Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów z komórek odpornościowych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego myszy przez przeszczep szpiku kostnego

Podsumowanie

Przeszczep szpiku kostnego umożliwia zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku kostnego. Jeśli gen będący przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego, jak i w komórkach niepochodzących ze szpiku kostnego, przeszczep szpiku kostnego może zmienić komórki pochodzące ze szpiku kostnego na inny genotyp bez zmiany genotypu komórki niepochodzącej ze szpiku kostnego.

Streszczenie

Aby zrozumieć rolę genu w rozwoju zapalenia jelita grubego, porównaliśmy reakcje myszy dzikiego typu i myszy z niedoborem genu nokautu na zapalenie jelita grubego. Jeżeli gen będący przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego, jak i w komórkach gospodarza niepochodzących ze szpiku kostnego; Możliwe jest jednak zróżnicowanie roli interesującego genu w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego i komórkach niepochodzących ze szpiku kostnego za pomocą techniki przeszczepu szpiku kostnego. Aby zmienić genotyp komórek pochodzących ze szpiku kostnego myszy, oryginalny szpik kostny myszy biorców został zniszczony przez napromienianie, a następnie zastąpiony nowym szpikiem kostnym dawcy o innym genotypie. Kiedy szpik kostny dawcy myszy typu dzikiego został przeszczepiony myszom z nokautem, mogliśmy wygenerować myszy z nokautem z ekspresją genów typu dzikiego w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego. Alternatywnie, gdy szpik kostny dawcy myszy z nokautem przeszczepiono myszom biorcom typu dzikiego, wyprodukowano myszy typu dzikiego bez genu wyrażającego się z komórek pochodzących ze szpiku kostnego. Jednak przeszczep szpiku kostnego może nie być w 100% kompletny. Dlatego wykorzystaliśmy cząsteczki klastra różnicowania (CD) (CD45.1 i CD45.2) jako markery komórek dawcy i biorcy do śledzenia proporcji komórek pochodzących ze szpiku kostnego dawcy u myszy biorców i powodzenia przeszczepu szpiku kostnego. Użyto myszy typu dzikiego z genotypem CD45.1 i myszy z nokautem z genotypem CD45.2. Po napromienieniu myszy biorców, komórki szpiku kostnego dawcy o różnych genotypach zostały wstrzyknięte myszom biorcy. Kiedy nowy szpik kostny zregenerował się, aby przejąć jego odporność, myszy zostały poproszone o działanie środka chemicznego (siarczan dekstranu sodu, DSS 5%) w celu wywołania zapalenia jelita grubego. Tutaj również pokazaliśmy metodę wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i oceny roli interesującego genu wyrażanego z komórek pochodzących ze szpiku kostnego. Jeśli interesujący gen z komórek pochodzących z kości odgrywa ważną rolę w rozwoju choroby (takiej jak zapalenie jelita grubego), fenotyp myszy biorcy po przeszczepie szpiku kostnego może ulec znacznej zmianie. Pod koniec eksperymentów z zapaleniem jelita grubego komórki pochodzące ze szpiku kostnego we krwi i szpiku kostnym znakowano przeciwciałami przeciwko CD45.1 i CD45.2, a ich ilościowy stosunek istnienia można było wykorzystać do oceny powodzenia przeszczepu szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Udany przeszczep szpiku kostnego powinien wykazać zdecydowaną przewagę genotypu dawcy (pod względem markera cząsteczki CD) w stosunku do genotypu biorcy zarówno w szpiku kostnym, jak i we krwi myszy biorcy.

Protokół

1. Zanim zaczniesz Rozważania techniczne

1. Zalecamy używanie zarówno myszy typu dzikiego C57 / BL6 jak i myszy z nokautem do eksperymentów, ponieważ myszy z odpowiednimi cząsteczkami CD można kupić od głównych dostawców myszy.
2. Ponieważ trudno jest śledzić myszy typu dzikiego i myszy z nokautem pochodzących od myszy po przeszczepie szpiku kostnego, konieczne jest użycie myszy CD45.1 do reprezentowania myszy typu dzikiego. (CD45.1 C57/SJL WT myszy Jackson Laboratories stock #002014).
3. Większość kolonii myszy to CD45.2. Nasze myszy z nokautem należą do genotypu CD45.2 (alternatywnie myszy CD45.2 WT źródło: Jackson Laboratories stock #000664). Oznaczenie genotypu CD45.1 lub CD45.2 można przeprowadzić za pomocą cytometrii przepływowej szpiku kostnego i krwi obwodowej, jak wspomniano w punkcie 7 niniejszego protokołu.
4. Myszy po napromienianiu mają obniżoną odporność. Trzymaj myszy w obiekcie wolnym od patogenów.
5. Obsługa promiennika wymaga specjalnego poświadczenia bezpieczeństwa i przeszkolenia. Aby zaoszczędzić czas w procesach szkolenia i zatwierdzania, najlepiej jest współpracować z laboratorium z wykwalifikowanym technikiem, który jest w stanie obsługiwać promiennik.
6. Wiele instytucji posiada laboratoria cytometrii przepływowej z doświadczonymi technikami. Aby zminimalizować problemy z działaniem cytometrii przepływowej, lepiej omówić plan eksperymentu z cytometrią przepływową z doświadczonym technikiem przed rozpoczęciem.
7. Myszy przydzielono w następujący sposób (10 myszy na grupę):

grupa   Od dawcy szpiku kostnego do biorcy leczenie ZA Giełda BM Od CD45.1 WT do CD45.2 KO Zapalenie jelita grubego DSS W     Normalna kontrola wody Z Giełda BM CD45.2 KO do CD45.1 WT Zapalenie jelita grubego DSS D     Normalna kontrola wody E udawany Od CD45.1 WT do CD45.1 WT Zapalenie jelita grubego DSS Z     Normalna kontrola wody Z udawany Od CD45.2 KO do CD45.2 KO Zapalenie jelita grubego DSS H     Normalna kontrola wody

* Krótka ilustracja protokołu eksperymentalnego jest pokazana na rysunku 1.

2. Napromienianie myszy odbiorcy

1. Myszy są hodowane i trzymane w obiekcie wolnym od patogenów. Umieść myszy w autoklawowanym torcie do napromieniania z filtrem. Umieść po jednej myszy w każdym slocie tortu napromieniowującego. Umieść ciasto w promienniku i upewnij się, że talerz obrotowy i ciasto się obracają.
2. Włącz pompę powietrza w celu wentylacji. Zamknij drzwiczki nagrzewnicy i zablokuj je.
3. Napromieniuj myszy 1000 rad (co odpowiada 10 Gy) około 10 minut (w zależności od źródła promieniowania i okresu półtrwania). Od tego momentu napromieniowane myszy mają obniżoną odporność i słabą odporność na infekcje. Po napromieniowaniu wyjmij ciasto i umieść je w sterylnym pojemniku w celu transportu do szafki bezpieczeństwa biologicznego w pomieszczeniu dla zwierząt. Unikaj wystawiania myszy na działanie środowiska zewnętrznego, aby zminimalizować ryzyko infekcji.
4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś myszy do autoklawowanych klatek dla myszy z autoklawowaną ściółką (4 myszy na klatkę. Dodać nową sterylną wodę z zawiesiną sulfatrimu - 3,12 ml na 100 ml wody).
5. Owiń butelkę z wodą folią aluminiową, ponieważ antybiotyki są wrażliwe na światło. Wstrząśnij, aby dobrze wymieszać butelkę z roztworem sulfatrimu przed włożeniem jej do klatki.

3. Pobranie szpiku kostnego od dawcy

1. Poświęć myszy dwutlenkiem węgla lub izoflurancją, a następnie zanurz je w roztworze lizolu w proporcji 1:200. Spryskaj myszy 70% etanolem, aby zwilżyć skórę i wyciąć otwarte kości.
2. Namocz narzędzia preparacyjne w 70% etanolu do sterylizacji.
3. Wykonaj sekcję w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Użyj sterylnych narzędzi preparacyjnych, aby odsłonić kość ramienną, udową, piszczelową i strzałkową, wolne od przyczepiania się mięśni i więzadeł.
4. Rozetnij oba końce kości, aby pokazać czerwony szpik kostny. Przytrzymaj kości kleszczami. Wypłukać czerwony szpik kostny zimnym PBS za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igieł 25 G na szalkę Petriego. Spłucz z obu końców kości, aby uzyskać więcej komórek szpiku kostnego.
5. Za pomocą strzykawek o pojemności 6 ml i igieł 18G1/2 należy rozbić czerwone czopy szpiku kostnego poprzez wielokrotne zasysanie i wyrzucanie. Przenieść szpik kostny za pomocą 50 ml probówek Falcon.
6. Obracać szpik kostny z prędkością 1 800 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad przez wirowanie przez 5-10 sekund.
7. Rozcieńczyć 10-krotny bufor do lizy RBC sterylną wodą. Dodaj 1X bufor do lizy RBC (5 ml na mysz dawcy), ponownie wiruj przez 5 sekund i trzymaj dokładnie 3 minuty w temperaturze pokojowej.
8. Po 3 minutach napełnij probówki 20 ml zimnego PBS, aby zatrzymać lizę i wymieszać. Przelej zawartość przez sitko o pojemności 40 μm bezpośrednio do nowej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
9. Przepłukać oryginalne probówki 5 ml PBS i również przenieść do sitka komórkowego. Uzupełnić do 50 ml PBS i wymieszać.

4. Liczenie komórek dawcy szpiku kostnego

1. Dodać 100 μl błękitu trypanowego do probówki Eppendorfa i 100 μl zawiesiny szpiku kostnego do probówki Eppendorfa i wymieszać. Odpipetować mieszaninę barwionych komórek do hemocytometru.
2. Ilość komórek oblicza się na podstawie całkowitej liczby żywych komórek szpiku kostnego w probówkach Falcona = liczba komórek niebarwionych w 16 kwadratach x 2 (ze względu na rozcieńczenie błękitu trypanowego) x 10 000 x 50 ml
3. Wirować komórki szpiku kostnego w 50 ml probówkach Falcon z prędkością 2 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć supernatant. Na podstawie całkowitej liczby komórek, ponownie zawiesić osad z PBS do 1 x 10⁸ komórek na ml

5. Napar dla myszy biorców

1. Ogrzej myszki biorcy na poduszce grzewczej i pod ogrzewającą lampą. Umieść myszy biorcy w uwięzi. Wstrzyknąć dożylnie 1 x 10⁷ komórek na mysz w 100-200 μl.
2. Wstrzyknięcie szpiku kostnego dawcy musi być wykonane między 4 a 24 godzinami po napromienianiu.
3. Trzymaj do 4 myszy z wstrzykniętymi implantami w klatce. Utrzymuj myszy biorcy, którym wstrzyknięto implanty, w autoklawowanych klatkach z wodą potraktowaną antybiotykami przez pierwsze 4 tygodnie w obiekcie dla zwierząt wolnych od patogenów i pozwól myszom odzyskać odporność. Zmieniaj klatki, wodę i jedzenie nasączone antybiotykami co 4 dni, aby zachować higienę.

6. Indukcja zapalenia jelita grubego i ocena zapalenia jelita grubego

1. 4 tygodnie po napromienianiu i przeszczepie szpiku kostnego przestaw się na zwykłą wodę bez antybiotyków i utrzymuj myszy przez kolejne 2 tygodnie, aby odzyskać normalną mikroflorę jelitową.
2. 6 tygodni po wstrzyknięciu szpiku kostnego zmierz początkową masę ciała. Niektórym myszom podaje się 5% siarczan dekstranu w wodzie pitnej ad libitum w celu wywołania zapalenia jelita grubego. Niektórym myszom podaje się zwykłą wodę pitną tylko jako normalne grupy kontrolne.
3. 5 dni później pobrać krew obwodową, przenieść do probówek powlekanych heparyną (Vacutainer) i przechowywać w lodzie. Zbierz krew z 4 myszy do 1 probówki. Połączyć 300 μl krwi z 300 μl buforu do barwienia komórek = 600 μl. Podzielić krew na 5 probówek Eppendorfa, każda o objętości 100 μl.
4. Poświęć myszy dwutlenkiem węgla lub izofluranem. Oceń makroskopowe oceny uszkodzeń (szczegółowe informacje można znaleźć w innej publikacji wideo JOVE ¹). Zmierz zmianę masy ciała. Zmierz długość i grubość jelita za pomocą suwmiarki cyfrowej. Obserwuj teksturę stolca (twardy, miękki lub krwawy). Określ krew utajoną w stolcu za pomocą hemokultyzmu. Wypreparuj tkanki jelita grubego i utrwal w formalinie w celu barwienia H&E.
5. Wyciąć 1 kość udową na mysz, pobrać szpik kostny i przepłukać szpik kostny zimnym PBS za pomocą igły 25G i strzykawki o pojemności 1 ml. Zebrać 4 korki szpiku kostnego do 1 probówki i przechowywać w lodzie.
6. Wlać szpik kostny na szalkę Petriego, kilkakrotnie obciąć czop szpiku kostnego igłą 18 G i strzykawką o pojemności 5 ml, aż do momentu, gdy nie będzie czop szpiku kostnego.
7. Wirować z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić za pomocą 600 μl buforu do barwienia komórek. Zawiesinę szpiku kostnego podzielić na 5 probówek Eppendorfa, każda o objętości 100 μl.

7. Kontrola jakości przeszczepu szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej

1. Oznacz każdą probówkę z próbką krwi lub szpiku kostnego #1-5:
2. Przygotuj mieszaninę przeciwciał dla każdej odpowiedniej probówki w ciemności.

#1 Brak przeciwciał
#2 Kontrola izotypu 30 μl FITC + kontrola izotypu 30 μl PE + 15 μl CD16/32 blokująca
#3 30 μl FITC CD45.1 Ab + 15 μl CD16/32 blokujący
#4 30 μl PE CD45.2 Ab + 15 μl CD16/32 blokujący
#5 Blokowanie 30 μl FITC CD45.1 Ab + 30 μl PE CD45.2 Ab + 15 μl CD16/32

Nie dodawaj nic do próbki krwi lub szpiku kostnego #1 Dodaj 5 μl mieszaniny przeciwciał #2 do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego #2 Dodać 3 μl mieszaniny przeciwciał #3 do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego #3 Dodać 3 μl mieszaniny przeciwciał #4 do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego #4 Dodać 5 μl mieszaniny przeciwciał #5 do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego #5

3. Przechowywać w ciemności w lodzie przez 30 minut.
4. Dodaj 2 ml 1X bufor do lizy RBC do każdej probówki. Przechowywać w ciemności na lodzie przez 15 minut.
5. Odwirować ogniwa z prędkością 1 500 obr./min, 5 min w temperaturze 4 °C. (wirnik GH 3,8, 1 500 obr./min = 350 x g) Usunąć supernatant. Zawiesić osad z 500 μl buforem do barwienia komórek w ciemności, a następnie krótko wirować.
6. Sprawdź CD45.1 (reprezentujące WT) i CD45.2 (reprezentujące KO) w próbkach krwi i szpiku kostnego barwionych immunologicznie za pomocą cytometrii przepływowej. Wybierz FITC do reprezentowania WT CD45.1 i PE do reprezentowania KO CD45.2.
7. Analizuj wyniki cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania FlowJo. Oblicz stosunek FITC:PE lub stosunek PE:FITC, aby określić, czy genotyp dawcy jest genotypem dominującym we krwi i szpiku kostnym.

Wyniki

Jeśli interesujący nas gen odgrywa znaczącą rolę w komórkach odpornościowych podczas rozwoju zapalenia jelita grubego, myszy otrzymujące szpik kostny o innym genotypie poprzez przeszczep szpiku kostnego (WT do KO lub KO do WT) powinny mieć zmienioną odpowiedź na zapalenie jelita grubego DSS. Jednym z najważniejszych parametrów określających nasilenie zapalenia jelita grubego jest barwienie tkanek okrężnicy metodą H&E. Zmiany w strukturze tkanki okrężnicy i oznaki stanu zapalnego można ocenić ilościowo za pomocą syste...

Dyskusja

To podejście do przeszczepu szpiku kostnego jest odpowiednie do badań immunologicznych nad zapaleniem jelita grubego, infekcjami, rakiem, otyłością i innymi chorobami. Ten eksperyment z przeszczepem szpiku kostnego jest potrzebny, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego, jak i niepochodzących ze szpiku kostnego, a podejrzewa się, że gen będący przedmiotem zainteresowania pośredniczy w chorobie przez komórki z którejkolwiek populacji. Na przykład wykaz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do barwienia komórek	Biolegend	#420201
10X bufor do lizy RBC	Biolegend	#420301
Kontrola izotypu myszy FITC	Biolegend	#400207
Kontrola izotypu myszy PE	Biolegend	#400211
PE anty-mysie CD45.2	Biolegend	#109807
FITC anty-mysz CD45.1	Biolegend	#110705
Anty-mysz CD16/32 blokujący	Biolegend	#101301
40 μ m sitko komórkowe	Fisherbrand	#22363547
PBS 1X	MP biomedicals	#1860454
Heparyna	Fisherbrand	#BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (fisher)
Lizol IC	Andwin Scientific	NC9745686 (fisher)
Vaccutainer	BD	#8000813
Ogranicznik myszy	Braintree Scientific	#TV-150
Naczepnik	J.L. Shepherd and Associates	Mark I 68A
Cytometr przepływowy	BD	BD FACSCanto II
Probówka do cytometru przepływowego	Falcon	#352052
Suwmiarka cyfrowa	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman Coulter