Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Podsumowanie

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Streszczenie

Rak nadjarmniowy nabłonkowy (EOC) jest główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów ginekologicznych w społeczeństwach zachodnich. Pomimo postępów w leczeniu chirurgicznym i udoskonalenia chemioterapii opartych na platynie, w ciągu ponad czterech dekad odnotowano niewielką poprawę w przeżywalności pacjentek z EOC ^1,2. Podczas gdy dla guzów w stadium I wskaźnik 5-letniej przeżywalności wynosi >85%, dla choroby w stadium III/IV wskaźniki przeżywalności są niższe niż <40%. Zatem wysoka śmiertelność w przypadku EOC mogłaby zostać znacznie zmniejszona, gdyby guzy były wykrywane we wcześniejszych, łatwiejszych do leczenia stadiach ^3-5. Obecnie molekularne, genetyczne i biologiczne podstawy rozwoju choroby we wczesnym stadium są słabo poznane. W szczególności niewiele wiadomo o roli mikrośrodowiska podczas inicjacji guza, jednak znane czynniki ryzyka EOC (np. wiek i liczba porodów) sugerują, że mikrośrodowisko odgrywa kluczową rolę we wczesnej genezie EOC. Opracowaliśmy zatem trójwymiarowe modele heterotypowe zarówno prawidłowego jajnika, jak i raka jajnika we wczesnym stadium. W przypadku prawidłowego jajnika zastosowano kokulturę prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika (IOSE) oraz prawidłowych fibroblastów zrębu (INOF) , unieśmiertelnionych poprzez transdukcję retrowirusową katalitycznej podjednostki ludzkiego holoenzymu telomerazy (hTERT) w celu wydłużenia czasu życia tych komórek w kulturze. Aby zamodelować najwcześniejsze etapy transformacji nabłonkowych komórek jajnika, zastosowano nadekspresję onkogenu CMYC w komórkach IOSE, które ponownie hodowano w kokulturze z komórkami INOF. Te modele heterotypowe wykorzystano do zbadania wpływu starzenia się i senescencji na transformację i inwazję komórek nabłonkowych. W niniejszej pracy opisujemy kroki metodologiczne w opracowywaniu tych modeli trójwymiarowych; metodologie te nie są specyficzne wyłącznie dla rozwoju tkanek prawidłowego jajnika i raka jajnika i mogą być stosowane do badania innych typów tkanek, w których interakcje między komórkami zrębu a nabłonkowymi stanowią fundamentalny aspekt utrzymania tkanki i rozwoju choroby.

Protokół

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat opisanego poniżej procesu.

1. Izolacja prawidłowych fibroblastów jajnika i przedłużenie czasu życia in vitro poprzez nadekspresję podjednostki katalitycznej holoenzymu hTERT

1. Tkanki jajnika można pobierać za świadomą zgodą pacjentki oraz po uzyskaniu zatwierdzenia przez Instytucjonalną Komisję Przeglądową (w przypadku instytucji z USA). Prawidłowe tkanki jajnika można pobierać po całkowitej histerektomii drogą brzuszną lub całkowitej histerektomii laparoskopowej z obustronną salpingo-oforektomią. W niniejszym badaniu tkanki zostały zbadane przez patologa, a następnie pobrano fragment zrębu jajnika do hodowli komórkowej. Próbki tkanki o rozmiarze około 2–5 mm² pobrano z centralnej części jajnika, aby zminimalizować ryzyko jednoczesnego pobrania nabłonka jajnika.
2. Przenosić świeżą tkankę jajnika do laboratorium hodowli komórkowych w pożywce wzrostowej dla unieśmiertelnionych normalnych fibroblastów jajnika (INOF), uzupełnionej o dodatkowe antybiotyki i środki przeciwgrzybicze. Pożywka wzrostowa INOF (INOF-GM) składa się z: Medium 199 oraz MCDB105 zmieszanych w stosunku 1:1, uzupełnionych o 15% płodowej surowicy bydlęcej oraz 2 mM L-glutaminy, 50 μg/ml gentamycyną i 250 ng/ml amfoterycyny B.
3. Praca w komorze z laminarnym przepływem powietrza: usunąć wszelkie komórki nabłonkowe, które pozostają luźno przytwierdzone do tkanki, płucząc próbkę 5 ml PBS. Odessać płyn i powtórzyć czynność dwukrotnie.
4. Przenieś próbkę wraz z PBS do czystej szalki hodowlanej o średnicy 10 cm (P100). Za pomocą sterylnej pincety przenieś tkankę do drugiej, suchej i czystej szalki hodowlanej P100. Używając sterylnego skalpela, potnij tkankę na fragmenty o wielkości 0,5 cm.² fragmenty. Każdy fragment tkanki należy umieścić w osobnej płytce P100 i dalej pociąć na mniejsze części <1 mm² o rozmiarze. Dodać 20 ml pożywki INOF-GM (z dodatkiem antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych) i inkubować w 37 °C, 5% CO2₂Monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopii fazowej. Adhezja komórek do naczynia jest widoczna w ciągu 24 h.
5. Ponowić podawanie pożywki po tygodniu, usuwając wszelkie nieprzylegające tkanki za pomocą aspiracji. Następnie podawać pożywkę hodowlom dwa razy w tygodniu. Komórki utworzą kolonie, zazwyczaj w ciągu 1–3 tygodni. Gdy kolonie te osiągną wystarczający rozmiar do pasażowania (kiedy osiągną około 500 μm), wyizolować klony za pomocą dysków do klonowania pokrytych trypsyną.
   Należy potwierdzić, że komórki są w 100% fibroblastyczne i wolne od innych zanieczyszczeń komórkowych, poprzez wysianie próbki linii komórkowej na szkiełka podstawowe i wykonanie barwienia immunofluorescencyjnego na marker fibroblastów (FSP), marker nabłonkowy (pan-cytokeratynę) oraz marker komórek śródbłonka (czynnik von Willebranda VIII).
6. Przenieś pierwotne izolaty prawidłowych fibroblastów jajnika (NOF) z jednej naczyniowej płytki P100 do 3 płytek P100 na jeden dzień przed transdukcją retrowirusową hTERTGotowe nadnadziny wirusowe można nabyć w sprzedaży lub wytworzyć we własnym zakresie, stosując standardowe protokoły kotransfekcji komórek HEK293T (patrz www.stanford.edu/group/nolan/).
   Nadnadczynki retrowirusowe można wytworzyć przy użyciu wektora pBABE-hygro-hTERT (Addgene). Wyjąć NOF z inkubatora, a następnie odessać medium hodowlane. Do każdej szalki dodać 3 ml nadnadczynku wirusowego: jedna szalka otrzymuje retrowirus hTERT, druga^nd do jednej płytki dodaje się retrowirus GFP, a do trzeciej płytki nie dodaje się wirusa. Na nadnadkliny wirusowe nakłada się medium INOF-GM zawierające polybrene, aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 8 μg/mlNastępnego dnia ponownie podaj komórkom świeżą pożywkę. Dwa dni po infekcji rozpocznij selekcję niską dawką (10 U/ml) hygromycyny B. Po siedmiu dniach dawkę tę można zwiększyć do 20 U/ml; selekcja powinna zakończyć się w ciągu 10–14 dni.
7. Klon expressing hTERT lub GFP można wyizolować metodą ring cloningu, gdy osiągną one rozmiar około 500 μmLinie komórkowe wymagają dodatkowej charakterystyki w celu potwierdzenia prawidłowej ekspresji hTERT oraz zachowanie cech pierwotnej linii komórkowej. Obejmuje to: (a) potwierdzenie aktywności telomerazy za pomocą metody PCR-ELISA oraz długości telomerów za pomocą metody Southern blot lub PCR ^6,7; (b) potwierdzenie ekspresji krytycznych markerów (np. immunobarwienie z użyciem przeciwciała przeciwko pan-cytokeratyne w celu identyfikacji komórek nabłonkowych oraz z użyciem przeciwciała przeciwko białku powierzchniowemu fibroblastów dla fibroblastów) są podobne pomiędzy pierwotnymi i hTERT-unieśmiertelnione komórki; (c) potwierdzenie, że komórki nie wykazują cech transformacji nowotworowej (np. za pomocą testów wzrostu niezależnego od podłoża); (d) potwierdzenie przedłużenia in vitro długość życia zaobserwowana w komórkach wykazujących ekspresję hTERT ale nie GFP. hTERTwyrażające uniezmiennione normalne fibroblasty jajnika (INOFs) powinny omijać starzenie replikacyjne, ale nie mogą być przekształcone neoplastycznie; dodatkowo komórki INOF powinny zachować ekspresję białka powierzchniowego fibroblastów, ale nie markerów nabłonkowych, takich jak cytokeratyna (Rysunek 2).

2. Powlekanie naczyń do hodowli tkankowej PolyHEMA w celu hodowli komórek nieprzylegających

1. Aby przygotować roztwór polyHEMA, odważ 1,5 g polyHEMA i umieść w sterylnym słoiku. Dodaj 95 ml absolutnego etanolu klasy do biologii molekularnej oraz 5 ml wody destylowanej klasy do hodowli komórkowych. Hydrożel polyHEMA rozpuści się w zawartości wodnej roztworu, a etanol wysterylizuje preparat.
2. Umieść roztwór polyHEMA w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C do pełnego rozpuszczenia. Może to potrwać do 8 hr. Należy pamiętać, że roztwór polyHEMA nie może być przechowywany przez dłuższy czas, dlatego powinien być zawsze przygotowywany na świeżo.
   ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: Roztwory polyHEMA wymagają długiego czasu inkubacji w 65 °C. Regularnie odwracaj słoik z roztworem polyHEMA w celu wymieszania. Lepkość zaobserwowana na dnie szklanego słoika wskazuje, że polyHEMA nie rozpuściło się całkowicie i wymagana jest dalsza inkubacja w 65 °C.
3. Pracując w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, pokryj naczynia do hodowli tkankowej roztworem polyHEMA. Można w ten sposób pokryć polyHEMA naczynia do hodowli tkankowej, kolby lub płytki wielodołkowe o dowolnym rozmiarze. Zalecane objętości roztworu polyHEMA wymagane dla każdego naczynia podano w Tabeli 2.
4. Pozostaw naczynia do hodowli komórkowych do wyschnięcia wewnątrz dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Może to potrwać 2-3 dni. Aby zapewnić równomierne pokrycie większych naczyń lub kolb, można zastosować delikatne kołysanie na platformie kołyszącej. Jeśli roztwór polyHEMA wyschnie zbyt szybko, powierzchnia może nie być gładka. Aby tego uniknąć, upewnij się, że pokrywka naczynia/kolby pozostaje zamknięta przez cały proces suszenia.
5. Nanieś drugą warstwę polyHEMA i pozostaw do wyschnięcia zgodnie z opisem powyżej.
   ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: W powłoce z polyHEMA mogą pojawić się otwory, szczególnie gdy płytki wysychają zbyt szybko. Podwójne pokrycie płytek polyHEMA pomaga wypełnić luki lub pęknięcia w powłoce przed użyciem. Płytki zazwyczaj wymagają 2-3 dni na wyschnięcie każdej warstwy polyHEMA, dlatego powinny być przygotowane co najmniej tydzień przed planowanym użyciem do hodowli komórkowej.
6. Płytki pokryte polyHEMA można przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.

UWAGA: Do pokrywania naczyń hodowlanych w celu stworzenia powierzchni nieadhezyjnej do krótkotrwałej hodowli 3D (mniej niż jeden tydzień) można również stosować 1% roztwory agarozy, rozpuszczone w 1X PBS i wysterylizowane w autoklawie. Pokrycie płytek wielodołkowych agarozą tworzy powierzchnię wklęsłą, która sprzyja formowaniu się pojedynczego sferoidu na dołek dla wielu linii komórkowych. Jednak w przypadku dłuższych hodowli 3D zaleca się stosowanie powłoki z polyHEMA, ponieważ powłoka z agarozy często ulega rozpadowi po dłuższym okresie hodowli.

3. Generowanie trójwymiarowych (3D) sferoidów heterotypowych i ponowna suplementacja kultur 3D

1. Odnowić i namnożyć kultury komórek INOF oraz komórek nabłonkowych in vitro, aby przygotować wystarczającą liczbę komórek do utworzenia heterotypowych sferoidów 3D. W przypadku „kultur masowych” zazwyczaj wysiewa się 2-4x10⁶ komórek INOF na płytkę P100 oraz 0,5-1x10⁶ komórek nabłonkowych, aby uzyskać stosunek komórek stromy do nabłonkowych 4:1. Komórki INOF hoduje się w pożywce wzrostowej INOF (INOF-GM) bez dodatku gentamycyny lub amfoterycyny B. W razie potrzeby komórki fibroblastów można poddać wstępnej obróbce przed hodowlą 3D (np. w celu indukcji starzenia komórkowego można zastosować subletalne dawki nadtlenku wodoru).
2. Przemyć suchą płytkę polyHEMA 5 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) przez 5 min. Odessać PBS i zastąpić go 15 ml INOF-GM.
3. W międzyczasie przeprowadzić trypsynizację unieśmiertelnionych normalnych fibroblastów jajnika w celu ich odspojenia od naczynia hodowlanego; po 3-5 min zneutralizować trypsynę równą objętością pożywki hodowlanej i zebrać komórki w pellet przez wirowanie przy 450 x g przez 5 min.
4. Odlać supernatant. Przygotować zawiesinę jednokomórkową poprzez resuspensję pelletu komórkowego w 5 ml INOF-GM, dokładnie mieszając poprzez pipetowanie w górę i w dół lub delikatne wstrząsanie w wirówce typu vortex. Określić stężenie komórek, mieszając 10 μl zawiesiny komórkowej z 10 μl błękitu trypanu i licząc je za pomocą komory licznikowej (hemocytometru). Do identyfikacji żywych komórek można zastosować metodę wykluczania błękitu trypanu.
5. Dodać 4x10⁶ komórek INOF do pożywki wcześniej naniesionej na płytkę pokrytą polyHEMA. Uzupełnić objętość pożywki hodowlanej do 20 ml, używając odpowiedniej ilości świeżej pożywki INOF-GM, a następnie inkubować w 37 °C, 5% CO₂. Komórki zaczynają agregować w wielokomórkowe sferoidy w ciągu 24 h. Formowanie sferoidów można monitorować za pomocą mikroskopii fazowej.
   Dokładne przeliczenie liczby sferoidów w warunkach kultury masowej jest trudne, jednak szacujemy, że przy wysianiu 4x10⁶ komórek stromy otrzymujemy 50-100 sferoidów. Rozmiary sferoidów zazwyczaj mieszczą się w przedziale 80-250 μm.
6. Dokarmić kultury sferoidów co 2-3 dni, opierając płytki pod kątem o pipetę umieszczoną w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Odczekać, aż sferoidy osiądą; może to zająć do 20 min. Ostrożnie usunąć zużytą pożywkę za pomocą pipety 5 ml, aż w naczyniu pozostanie tylko około 4 ml. Należy uważać, aby nie odessać sferoidów. Dodać 16 ml świeżej pożywki INOF-GM i przenieść płytki z powrotem do inkubatora.
7. W 7. dniu dodać komórki nabłonkowe do sferoidów fibroblastycznych, aby utworzyć kultury heterotypowe w następujący sposób. Przygotować zawiesiny komórek nabłonkowych jajnika (fenotypowo normalnych lub przekształconych) poprzez trypsynizację, zgodnie z opisem w sekcji 3.4-3.5. Określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Przemyć raz w INOF-GM, aby zapobiec przeniesieniu czynników wzrostu z pożywek wzrostowych dla komórek nabłonkowych.
   W naszym laboratorium linie normalnych komórek nabłonka powierzchniowego jajnika (OSEC) pobrano za zgodą pacjentek z jajników usuniętych podczas całkowitej abdominalnej histerektomii lub całkowitej laparoskopowej histerektomii z obustronną salpingo-ooforektomią. Nabłonek zebrano z jajników za pomocą sterylnej szczoteczki cytologicznej. Ustanowiono pierwotne linie komórkowe i przeprowadzono transdukcję hTERT zgodnie z opisanym powyżej podejściem. Szczegóły dotyczące hodowli OSEC w 2D i 3D oraz unieśmiertelnienia OSEC znajdują się w referencjach 10 i 11.
8. Aby utworzyć sferoidy heterotypowe, najpierw dokarmić kultury samych sferoidów fibroblastycznych. Następnie zaszczepić kultury sferoidów fibroblastycznych 1x10⁶ komórkami nabłonkowymi w stosunku 4:1 (fibroblasty do komórek nabłonkowych). Hodować heterotypowe sferoidy w INOF-GM.
9. Dokarmić kultury heterotypowe co 2-3 dni przez kolejne 14 dni.

4. Obróbka do analiz obrazowych i molekularnych

1. Do analizy sferoidów heterotypowych można zastosować wiele różnych technik. W przypadku obrazowania zaleca się pobieranie sferoidów z naczynia hodowlanego za pomocą pipety 25 ml. Powolne pipetowanie zminimalizuje ryzyko działania sił ścinających, które mogłyby naruszyć architekturę sferoidu. Sferoidy można następnie przemyć w PBS i odwirować przy delikatnym wirowaniu z prędkością 100 x g przez 10 min; wyższe siły odśrodkowe mogą uszkodzić sferoidy. Alternatywnie hodowle można przenieść do probówki Falcon 50 ml i odczekać do osadzenia, a następnie usunąć pożywkę wzrostową.
   1. W przypadku immunohistochemii sferoidy utrwalono w neutralnie buforowanym formalinie przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu sferoidów formalinę zastąpiono 70% etanolem. Przeszczepiono je do parafiny zgodnie ze standardowymi protokołami stosowanymi dla tkanek ludzkich. Sferoidy zatopione w parafinie można przeciąć i barwić hematoksyliną i eozyną lub specyficznymi markerami molekularnymi przy użyciu standardowej immunohistochemii (Rysunek 3).
   2. Alternatywnie sferoidy przemyte w PBS można utrwalić w 4% paraformaldehydzie (przygotowanym w PBS), zatopić w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) i gwałtownie zamrozić w celu wykonania mrożonych skrawków i barwienia immunofluorescencyjnego.
2. Do analiz molekularnych sferoidy można pobrać, odwirować i dwukrotnie przemyć w PBS przed lizą komórek w celu ekstrakcji DNA, RNA lub białek.
3. Do analizy metodą cytometrii przepływowej sferoidy można przemyć w PBS i zdysocjować poprzez trawienie trypsyną lub accutase w 37 °C. W tym celu probówkę Falcon zawierającą sferoidy należy zanurzyć w kąpieli wodnej, aby ułatwić trypsynizację. Całkowitą dysocjację sferoidów do postaci zawiesiny pojedynczych komórek można wspomóc, pipetując roztwór w górę i w dół za pomocą końcówki pipety 1 ml. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej trypsynizacji komórek.

Zneutralizować reakcję równą objętością pożywki hodowlanej i usunąć agregaty komórkowe, przepuszczając zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 40-70 μm. Odwirować komórki, przemyć je PBS, policzyć i resuspender pożądaną liczbę komórek w buforze do FACS. Przeprowadzić barwienie komórek zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Reprezentatywne wyniki

Podejście to może być wykorzystane w szerokim zakresie zastosowań, zarówno do badania prawidłowej biologii jajnika, jak i inicjacji raka jajnika. Główną zaletą tej metody w porównaniu z hodowlami 3D tworzonymi przy użyciu dostępnych komercyjnie żeli macierzy zewnątrzkomórkowej jest fakt, że prawidłowe fibroblasty jajnika wytwarzają macierz zewnątrzkomórkową, która stanowi rdzeń sferoidów. W naszym doświadczeniu materiał macierzy produkowany przez prawidłowe fibroblasty jajnika jest heterogeniczny i bardziej przypomina macierz zewnątrzkomórkową jajnika niż jakikolwiek dostępny komercyjnie żel macierzy. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy komórki nabłonkowe, które zostały częściowo przekształcone in vitro wykorzystując zdefiniowane elementy genetyczne (np. CMYC nadekspresja) i współhodowano te komórki z normalnymi oraz senescencyjnymi fibroblastami jajnika, aby naśladować wczesne stadium raka jajnika w jajniku po menopauzie. Nasze dane sugerują, że starzejące się mikrośrodowisko sprzyja cechom neoplastycznym (np. proliferację) częściowo przekształconych komórek nabłonkowych (Rysunek 3), podczas gdy normalne mikrośrodowisko hamuje progresję nowotworową ⁸Nasze laboratorium, podobnie jak inne, stosowało również analogiczne podejścia w celu modelowania prawidłowych komórek nabłonka jajnika ⁹, komórki nabłonka jajowodów, modele stopniowej progresji nowotworowej¹⁰oraz linie komórkowe raka jajnika i endometrium ^11-13 jako homotypowe hodowle sferoidów. Zaobserwowaliśmy, że cechy histologiczne komórek prawidłowych i złośliwych, które nie są wykrywalne podczas hodowli komórek w monowarstwie, zostają przywrócone po przejściu komórek do hodowli sferoidalnej. Na przykład cechy histologiczne jasnokomórkowego raka jajnika mogą być wykryte w hodowlach 3D linii komórkowych jasnokomórkowego raka jajnika (Rycina 4), lecz nie w monowarstwowych hodowlach tych samych komórek. Co więcej, komórki hodowane w 3D dokładniej odzwierciedlają tkankowo specyficzną ekspresję białek obserwowaną w tkankach pierwotnych w porównaniu do tych samych komórek hodowanych w tradycyjnych 2D hodowlach monowarstwowych ^9-11Podejścia te do modelowania prawidłowej i złośliwej tkanki jajnika stanowią również wartościowe narzędzia w odkrywaniu i analizie funkcjonalnej nowych kandydatów na geny supresorowe nowotworów oraz onkogeny raka jajnika, a także innych biomarkerów molekularnych, które mogą być powiązane z rozwojem choroby. ^10,14.

Rysunek 1. Schematyczny przegląd protokołu heterotypowej hodowli 3D. Kolby do hodowli tkanek powleka się dwukrotnie 1% roztworem polyHEMA i pozostawia do wyschnięcia. Plastiki powlekone polyHEMA są płukane 1x PBS bezpośrednio przed użyciem. Unieśmiertelnione normalne komórki fibroblastów jajnika (4x10⁶ komórek) wysiewa się do kolby z 20 ml pożywki wzrostowej. Formowanie i wzrost sferoidów monitoruje się przez 7 dni. W tym momencie hodowle sferoidów fibroblastycznych zaszczepia się 1x10⁶ komórkami nabłonkowymi, a oba typy komórek współhoduje się przez 14 dni, zanim wielokomórkowe sferoidy zostaną zebrane i poddane dalszym zastosowaniom (analizy molekularne, obrazowanie itp.).

Rysunek 2. Barwienie immunofluorescencyjne un bất tửwionych hTERT prawidłowych fibroblastów jajnika. Zarówno pierwotne prawidłowe fibroblasty jajnika (Pr NOFs), jak i un bất tửwione prawidłowe fibroblasty jajnika (INOFs) wykazują ekspresję białka specyficznego dla fibroblastów (FSP), nie wykazują ekspresji cytokeratyny-7 (Ck-7) i wykazują ekspresję wimentyny (VIM). Analizowane markery zaznaczono kolorem zielonym, DNA zbarwiono DAPI i zaznaczono kolorem niebieskim, a cytoplazmę zbarwiono przeciwbarwnikiem błękitem Evansa i zaznaczono kolorem czerwonym.

Rysunek 3. Immunohistochemia współhodowli komórek zrębowych i nabłonkowych. Panel lewy, monokultura sferoidów z prawidłowych fibroblastów jajnika, barwiona hematoksyliną i eozyną. Prawidłowe komórki fibroblastów jajnika hodowane samodzielnie w 3D tworzą sferoidy składające się z komórek o morfologii wrzecionowatej i obfitej macierzy zewnątrzkomórkowej. Panel prawy: prawidłowe fibroblasty jajnika poddano działaniu nadtlenku wodoru w celu wywołania senescencji. Częściowo przekształcone komórki nabłonka jajnika (IOSE^cmyc) dodano do 7-dniowych sferoidów z senescencyjnych fibroblastów. Po dodatkowych 14 dniach współhodowli sferoidy utrwalono, zatopiono w parafinie, pocięto i poddano podwójnemu barwieniu na marker proliferacji (MIB1, różowy) oraz, w celu odróżnienia dwóch typów komórek, na marker nabłonkowy (pan-cytokeratyna, brązowy). Jako barwienie kontrastowe zastosowano eozynę; niebarwione fibroblasty w centrum sferoidu są wyraźnie widoczne (gwiazdki). Panel dolny: ilościowa ocena proliferacji komórek nabłonkowych w podwójnie barwionych współhodowlach. W badaniu wykorzystano linie unieśmiertelnionego nabłonka powierzchni jajnika (IOSE) od trzech różnych pacjentek (IOSE4, IOSE11 i IOSE19). Senescencyjne fibroblasty (SEN) promują proliferację współhodowanych komórek IOSE^cmyc znacząco silniej niż te same komórki przed indukcją senescencji (pre-senescencyjne, PSN). Rodzicielskie komórki IOSE bez nadekspresji CMYC nie wykazują różnic w proliferacji podczas współhodowli z fibroblastami PSN lub SEN. Dane te sugerują, że w naszym modelu współhodowli in vitro procesy starzenia w zrębie jajnika mogą sprzyjać rozwojowi raków jajnika (OCs) ¹¹. *P≤0.05, dwustronny test t dla prób zależnych.

Rysunek 4. Cechy histologiczne komórek hodowanych w 3D odzwierciedlają tkanki pierwotne. (A) Rak jasnokomórkowy jajnika wykazuje charakterystyczne struktury jasnokomórkowe; nie występują one, gdy linie EOC jasnokomórkowe są hodowane na plastiku, lecz podobne struktury są wykrywalne, gdy te same komórki są hodowane jako sferoidy 3D (B). (C) Skaningowa mikrografia elektronowa prawidłowych komórek nabłonkowych jajnika hodowanych jako sferoidy przez 14 dni. Widoczne są mikrokosmki powierzchniowe (strzałki). (D) Sferoidy linii komórkowej raka surowiczego jajnika w kulturze. (A,B) Barwienie hematoksyliną i eozyną przekrojowej tkanki guza zatopionej w parafinie lub sferoidów 3D; (C) skaningowa mikroskopia elektronowa; (D) mikroskopia fazokontrastowa. Sferoidy mogą być kuliste (przerywane koło) lub mieć nieregularny kształt, jak w przypadku struktury widocznej po lewej stronie obrazu.

Rozmiar naczynia/płytki	Objętość PolyHEMA (do dwukrotnego zastosowania)	Objętość końcowa pożywki hodowlanej
płytka 6-dołkowa	3 ml	5-7 ml
płytka 12-dołkowa	1,5 ml	2 ml
płytka 24-dołkowa	500 μl	1,5 ml
płytka 48-dołkowa	250 μl	500 μl
płyta 96-dołkowa	50 μl	200 μl
płytka hodowlana P100	4-5 ml	20 ml
szalka hodowlana P60	2-3 ml	5–7 ml
kolba F25	2-3 ml	7 ml
kolba F75	4-5 ml	20–30 ml
kolba F175	15 ml	30-50 ml

Tabela 2. Zalecane objętości dla powlekania polyHEMA i hodowli 3D.

Dyskusja

Biologia wczesnych stadiów nabłonkowego raka jajnika (EOC) jest słabo poznana. Przez wiele lat jedną z głównych przeszkód w tej dziedzinie był prawdopodobnie brak zrozumienia tkankowego pochodzenia tej choroby oraz znaczenia roli mikrośrodowiska w rozwoju EOC. W ciągu ostatnich kilku lat stało się jasne, że EOC jest chorobą heterogenną o wielu odrębnych podtypach histopatologicznych, prawdopodobnie o różnym pochodzeniu komórkowym dla poszczególnych podtypów. Na przykład obecne dane sugerują, że wysokozłośliwe EOC surowic...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PolyHEMA, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma Aldrich	P3932
Etanol klasy molecular biology	Sigma Aldrich	E7023
Sterylna woda do hodowli komórkowych	VWR	12001-356
MCDB105	Sigma Aldrich	M6395
Pożywka Medium 199	Sigma Aldrich	M2154
Hyclone surowica bydlęca z płodu	Thermo Scientific	SH30088.03
Gentamycyna	Sigma Aldrich	G1397
Amfoterycyna B	Sigma Aldrich	A2942
pBABE-hygro-hTERT	Addgene	1773
PBS	VWR	12001-766
0,25% trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-072
Sito do komórek (40 lub 70μm)	VWR	21008-949 21008-952
Przeciwciało przeciwko białku powierzchniowemu fibroblastów, klon 1B10	Sigma	F4771
Przeciwciało przeciwko pan-cytokeratynom (C11)	Santa Cruz	sc-8018
Polybrene (bromek heksadymetryny)	Sigma	107689
TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS	Roche	12013789001
Test długości telomerów TeloTAGGG	Roche	12209136001
Tabela 1. Odczynniki i sprzęt wykorzystane w niniejszym badaniu.