Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedstawiamy nowatorską metodę leczenia raka pęcherza moczowego z wykorzystaniem wewnątrz pęcherzowego podania małych aktywujących RNA (saRNA) w ortotopowym modelu ksenoprzeszczepu guza pęcherza moczowego u myszy. Model mysi jest opracowywany poprzez cewnikowanie cewki moczowej w znieczuleniu ogólnym wziewnym. Następnie, aby uszkodzić warstwę glikozaminoglikanów pęcherza i umożliwić przyleganie komórek, w śluzówce pęcherza wywołuje się oparzenie chemiczne za pomocą wewnątrz pęcherzowego roztworu azotanu srebra. Po kilkukrotnym przemyciu sterylną wodą, ludzkie komórki raka pęcherza moczowego KU-7-luc2-GFP są wprowadzane przez cewnik do pęcherza, gdzie pozostają przez 2 godziny. Następujący po tym wzrost guzów pęcherza jest potwierdzany i monitorowany za pomocą ultradźwiękowego badania pęcherza in vivo oraz obrazowania bioluminescencyjnego. Następnie guzy są leczone wewnątrz pęcherzowo za pomocą saRNA sformułowanego w nanocząsteczkach lipidowych (LNPs). Wzrost guza jest monitorowany za pomocą ultradźwięków i bioluminescencji. Wszystkie etapy tej procedury są zaprezentowane w towarzyszącym filmie.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.
1. Przygotowanie komórek
- Ludzką linię komórkową raka pęcherza moczowego KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) hoduje się w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 50 μg/ml gentamycyny.
- Kultury utrzymuje się w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni.
- Komórki zbierano poprzez trawienie trypsyną i zliczano za pomocą hemocytometru. W soli fizjologicznej (PBS) przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek o stężeniu 2 x 106 komórek w 50 μl, którą przechowywano w lodzie.
2. Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego
- Wykorzystano samice myszy nude (nu/nu) w wieku 8-10 tygodni (Simonsen Laboratory, Gilory, CA).
- Na podkładce grzewczej należy rozłożyć jałową draperię, która posłuży jako platforma chirurgiczna. Należy przygotować jałowy żel nawilżający, cewniki 24G z wprowadnikami, roztwór azotanu srebra oraz jałową wodę.
- Znieczulenie ogólne u myszy indukuje się za pomocą wziewnego izofluranu (3% do indukcji, 1-2% do podtrzymania), a następnie podtrzymuje za pomocą maski nosowej. Do oczu zwierzęcia nakłada się jałową maść oftalmiczną, a do utrzymania ciepłoty ciała stosuje się podkładkę grzewczą.
- Mysz należy ułożyć w pozycji grzbietnej.
- Srom myszy należy delikatnie uchwycić pincetą w celu stabilizacji.
- Cewnikowanie cewki moczowej myszy wykonuje się za pomocą dożylnego cewnika 24G po usunięciu igły prowadzącej. Należy zastosować obfitą ilość środka nawilżającego. Przy myszy w pozycji grzbietnej cewka moczowa znajduje się bezpośrednio za fałdami sromowymi i przed pochwą. Początkowo przyjmuje się kąt 45 stopni, aby wprowadzić cewnik do cewki moczowej i przejść pod kością łonową. Następnie stosuje się mniejszy kąt, aby przejść przez cewkę moczową do pęcherza. Pomocne może być delikatne uciskanie miednicy w celu wyprostowania cewki moczowej. Należy zachować ostrożność, aby nie naciskać zbyt mocno w przypadku napotkania oporu, ponieważ może to doprowadzić do perforacji cewki moczowej lub pęcherza. Pojawienie się moczu w cewniku potwierdza jego obecność w świetle pęcherza.
- Mocz z cewnika i światła pęcherza odsysa się za pomocą igły prowadzącej. Igła prowadząca jest używana do wszystkich kolejnych aspiracji i iniekcji, podczas gdy cewnik pozostaje w miejscu. Pozwala to na wstrzykiwanie precyzyjnych objętości poprzez wyeliminowanie przestrzeni martwej w cewniku i sprawia, że wielokrotne cewnikowanie staje się niepotrzebne.
- Aby uszkodzić warstwę glikozaminoglikanów urothelium pęcherza, wstrzykuje się 10 μL 0,5 M azotanu srebra i pozostawia go na 10 sekund. Może to doprowadzić do powstania białego osadu z pozostałym moczem.
- Osad oraz zawartość pęcherza należy odessać i usunąć za pomocą igły prowadzącej.
- Pęcherz należy przepłukać, wstrzykując 100 μL jałowej wody. Następnie wodę należy odessać i usunąć. Płukanie jałową wodą należy powtórzyć 3 razy, co daje łącznie 4 płukania.
- Wokół ujścia cewki moczowej należy zawiązać jedwabną nić 4-0, aby zamknąć cewkę moczową w przygotowaniu do usunięcia cewnika.
- Za pomocą igły prowadzącej wstrzykuje się wcześniej przygotowane 2 x 106 komórek KU-7-luc2-GFP w 50 μL.
- Cewnik i igłę prowadzącą należy usunąć jednocześnie, pozostawiając cewkę moczową zamkniętą jedwabną nicią.
- Myszy utrzymuje się w znieczuleniu ogólnym przez 2 godziny, po czym usuwa się jedwabną nić i doprowadza zwierzę do przebudzenia.
3. Ultradźwięki
- Znieczulenie ogólne indukuje się za pomocą odparowanego izofluranu i utrzymuje przy użyciu maski nosowej.
- Wykorzystano system wysokorozdzielczego obrazowania mikrostrukturalnego In Vivo VisualSonics Vevo 770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) z głowicą RMV-704 40 MHz.
- Myszy umieszcza się w pozycji grzbietnej na platformie do USG.
- tylne kończyny zwierzęcia należy przymocować taśmą, aby uniknąć nadmiernych ruchów podczas manipulowania głowicą ultradźwiękową.
- Na miednicę myszy nakłada się żel do USG.
- Głowicę ultradźwiękową RMV-704 (40 MHz) opuszcza się na miednicę myszy, aby uzyskać obrazy w przekroju poprzecznym lub podłużnym.
- W przypadku wykrycia guza obrazy mogą zostać zapisane w celu pomiaru jego wymiarów.
4. Obrazowanie bioluminescencyjne
- Wykonaj wtrysk doszpczewnowy 200 μL (150 mg/kg) substratu lucyferyny.
- Wprowadź znieczulenie ogólne za pomocą odparowanego izofluranu i utrzymuj je poprzez stożek nosowy.
- Umieść myszy w pozycji grzbietnej w urządzeniu do obrazowania bioluminescencyjnego.
- Pięć minut po wtrysku lucyferyny zmierz bioluminescencję zwierzęcia w fotonach na sekundę.
5. Przygotowanie saRNA
- Zsyntetyzować oligonukleotydy RNA w skali 50-100 μmol.
- Przeprowadzić hybrydyzację komplementarnych jednoniciowych oligonukleotydów w celu otrzymania dwuniciowych saRNA.
- Nanocząsteczki lipidowe (LNP)-saRNA przygotować z wykorzystaniem jonizowalnego lipidu 1,2-dilinoleyl-4-(2- dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane (DLinKC2-DMA), dListeroylphosphatidyl choline, cholesterolu oraz PEG–DMG, stosując procedurę formulacji opartą na spontanicznym tworzeniu pęcherzyków, zgodnie z wcześniejszym opisem.1
6. Podanie dostraszykalne sformułowanego saRNA
- Po stworzeniu ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego, myszy poddaje się leczeniu poprzez podanie dojścia do pęcherza (dożylnie) małego aktywującego RNA (saRNA) sformułowanego w nanocząsteczkach lipidowych (LNPs) (Tabela 1).
- Znieczulenie ogólne wprowadza się i utrzymuje za pomocą odparowanego izofluranu, a do oczu aplikuje się sterylny lubrykant oftalmiczny.
- Zwierzę należy ułożyć w pozycji na plecach.
- Należy przeprowadzić cewnikowanie moczowodu zgodnie z wcześniejszym opisem.
- Wokół cewki moczowej i cewnika należy zawiązać jedwabną nicią 4-0.
- Za pomocą pustej strzykawki i igły z prowadnikiem należy odessać cały mocz z cewnika i pęcherza.
- LNP-saRNA wstrzykuje się do pęcherza moczowego w całkowitej dawce 50 μL (3 mg/kg). Jednocześnie należy usunąć cewnik i igłę z prowadnikiem, pozostawiając cewkę moczową zamkniętą za pomocą jedwabnej nici.
- Mysz pozostaje pod narkozą z zamkniętą cewką moczową przez 2 godziny.
- Leczenie z wykorzystaniem LNP-saRNA podawanego do pęcherza rozpoczęto w 4. dniu po implantacji guza. Myszy leczono seryjnie, co 3 dni, łącznie przez 14 zabiegów.
7. Reprezentatywne wyniki
Guzy pęcherza moczowego pochodzące z komórek KU-7-luc2-GFP można monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego lucyferazy (Rycina 1A i C) oraz USG pęcherza moczowego (Rycina 1B i D). Guzy są często wykrywalne w ciągu 3–5 dni po inokulacji komórek. Odnotowaliśmy pomyślną implantację guza pęcherza u ponad 90% myszy. W miarę wprowadzania leczenia wewnątrz pęcherzowego dsRNA, postęp nowotworu można monitorować za pomocą tych metod. Po uśmierceniu zwierzęcia wzrost guza można również potwierdzić za pomocą fluorescencji GFP. W ujęciu ogólnym średnia bioluminescencja korelowała ze średnimi wymiarami w badaniu USG dla guzów pęcherza, co widoczne jest na Rycynach 1C i 1D. Jednak po uśmierceniu zwierząt i potwierdzeniu obecności guza za pomocą GFP stwierdzono, że bioluminescencja ściślej korelowała z obecnością żywej tkanki nowotworowej niż pomiary USG. Było to szczególnie wyraźne u myszy leczonych saRNA (w przeciwieństwie do grupy kontrolnej), ponieważ pozostała tkanka bliznowata u leczonych myszy była często widoczna w USG, ale nie można jej było odróżnić od żywego guza.
Rysunek 1. Kinetyka wzrostu guzów pęcherza moczowego. (A) Obrazowanie bioluminescencyjne mierzy aktywność lucyferazy w guzach pęcherza w celu potwierdzenia ich lokalizacji i wzrostu. (B) Ultrasonografia pęcherza in vivo z użyciem głowicy 40MHz generuje obrazy guzów, których wymiary można dokładnie zmierzyć. (C) Wykresy ilustrujące postępujący wzrost bioluminescencji i wymiarów ultrasonograficznych guza. Wartości reprezentują średnie pomiary (+/- odchylenie standardowe) z 6 zwierząt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy protokół ustanowienia ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pęcherza moczowego u myszy, a następnie leczenia guzów metodą wewnątrz pęcherzową z zastosowaniem saRNA sformułowanego w LNP, który celuje w promotor p21CIP1/WAF1 (p21) w celu aktywacji transkrypcyjnej.2, 3 Powstałe guzy można potwierdzić i monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz USG pęcherza moczowego. Modele ortotopowe mogą być lepsze od modeli doszczepowych, podskórnych lub dożylnych, ponieważ z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
L.C.L. jest wymienionym wynalazcą w oczekujących wnioskach patentowych dotyczących saRNA, które zostały złożone przez University of California San Francisco i licencjonowane firmie Alnylam Pharmaceuticals.
Podziękowania
Badania te są finansowane z grantu AACR Henry Shepard Bladder Cancer Research Grant (09-60-30-LI).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki KU-7-luc-GFP | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| myszy nago-tymiczne (nu/nu) | Simonsen Laboratories | wiek 6-7 tygodni | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Urządzenie do ultrasonografii | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | sonda RMV-704 |
| Urządzenie do bioluminescencji | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Kaniula Exel safelet | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Azotan srebra | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Strzykawka Hamiltona | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt. |
Bibliografia
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523(2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535(2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
