Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro interakcji zrębowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Podsumowanie

Opisujemy metodologie tworzenia in vitro heterotypowych trójwymiarowych modeli składających się z fibroblastów jajnika i prawidłowych powierzchni jajników lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omawiamy zastosowanie tych modeli do badania interakcji zrębsko-nabłonkowych, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Streszczenie

Nabłonkowe raki jajnika (EOC) są główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów ginekologicznych w społeczeństwach zachodnich. Pomimo postępów w leczeniu chirurgicznym i ulepszonej chemioterapii opartej na platynie, od ponad czterech dekad nastąpiła niewielka poprawa wskaźników przeżycia EOC ^1,2. Podczas gdy guzy w stadium I mają 5-letnie wskaźniki przeżycia >85%, wskaźniki przeżycia w stadium III/IV choroby wynoszą <40%. W związku z tym wysokie wskaźniki śmiertelności z powodu EOC mogłyby zostać znacznie zmniejszone, gdyby nowotwory zostały wykryte we wcześniejszym, bardziej uleczalnym stadium ^3-5. Obecnie molekularne, genetyczne i biologiczne podstawy rozwoju choroby we wczesnym stadium są słabo poznane. Mówiąc dokładniej, niewiele wiadomo na temat roli mikrośrodowiska podczas inicjacji nowotworu; jednak znane czynniki ryzyka EOC (np. wiek i parytet) sugerują, że mikrośrodowisko odgrywa kluczową rolę we wczesnej genezie EOC. W związku z tym opracowaliśmy trójwymiarowe heterotypowe modele zarówno prawidłowego jajnika, jak i raka jajnika we wczesnym stadium. W przypadku normalnego jajnika wspólnie hodowaliśmy normalne komórki nabłonka powierzchniowego jajnika (IOSE) i normalne komórki fibroblastów zrębu (INOF), unieśmiertelnione przez transdukcję retrovrial podjednostki katalitycznej ludzkiego holoenzymu telomerazy (hTERT) w celu przedłużenia żywotności tych komórek w hodowli. Modelowanie najwcześniejszych etapów transformacji komórek nabłonka jajnika, nadekspresja onkogenu CMYC w komórkach IOSE, ponownie hodowanych wspólnie z komórkami INOF. Te heterotypowe modele wykorzystano do zbadania wpływu starzenia się i starzenia się na transformację i inwazję komórek nabłonkowych. Poniżej opisujemy etapy metodologiczne w rozwoju tych trójwymiarowych modeli; Metodologie te nie są specyficzne dla rozwoju prawidłowych tkanek raka jajnika i jajnika i mogą być wykorzystane do badania innych typów tkanek, w których interakcje komórek zrębu i nabłonka są podstawowym aspektem utrzymania tkanek i rozwoju choroby.

Protokół

Rysunek 1 ilustruje przegląd przepływu pracy opisanego poniżej.

1. Izolacja prawidłowych fibroblastów jajnika i wydłużenie życia in vitro poprzez nadekspresję podjednostki katalitycznej holoenzymu hTERT

1. Tkanki jajnika mogą być pobierane za świadomą zgodą pacjentki i zgodą Institutional Review Board (dla instytucji amerykańskich). Prawidłowe tkanki jajnika można pobrać po całkowitej histerektomii brzusznej lub całkowitej laparoskopowej histerektomii z obustronną resekcją jajników. W tym badaniu tkanki zostały zbadane przez patologa i poddano biopsję części zrębu jajnika w celu hodowli komórek. Próbki tkanek o wielkości około 2-5^mm2 pobrano z centralnej części jajnika, aby zmniejszyć ryzyko pobrania próbki nabłonka jajnika.
2. Przenieś świeżą tkankę jajnika do laboratorium hodowli komórkowych w unieśmiertelnionej pożywce wzrostowej normalnych fibroblastów jajników (INOF), uzupełnionej dodatkowymi antybiotykami i lekami przeciwgrzybiczymi. Pożywka wzrostowa INOF (INOF-GM) zawiera: Pożywkę 199 i MCDB105 zmieszane w stosunku 1:1, uzupełnione 15% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 50 μg/ml gentamycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B.
3. Praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego: Usunąć wszelkie komórki nabłonka, które pozostają luźno przyczepione do tkanki, przemywając próbkę 5 ml PBS. Zassać i powtórzyć jeszcze dwa razy.
4. Przenieść próbkę wraz z PBS do czystego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm (P100). Użyj sterylnych kleszczy, aby obsłużyć tkankę i umieścić w drugim, suchym, czystym naczyniu hodowlanym P100. Za pomocą sterylnego skalpela przeciąć tkankę 0,5 cm^{na 2} sztuki. Umieść każdy kawałek chusteczki w osobnym naczyniu P100 i dalej pokrój na kawałki o wielkości <1^mm2. Dodać 20 ml INOF-GM (plus antybiotyki i środki przeciwgrzybicze) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopii fazowej. Komórki można zauważyć przylegające do naczynia w ciągu 24 godzin.
5. Nakarm ponownie po tygodniu, usuwając wszelkie nieprzylegające tkanki przez aspirację. Następnie ponownie karmić kultury dwa razy w tygodniu. Komórki tworzą kolonie, zwykle w ciągu 1-3 tygodni. Gdy te kolonie są wystarczająco duże, aby można je było subkulturować (gdy osiągną około 500 μm), należy wyizolować klony za pomocą dysków klonujących pokrytych trypsyną.
   Upewnij się, że komórki są w 100% fibroblastyczne i wolne od innych zanieczyszczeń komórkowych, posiewając próbkę linii komórkowej na szklanych szkiełkach nakrywkowych i wykonując barwienie immunofluorescencyjne dla markera fibroblastycznego (FSP), markera nabłonkowego (pan-cytokeratyny) i markera komórek śródbłonka (czynnik VIII von Willenbranda).
6. Przejście pierwotnych normalnych komórek fibroblastów jajnika (NOF) izoluje się z pojedynczej szalki P100 do 3 szalek P100 na dzień przed transdukcją retrowirusową hTERT. Gotowe supernatanty wirusowe mogą być zakupione lub wyprodukowane we własnym zakresie przy użyciu standardowych protokołów kotransfekcji komórek HEK293T (patrz www.stanford.edu/group/nolan/).
   Supernatanty retrowirusowe mogą być wytwarzane przy użyciu wektora pBABE-hygro-hTERT (Addgene). Usunąć NOF-y z inkubatora, a następnie odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Dodać 3 ml supernatantu wirusowego do każdego naczynia: jedno naczynie otrzymuje retrowirusa hTERT,^{drugie naczynie} otrzymuje retrowirusa GFP, a trzecie naczynie nie otrzymuje wirusa. Nałożyć supernatanty wirusowe INOF-GM zawierającym polibren, aby uzyskać końcowe stężenie 8 μg/ml. Następnego dnia ponownie nakarm komórki świeżą pożywką. Dwa dni po zakażeniu należy rozpocząć selekcję od małej dawki (10 U/ml) higromycyny B. Po siedmiu dniach dawkę tę można zwiększyć do 20 j./ml; Selekcja powinna zostać zakończona w ciągu 10-14 dni.
7. Klony wykazujące ekspresję hTERT lub GFP można wyizolować przez klonowanie pierścieniowe, gdy osiągną około 500 μm. Linie komórkowe wymagają dodatkowej charakterystyki, aby potwierdzić pomyślną ekspresję hTERT i zachowanie cech pierwotnej linii komórkowej. Obejmuje to: a) potwierdzenie aktywności telomerazy za pomocą PCR-ELISA i długości telomerów, za pomocą Southern blot lub PCR ^6,7; b) potwierdzenie, że ekspresja krytycznych markerów (np. barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-cytokeratynowym w celu identyfikacji komórek nabłonka oraz przeciwciałem przeciwko białku powierzchniowemu antyfibroblastom dla fibroblastów) są podobne między komórkami pierwotnymi i unieśmiertelnionymi przez hTERT; c) potwierdzenie, że komórki nie wykazują właściwości transformacji nowotworowej (np. przy użyciu testów wzrostu niezależnych od zakotwiczenia); d) potwierdzenie wydłużenia życia in vitro obserwowanego w komórkach wykazujących ekspresję hTERT, ale nie GFP. Unieśmiertelnione normalne fibroblasty jajników (INOF) wykazujące ekspresję hTERT powinny omijać starzenie replikacyjne, ale nie ulegać transformacji nowotworowej; dodatkowo komórki INOF powinny utrzymywać ekspresję białka powierzchniowego fibroblastów, ale nie markerów nabłonkowych, takich jak cytokeratyna (ryc. 2).

2. Powlekanie naczyń do kultur tkankowych PolyHEMA w celu nieprzylegającej hodowli komórkowej

1. Aby przygotować roztwór polyHEMA, odważ 1,5 g polyHEMA i umieść w sterylnej butelce. Dodać 95 ml absolutnego etanolu klasy biologii molekularnej i 5 ml wody destylowanej do hodowli komórkowych. Hydrożel poliHEMA rozpuszczy się w zawartości wody w roztworze, a etanol wysterylizuje preparat.
2. Umieścić roztwór polyHEMA w łaźni wodnej w temperaturze 65 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Może to potrwać do 8 godzin. Należy pamiętać, że roztwór polyHEMA nie może być przechowywany przez długi czas, dlatego powinien być zawsze przygotowywany świeży.
   ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: Roztwory polyHEMA wymagają długiego czasu inkubacji w temperaturze 65 °C. Regularnie odwracaj roztwór polyHEMA do mieszania. Lepkość zaobserwowana na dnie szklanej butelki wskazuje, że poliHEMA nie jest całkowicie rozpuszczona i wymagana jest dalsza inkubacja w temperaturze 65 °C.
3. Pracując w okapie z przepływem laminarnym, pokryj naczynia do hodowli tkankowych roztworem polyHEMA. Naczynie do hodowli tkankowej, kolba lub płytka wielodołkowa o dowolnym rozmiarze mogą być pokryte polyHEMA. Zalecane objętości roztworu polyHEMA wymagane dla każdego naczynia podano w tabeli 2.
4. Pozostaw naczynia do hodowli komórkowych do wyschnięcia w okapie z przepływem laminarnym. Może to potrwać 2-3 dni. Delikatne kołysanie na bujanej platformie może być stosowane w celu zapewnienia równomiernego powlekania większych naczyń lub kolb. Jeśli roztwór polyHEMA wyschnie zbyt szybko, powierzchnia może nie być gładka. Aby tego uniknąć, upewnij się, że pokrywka naczynia/kolby pozostaje założona przez cały proces suszenia.
5. Nałóż drugą warstwę polyHEMA i pozostaw do wyschnięcia, jak opisano powyżej.
   ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW: Mogą wystąpić w powłoce polyHEMA, szczególnie gdy płytki schną zbyt szybko. Podwójne powlekanie płyt polyHEMA pomaga zakryć szczeliny lub pęknięcia w powłoce, które są zakryte przed użyciem. Płytki zwykle potrzebują 2-3 dni na wyschnięcie każdej warstwy polyHEMA, dlatego należy je przygotować co najmniej tydzień przed tym, jak będą potrzebne do hodowli komórkowej.
6. Płyty pokryte poliHEMA można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.

UWAGA: 1% roztwory agarozy, rozpuszczone w 1X PBS i autoklawowane do sterylizacji, mogą być również użyte do powlekania naczyń kultur komórkowych, aby stworzyć nieprzylegającą powierzchnię do krótkotrwałej hodowli 3D (mniej niż tydzień). Powłoka agarozowa płytek wielodołkowych tworzy wklęsłą powierzchnię, która sprzyja tworzeniu się pojedynczej sferoidy na studzienkę dla wielu linii komórkowych. Jednak w przypadku dłuższych kultur 3D zalecane jest powlekanie polyHEMA, ponieważ powłoka agarozowa często rozpada się po dłuższych okresach hodowli.

3. Generowanie trójwymiarowych (3D) heterotypowych sferoid i ponowne wprowadzanie kultur 3D

1. Odzyskaj i rozwiń INOF i hodowle komórek nabłonkowych in vitro, aby przygotować wystarczającą liczbę komórek do utworzenia heterotypowych sferoid 3D. W przypadku "kultur masowych" zwykle wysiewamy 2-4x10⁶ INOF na szalkę P100 i 0,5-1x10⁶ komórek nabłonkowych, aby uzyskać stosunek zrębu do nabłonka 4:1. Komórki INOF są hodowane w pożywce wzrostowej INOF (INOF-GEN) bez gentamycyny lub amfoterycyny B. W razie potrzeby komórki fibroblastów można wstępnie potraktować przed hodowlą 3D (np. w celu indukcji starzenia się komórki można leczyć subletalnymi dawkami nadtlenku wodoru).
2. Umyć suchą płytkę polyHEMA 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 minut. Odessać PBS i zastąpić 15 ml INOF-GM.
3. W międzyczasie trypsynizuj unieśmiertelnione normalne komórki fibroblastów jajnika, aby odłączyć je od naczynia hodowlanego, po 3-5 minutach zneutralizuj trypsynę równą objętością pożywki hodowlanej i osadzaj komórki przez odwirowanie przy 450 x g przez 5 minut.
4. Odrzucić supernatant. Zawiesinę jednokomórkową należy stworzyć, ponownie zawieszając osad komórkowy w 5 ml INOF-GM, dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół lub delikatnie wirując. Oznaczyć stężenie komórek, mieszając 10 μl zawiesiny komórek i 10 μl błękitu trypanowego i licząc za pomocą hemocytometru. Wykluczenie błękitu trypanowego może być wykorzystane do identyfikacji żywych komórek.
5. Dodać ogniwa 4x10⁶ INOF do pożywki już dozowanej do płytki pokrytej poliHEMA. Uzupełnić objętość pożywki do 20 ml przy użyciu odpowiedniej objętości świeżego INOF-GM i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Komórki zaczynają agregować się w wielokomórkowe sferoidy w ciągu 24 godzin. Powstawanie sferoid można monitorować za pomocą mikroskopii fazowej.
   Dokładne liczenie liczby sferoidów w warunkach hodowli masowej jest trudne, ale szacujemy, że otrzymujemy 50-100 sferoid po poszczepieniu komórek zrębu 4x10⁶. Rozmiary sferoidów zwykle wahają się od 80 do 250 μm.
6. Ponownie podawaj kultury sferoidalne co 2-3 dni, kładąc płytki pod kątem na pipecie umieszczonej w okapie z przepływem laminarnym. Pozwól, aby sferoidy się uspokoiły. Może to potrwać do 20 minut. Ostrożnie usunąć wyczerpany nośnik za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aż w naczyniu pozostanie tylko około 4 ml. Uważaj, aby nie zasysać sferoid. Ponownie nakarmić 16 ml świeżego INOF-GM i ponownie umieścić w inkubatorze.
7. W dniu 7 dodaj komórki nabłonkowe do sferoid fibroblastów, aby utworzyć heterotypowe kultury w następujący sposób. Przygotować zawiesiny komórek nabłonka jajników (fenotypowo prawidłowych lub przekształconych) metodą trypsynizacji, jak opisano w punkcie 3.4-3.5. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Umyć raz w INOF-GM, aby zapobiec przenoszeniu jakichkolwiek czynników wzrostu z nabłonkowej pożywki wzrostowej.
   W naszym laboratorium prawidłowe linie nabłonka powierzchni jajnika (OSEC) pobrano za świadomą zgodą pacjentki z jajników usuniętych za pomocą całkowitej histerektomii brzusznej lub całkowitej laparoskopowej histerektomii z obustronną resekcją jajników. Jajniki szczotkowano sterylną cytoszczoteczką w celu zebrania nabłonka. Pierwszorzędowe linie komórkowe utworzono i transdukowano za pomocą hTERT przy użyciu podejścia opisanego powyżej. Szczegóły dotyczące kultury OSEC w 2D, 3D i unieśmiertelnienia OSEC można znaleźć w piśmiennictwie 10 i 11.
8. Aby utworzyć heterotypowe sferoidy, najpierw należy ponownie nakarmić kultury samych sferoidów fibroblastów. Następnie zaszczepić hodowle sferoidalne fibroblastów komórkami nabłonkowymi 1x10⁶ w stosunku 4:1 fibroblastów do komórek nabłonkowych. Hodowla sferoid heterotypowych w INOF-GM.
9. Ponownie karmić kultury heterotypowe co 2-3 dni przez dodatkowe 14 dni.

4. Przetwarzanie do obrazowania i analiz molekularnych

1. Do analizy sferoid heterotypowych można zastosować wiele różnych technik. Do obrazowania zaleca się pobieranie sferoidów z naczynia hodowlanego za pomocą pipety o pojemności 25 ml. Powolne pipetowanie zminimalizuje ryzyko zakłócenia architektury sferoidy przez siły ścinające. Sferoidy można następnie umyć w PBS i granulować przez delikatne odwirowanie przy 100 x g przez 10 min; Większe siły odśrodkowe mogą uszkodzić sferoidy. Alternatywnie, kultury można przenieść do probówki sokoła o pojemności 50 ml i pozostawić do osiadania, a następnie usunąć pożywkę wzrostową.
   1. W przypadku immunohistochemii utrwal sferoidy obojętną buforowaną formaliną przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zdepluj sferoidy i zastąp formalinę 70% etanolem. Przetwarzaj na parafinę przy użyciu standardowych protokołów stosowanych w przypadku tkanek ludzkich. Sferoidy zatopione w parafinie można ciąć i barwić hematoksyliną i eozyną lub specyficznymi markerami molekularnymi przy użyciu standardowej immunohistochemii (ryc. 3).
   2. Alternatywnie, sferoidy umyte w PBS można utrwalić w 4% paraformaldehydzie (przygotowanym w PBS), zanurzyć w pożywce OCT o optymalnej temperaturze cięcia i zamrozić w celu zamrożenia i barwienia immunofluorescencyjnego.
2. Do analiz molekularnych sferoidy można zebrać, granulować i dwukrotnie umyć w PBS przed lizą komórek w celu ekstrakcji DNA, RNA lub białka.
3. Do analizy metodą cytometrii przepływowej sferoidy można przemyć w PBS i zdysocjować przez trawienie trypsyną lub akutazą w temperaturze 37 °C. Aby to zrobić, zanurz rurkę Falcon zawierającą sferoidy w łaźni wodnej, aby ułatwić trypsynizację. Całkowita dysocjacja sferoid w zawiesinę pojedynczej komórki może być przyspieszona poprzez pipetowanie roztworu w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Uważaj, aby nie przesadzić z trypsynizacją komórek.

Zneutralizuj reakcję za pomocą równej objętości pożywki hodowlanej i usuń grudki komórek, przepuszczając zawiesinę przez sitko komórkowe o pojemności 40-70 μm. Komórki osadkowe, przemyć PBS, wyliczyć i ponownie zawiesić żądaną liczbę komórek w buforze FACS. Barwić ogniwa zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Reprezentatywne wyniki

To podejście może być używane do szerokiego zakresu zastosowań, a także do badania normalnej biologii jajników, jak również do badania inicjacji raka jajnika. Główną zaletą tego podejścia w porównaniu z kulturami 3D stworzonymi przy użyciu dostępnego na rynku żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej jest to, że normalne fibroblasty jajnika wytwarzają macierz zewnątrzkomórkową, która tworzy rdzeń sferoid. Z naszego doświadczenia wynika, że materiał macierzy wytwarzany przez normalne fibroblasty jajnika jest niejednorodny i bardziej przypomina macierz zewnątrzkomórkową jajnika niż jakikolwiek dostępny na rynku żel macierzowy. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy komórki nabłonkowe, które zostały częściowo przekształcone in vitro przy użyciu zdefiniowanych elementów genetycznych (np. nadekspresji CMYC) i wspólnie wyhodowaliśmy te komórki z prawidłowymi i starczymi fibroblastami jajnika, aby naśladować wczesne stadium raka jajnika w jajniku po menopauzie. Nasze dane sugerują, że starzejące się mikrośrodowisko sprzyja cechom nowotworowym (np. proliferacji) częściowo przekształconych komórek nabłonkowych (ryc. 3), podczas gdy normalne mikrośrodowisko hamuje postęp nowotworu ⁸. Nasze laboratorium i inne zastosowały również podobne podejścia do modelowania prawidłowych komórek nabłonka jajnika ⁹, komórek nabłonka jajowodów, krokowych modeli progresji nowotworu¹⁰ oraz linii komórkowych raka jajnika i endometrium ^11-13 jako homotypowych hodowli sferoidalnych. Zaobserwowaliśmy, że cechy histologiczne komórek normalnych i złośliwych, które nie są wykrywalne podczas hodowli komórek jako monowarstw, są przywracane, gdy komórki są przenoszone do hodowli sferoidalnej. Na przykład cechy histologiczne jasnokomórkowego raka jajnika można wykryć w hodowlach 3D linii komórkowych jasnokomórkowego raka jajnika (ryc. 4), ale nie w jednowarstwowych hodowlach tych samych komórek. Co więcej, komórki hodowane w 3D lepiej odzwierciedlają specyficzną tkankowo ekspresję białek obserwowaną w tkankach pierwotnych w porównaniu z tymi samymi komórkami hodowanymi w tradycyjnych hodowlach jednowarstwowych 2D ^9-11. Te podejścia do modelowania prawidłowych i złośliwych tkanek jajnika stanowią również cenne narzędzia do odkrywania i analizy funkcjonalnej nowych kandydatów na geny supresorowe i onkogeny raka jajnika oraz inne biomarkery molekularne, które mogą być związane z rozwojem choroby ^10,14.

Rysunek 1. Schematyczny przegląd protokołu hodowli heterotypowej 3D. Kolby do hodowli tkankowych są dwukrotnie pokrywane 1% roztworem polyHEMA i pozostawiane do wyschnięcia. Tworzywa sztuczne pokryte PolyHEMA są myte 1x PBS bezpośrednio przed użyciem. Unieśmiertelnione normalne komórki fibroblastów jajnika (4x10⁶ komórek) umieszcza się w kolbie z 20 ml pożywki wzrostowej. Powstawanie i wzrost sferoid monitorowane przez 7 dni. W tym momencie hodowle sferoidów fibroblastów są zaszczepiane komórkami nabłonkowymi 1x10⁶, a oba typy komórek są hodowane wspólnie przez 14 dni, zanim wielokomórkowe sferoidy zostaną zebrane i przetworzone do dalszych zastosowań (analizy molekularne, obrazowanie itp.).

Rysunek 2. Barwienie immunofluorescencyjne hTERT unieśmiertelniło normalne fibroblasty jajników. Zarówno pierwotne normalne fibroblasty jajnika (Pr NOFs), jak i unieśmiertelnione normalne fibroblasty jajnika (INOF) wyrażają białko specyficzne dla fibroblastów (FSP), nie wyrażają cytokeratyny-7 (Ck-7) i wyrażają wimentynę (VIM). Interesujące markery są pokazane na zielono, DNA jest barwione DAPI i pokazane na niebiesko, cytoplazma jest barwiona na niebiesko Evana i pokazana na czerwono.

Rysunek 3. Immunohistochemia współhodowanych komórek zrębu i nabłonka. Lewy panel, normalna monokultura sferoidalna fibroblastów jajnikowych, wybarwiona hematoksyliną i eozyną. Normalne komórki fibroblastów jajnika hodowane samodzielnie w 3D tworzą sferoidy składające się z komórek o wrzecionowatej morfologii i obfitej macierzy zewnątrzkomórkowej. Prawy panel: normalne fibroblasty jajników zostały wystawione na działanie nadtlenku wodoru w celu wywołania starzenia. Częściowo przekształcone komórki nabłonka jajnika (IOSE^cmyc) dodano do 7-dniowych sferoidów fibroblastów starczych. Po dodatkowych 14 dniach kohodowli, sferoidy utrwalono, zatopiono w parafinie, pocięto i podwójnie wybarwiono w celu uzyskania markera proliferacji (MIB1, różowy) i, w celu rozróżnienia dwóch typów komórek, markera nabłonkowego (pan-cytokeratyna, brązowy). Eozyna została użyta jako przeciwbarwienie, niebarwione fibroblasty w rdzeniu sferoidy są wyraźnie widoczne (gwiazdki). Dolny panel: kwantyfikacja proliferacji komórek nabłonkowych w podwójnie barwionych kokulturach. W badaniu wykorzystano nieśmiertelne linie komórkowe nabłonka powierzchni jajnika (IOSE) od trzech różnych pacjentek (IOSE4, IOSE11 i IOSE19). Starzejące się fibroblasty (SEN) sprzyjają proliferacji współhodowanych komórek^cmyc IOSE znacznie bardziej niż te same komórki przed indukcją starzenia (przed starzeniem się, PSN). Rodzicielskie komórki IOSE bez nadekspresji CMYC nie wykazują różnicy w proliferacji, gdy są hodowane wspólnie z fibroblastami PSN lub SEN. Dane te sugerują, że w naszym modelu kohodowli in vitro procesy starzenia się zrębu jajnika mogą sprzyjać rozwojowi OCs ¹¹. *P≤0,05, dwustronny test T-T w parach.

Rysunek 4. Cechy histologiczne komórek hodowanych w 3D odzwierciedlają tkanki pierwotne. (A) Rak jajnika jasnokomórkowego wykazuje charakterystyczne struktury komórek przezroczystych, których nie ma, gdy linie EOC komórek przezroczystych są hodowane na plastiku, ale podobne struktury są wykrywane, gdy te same komórki są hodowane jako sferoidy 3D (B). (C) Skaningowy mikroskop elektronowy normalnych komórek nabłonka jajników hodowanych jako sferoidy przez 14 dni. Widoczne są mikrokosmki powierzchniowe (strzałki). (D) Sferoidy linii komórkowej surowiczego raka jajnika w hodowli. Panie przewodniczący, panie i panowie! Barwienie hematoksyliną i eozyną w przekrojowej tkance nowotworowej zatopionej w parafinie lub sferoidach 3D; C) skaningowa mikroskopia elektronowa; (D) mikroskopia z kontrastem fazowym. Sferoidy mogą mieć kształt kulisty (przerywany okrąg) lub nieregularny, jak w przypadku struktury widocznej po lewej stronie obrazu.

Rozmiar naczynia/talerza Objętość PolyHEMA (do dwukrotnego nałożenia) Tom końcowy pożywki hodowlanej Płytka 6-dołkowa Pojemność 3 ml 5-7 ml Płytka 12-dołkowa Pojemność 1,5 ml Pojemność 2 ml Płytka 24-dołkowa 500 μl Pojemność 1,5 ml Płytka 48-dołkowa 250 μl 500 μl Płytka 96-dołkowa 50 μl 200 μl Naczynie hodowlane P100 4-5 ml Pojemność 20 ml Naczynie hodowlane P60 2-3 ml 5-7 ml Kolba F25 2-3 ml Pojemność 7 ml Kolba F75 4-5 ml 20-30 ml Kolba F175 Pojemność 15 ml 30-50 ml

Tabela 2. Zalecane objętości do powlekania polyHEMA i hodowli 3D.

Dyskusja

Biologia nabłonkowego raka jajnika we wczesnym stadium (EOC) jest słabo poznana. Być może jedną z głównych przeszkód w tej dziedzinie od wielu lat jest brak zrozumienia specyficznego dla tkanek pochodzenia choroby oraz znaczenia roli mikrośrodowiska w rozwoju EOC. W ciągu ostatnich kilku lat stało się jasne, że EOC jest chorobą heterogenną z wieloma odrębnymi podtypami histopfatologicznymi, prawdopodobnie o różnym pochodzeniu komórkowym dla różnych podtypów. Na przykład obecne dane sugerują, że surowicze EOC o wysokim st...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PolyHEMA, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma Aldrich	P3932
Etanol klasy biologii molekularnej	Sigma Aldrich	E7023
Sterylna woda do hodowli komórkowych	VWR	12001-356
MCDB105	Sigma Aldrich	M6395
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154
Hyclon Bydło płodowe surowica	Thermo Scientific	SH30088.03
Gentamycyna	Sigma Aldrich	G1397
Amfoterycyna B	Sigma Aldrich	A2942
pBABE-higro-hTERT	Addgene	1773
PBS	VWR	12001-766
0,25% trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-072
Sitko komórkowe ( 40 lub 70 mil; m)	VWR	21008-949 21008-952
Przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym antyfibroblastom, klon 1B10	Sigma	F4771
Przeciwciało anty-pan-cytokeratynowe (C11)	Santa Cruz	sc-8018
Polibren (bromek heksadimetryny)	Sigma	107689
TeloTAGGG Telomeraza PCR ELISAPLUS	Roche
Test długości telomerów TeloTAGGG	Roche	12209136001
Tabela 1. Odczynniki i sprzęt, o których mowa w tym badaniu.