tego badania jest zidentyfikowanie zmian w sile mięśni oraz właściwościach związanych z męczeniem w określonych stanach patologicznych, takich jak sarkopenia i zmęczenie mięśni, a także przetestowanie wpływu leków/odczynników na kurczliwość mięśni. Ponieważ siła mięśni jest ściśle powiązana z wewnątrzkomórkowym uwalnianiem Ca²⁺, zewnątrzkomórkowym napływem Ca²⁺ oraz interakcją ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-APB	Tocris	1224	Blokery szeregu kanałów wlotowych Ca2+, w tym SOC i TRP itp.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blokery szeregu kanałów wlotowych Ca2+, w tym SOC oraz receptorowo zależny wlot Ca2+ itp.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Względnie specyficzny bloker SOC
CPA	Sigma	C1530	Odwracalny bloker SERCA
kofeina	Sigma	C0750	Szybko działający agonista RyR
Czterojednostkowy system kąpieli tkankowych Radnoti	Radnoti	159920
Zintegrowany uchwyt tkankowy z elektrodą stymulującą	Radnoti	160151	Typ pionowy zygzakowy z uchwytem tkankowym
Wzmacniacz Quad Bridge	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		Ten produkt nie jest już dostępny. Należy wybrać inną wersję systemu akwizycji danych.
Przetworniki siły (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 jest najnowszą wersją oprogramowania Chart.
Cyfrowy stymulator podwójnego impulsu S8800	GRASS TECHNOLOGIES		Ten produkt nie jest już dostępny. Nowszym stymulatorem jest S88X Dual Output Square Pulse Stimulator.
Izolator transformatorowy RF	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5