Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów w komórkach immunologicznych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego u myszy za pomocą transplantacji szpiku kostnego

Hon Wai Koon; Samantha Ho; Michelle Cheng; Ryan Ichikawa; Charalabos Pothoulakis

doi:10.3791/4208

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów w komórkach immunologicznych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego u myszy za pomocą transplantacji szpiku kostnego

18.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4208

⸱

1 października 2012

Hon Wai Koon¹ , Samantha Ho¹ , Michelle Cheng¹ , Ryan Ichikawa¹ , Charalabos Pothoulakis¹

¹Center for Inflammatory Bowel Diseases, Division of Digestive Diseases, David Geffen School of Medicine, The University of California Los Angeles, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Przeszczep szpiku kostnego umożliwia zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku. Jeśli interesujący nas gen jest ekspresowany zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku, jak i w komórkach niepochodzących ze szpiku, przeszczep szpiku kostnego pozwala na zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku bez zmiany genotypu komórek niepochodzących ze szpiku.

Streszczenie

Aby zrozumieć rolę genu w rozwoju colitis, porównaliśmy reakcje myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu zainteresowania na colitis. Jeśli gen zainteresowania jest ekspresowany zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego, jak i w komórkach niepochodzących ze szpiku kostnego gospodarza, możliwe jest rozróżnienie roli tego genu w obu tych grupach komórek za pomocą techniki transplantacji szpiku kostnego. Aby zmienić genotyp komórek pochodzących ze szpiku kostnego u myszy, pierwotny szpik kostny myszy biorców został zniszczony poprzez napromieniowanie, a następnie zastąpiony nowym szpikiem kostnym od dawcy o innym genotypie. Gdy szpik kostny od myszy typu dzikiego został przeszczepiony myszom z nokautem, uzyskaliśmy myszy z nokautem z ekspresją genu typu dzikiego w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego. Alternatywnie, gdy szpik kostny od myszy z nokautem został przeszczepiony myszom biorcom typu dzikiego, otrzymano myszy typu dzikiego bez ekspresji genu zainteresowania w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego. Jednak transplantacja szpiku kostnego może nie być w 100% kompletna. Dlatego wykorzystaliśmy cząsteczki klastrów różnicowania (CD) (CD45.1 i CD45.2) jako markery komórek dawcy i biorcy, aby monitorować proporcję komórek pochodzących ze szpiku kostnego dawcy u myszy biorców oraz sukces transplantacji szpiku kostnego. Wykorzystano myszy typu dzikiego o genotypie CD45.1 oraz myszy z nokautem o genotypie CD45.2. Po napromieniowaniu myszy biorców, komórki szpiku kostnego dawców o różnych genotypach zostały przetoczone myszom biorcom. Gdy nowy szpik kostny zregenerował się i przejął funkcje odpornościowe, myszy zostały poddane działaniu czynnika chemicznego (dekstranu siarczanu sodu, DSS 5%) w celu wywołania colitis. Przedstawiliśmy tutaj również metodę indukowania colitis u myszy oraz ocenę roli genu zainteresowania ekspresowanego w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego. Jeśli gen zainteresowania w komórkach pochodzących ze szpiku odgrywa istotną rolę w rozwoju choroby (takiej jak colitis), fenotyp myszy biorców po transplantacji szpiku kostnego może ulec znaczącej zmianie. Po zakończeniu eksperymentów nad colitis, komórki pochodzące ze szpiku kostnego we krwi i w szpiku kostnym zostały znakowane przeciwciałami przeciwko CD45.1 i CD45.2, a ich ilościowy stosunek występowania został wykorzystany do oceny sukcesu transplantacji szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Pomyślna transplantacja szpiku kostnego powinna wykazać zdecydowaną przewagę genotypu dawcy (pod względem markera cząsteczki CD) nad genotypem biorcy zarówno w szpiku kostnym, jak i we krwi myszy biorców.

Protokół

1. Kwestie techniczne przed rozpoczęciem pracy

Zalecamy wykorzystanie w eksperymencie zarówno myszy szczepu C57/BL6 typu dzikiego, jak i myszy z nokautem, ponieważ myszy z odpowiednimi cząsteczkami CD można nabyć od głównych dostawców myszy.
Ze względu na trudności w śledzeniu komórek dawcy pochodzących od myszy typu dzikiego i myszy z nokautem po przeszczepie szpiku kostnego, konieczne jest użycie myszy CD45.1 jako reprezentantów myszy typu dzikiego (myszy CD45.1 C57/SJL WT, Jackson Laboratories nr katalogowy 002014).
Większość kolonii myszy posiada genotyp CD45.2. Nasze myszy z nokautem należą do genotypu CD45.2 (alternatywnie źródło myszy CD45.2 WT: Jackson Laboratories nr katalogowy 000664). Określenie genotypu CD45.1 lub CD45.2 można przeprowadzić za pomocą cytometrii przepływowej szpiku kostnego i krwi obwodowej, zgodnie z opisem w sekcji 7 niniejszego protokołu.
Myszy po napromieniowaniu mają upośledzoną odporność. Należy utrzymywać myszy w warunkach wolnych od patogenów (SPF).
Obsługa irradiatora wymaga specjalnego pozwolenia z zakresu bezpieczeństwa oraz przeszkolenia. Aby skrócić czas szkolenia i procesów zatwierdzania, najlepiej nawiązać współpracę z laboratorium posiadającym wykwalifikowanego technika zdolnego do obsługi irradiatora.
Wiele instytucji dysponuje laboratoriami cytometrii przepływowej z doświadczonymi technikami. Aby zminimalizować problemy z obsługą cytometru, zaleca się omówienie planu eksperymentu z doświadczonym technikiem przed jego rozpoczęciem.
Myszy przydzielono w następujący sposób (10 myszy na grupę):

Grupa		Przeniesienie szpiku kostnego od dawcy do biorcy	Leczenie
A	wymiana BM	CD45.1 WT do CD45.2 KO	WZW indukowane DSS
B			Kontrola prawidłowa z wodą
C	wymiana BM	CD45.2 KO do CD45.1 WT	zapalenie jelita grubego indukowane DSS
D			Kontrola z wodą (kontrola normalna)
E	grupa pozorowana	CD45.1 WT do CD45.1 WT	WZW indukowane DSS
F			Kontrola ujemna z wodą
G	Koszowy (zabieg pozorowany)	CD45.2 KO do CD45.2 KO	układowe zapalenie jelit indukowane DSS
H			Kontrola wodna (grupa kontrolna)

* Krótka ilustracja protokołu eksperymentalnego przedstawiona jest na Rysunku 1.

2. Naświetlanie myszy biorców

Myszy hoduje się i utrzymuje w pomieszczeniu wolnym od patogenów. Umieść myszy w autoklawowanym targecie do napromieniowania z filtrem. W każdym gnieździe targetu umieść jedną mysz. Włóż target do irradiatora i upewnij się, że tarcza obrotowa oraz target obracają się.
Włącz pompkę powietrzną w celu zapewnienia wentylacji. Zamknij drzwi irradiatora i zablokuj je.
Napromieniuj myszy dawką 1 000 rad (co odpowiada 10 Gy) przez około 10 min (w zależności od źródła promieniowania i okresu półtrwania). Od tego momentu napromieniowane myszy są immunokompromitowane i wykazują słabą odporność na infekcje. Po napromieniowaniu wyjmij target i umieść go w sterylnym pojemniku w celu transportu do komory bezpieczeństwa biologicznego w pomieszczeniu dla zwierząt. Unikaj wystawiania myszy na działanie środowiska zewnętrznego, aby zminimalizować ryzyko infekcji.
W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś myszy do autoklawowanych klatek z autoklawowaną ściółką (4 myszy na klatkę). Dodaj nową sterylną wodę z zawiesiną sulfatrimu – 3,12 ml na 100 ml wody).
Owiń butelkę z wodą folią aluminiową, ponieważ antybiotyki są światłoczułe. Przed umieszczeniem butelki w klatce dobrze wstrząśnij nią, aby wymieszać roztwór sulfatrimu.

3. Pobieranie szpiku kostnego od dawcy

Uśmiercić myszy przy użyciu dwutlenku węgla lub izofluranu, a następnie zanurzyć je w 1:200 roztworze Lysol. Spryskać myszy 70% etanolem w celu zwilżenia skóry i przeprowadzić sekcję kości.
Namoczyć narzędzia do sekcji w 70% etanolu w celu sterylizacji.
Przeprowadzić sekcję w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Używając sterylnych narzędzi do sekcji, odsłonić kość ramienną, udową, piszczelową i strzałkową, usuwając przytwierdzone mięśnie i więzadła.
Przeciąć oba końce kości, aby odsłonić czerwony szpik kostny. Przytrzymać kości pęsetą. Wypłukać czerwony szpik kostny zimnym PBS do szalki Petriego, używając strzykawki 3 ml i igły 25G. Płukać z obu końców kości, aby uzyskać więcej komórek szpiku.
Użyć strzykawek 6 ml i igieł 18G1/2, aby rozbić czopy czerwonego szpiku kostnego poprzez wielokrotną aspirację i wyrzut. Przenieść szpik kostny do probówek Falcon 50 ml.
Wirować szpik kostny przy 1 800 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant, a osad resuspendować, mieszając na wortexie przez 5-10 sec.
Rozcieńczyć 10X bufor do lizy RBC sterylną wodą. Dodać 1X bufor do lizy RBC (5 ml na mysz dawcę), ponownie mieszać na wortexie przez 5 sec i inkubować dokładnie przez 3 min w temperaturze pokojowej.
Po 3 min wypełnić probówki 20 ml zimnego PBS, aby zatrzymać lizę, i wymieszać. Przespalać zawartość przez sitko komórkowe 40 μm bezpośrednio do nowej probówki Falcon 50 ml.
Wypłukać oryginalne probówki 5 ml PBS i również przenieść zawartość przez sitko komórkowe. Dopełnić objętość do 50 ml za pomocą PBS i wymieszać.

4. Liczenie komórek dawcy szpiku kostnego

Do probówki Eppendorfa dodaj 100 μl błękitu trypanowego, a do drugiej probówki Eppendorfa 100 μl zawiesiny szpiku kostnego, a następnie wymieszaj. Przenieś pipetą mieszaninę barwionych komórek do komory liczowej (hemocytometru).
Liczbę komórek oblicza się według wzoru: całkowita liczba żywych komórek szpiku kostnego w probówkach Falcon = liczba niebarwionych komórek w 16 polach x 2 (ze względu na rozcieńczenie błękitem trypanowym) x 10 000 x 50 ml
Odwirowuj komórki szpiku kostnego w probówkach Falcon o pojemności 50 ml z prędkością 2 000 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C.
Odsącz nadsącz. Na podstawie całkowitej liczby komórek resuspenduj osad w PBS do stężenia 1 x 10⁸ komórek na ml

5. Infuzja do myszy biorców

Ogrzej myszy biorcze na podgrzewanej podkładce oraz pod lampą grzewczą. Umieść myszy biorcze w ogranicznikach. Wstrzyknij dożylnie 1 x 10⁷ komórek na mysz w 100-200 μl.
Iniekcję szpiku kostnego od dawcy należy przeprowadzić w czasie od 4 do 24 h po napromienianiu.
Utrzymuj do 4 wstrzykniętych myszy w jednej klatce. Przez pierwsze 4 tygodnie utrzymuj wstrzyknięte myszy biorcze w autoklawowanych klatkach z wodą traktowaną antybiotykami w wolnej od patogenów hodowli zwierząt, aby myszy mogły odzyskać odporność. Wymieniaj klatki, wodę z antybiotykiem oraz pokarm co 4 dni w celu zachowania higieny.

6. Indukcja zapalenia jelita grubego i ocena zapalenia jelita grubego

4 tygodnie po napromienianiu i transplantacji szpiku kostnego przejść na zwykłą wodę bez antybiotyków i utrzymywać myszy przez kolejne 2 tygodnie, aby odzyskały normalną mikroflorę jelitową.
6 tygodni po wstrzyknięciu szpiku kostnego zmierzyć początkową masę ciała. Niektóre myszy otrzymują 5% siarczan dekstranu w wodzie pitnej ad libitum w celu wywołania colitis. Pozostałe myszy otrzymują tylko zwykłą wodę pitną jako normalne grupy kontrolne.
5 dni później pobrać krew obwodową, przelać do probówek powlekanych heparyną (Vacutainer) i przechowywać w lodzie. Połączyć krew od 4 myszy w jednej probówce. Połączyć 300 μl krwi z 300 μl buforu do barwienia komórek = 600 μl. Podzielić krew do 5 probówek Eppendorf, po 100 μl do każdej.
Uśmiercić myszy dwutlenkiem węgla lub izofluranem. Ocenić stopień uszkodzeń makroskopowych (szczegóły znajdują się w innej publikacji wideo JOVE ¹). Zmierzyć zmianę masy ciała. Zmierzyć długość i grubość jelit za pomocą suwmiarki cyfrowej. Zaobserwować konsystencję stolca (twardy, miękki lub zakrwawiony). Określić obecność krwi utajonej w stolcu za pomocą testu Hemooccult. Wyciąć tkanki okrężnicy i utrwalić w formalinie do barwienia H&E.
Wyciąć 1 kość udową z każdej myszy, wyekstrahować szpik kostny i wypłukać szpik zimnym PBS za pomocą igły 25G i strzykawki 1 ml. Połączyć 4 czopy szpiku w jednej probówce i przechowywać w lodzie.
Przełożyć szpik kostny do szalki Petriego, rozdrobić czopy szpiku igłą 18G i strzykawką 5 ml kilkakrotnie, aż do całkowitego rozbicia czopów.
Wirować z prędkością 1 500 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i resuspender w 600 μl buforu do barwienia komórek. Podzielić resuspenderowany szpik kostny do 5 probówek Eppendorf, po 100 μl do każdej.

7. Kontrola jakości przeszczepu szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej

Oznacz każdą probówkę z próbką krwi lub szpiku kostnego numerami od #1 do 5:
Przygotuj mieszaninę przeciwciał dla każdej z odpowiednich probówek w ciemności.

#1 Bez przeciwciał
#2 30 μl kontroli izotypowej FITC + 30 μl kontroli izotypowej PE + 15 μl blokady CD16/32
#3 30 μl przeciwciała FITC CD45.1 + 15 μl blokady CD16/32
#4 30 μl przeciwciała PE CD45.2 + 15 μl blokady CD16/32
#5 30 μl przeciwciała FITC CD45.1 + 30 μl przeciwciała PE CD45.2 + 15 μl blokady CD16/32

Do próbki krwi lub szpiku kostnego nr 1 nie dodawać niczego

Do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego nr 2 należy dodać 5 μl mieszaniny przeciwciał nr 2.

Do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego nr 3 dodać 3 μl mieszaniny przeciwciał nr 3

Do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego nr 4 dodać 3 μl mieszaniny przeciwciał nr 4.

Do każdej próbki krwi lub szpiku kostnego nr 5 dodać 5 μl mieszaniny przeciwciał nr 5.

Przechowywać w ciemności na lodzie przez 30 min.
Do każdej probówki dodać 2 ml 1X buforu do lizy RBC. Przechowywać w ciemności na lodzie przez 15 min.
Wirować komórki przy 1 500 obr./min przez 5 min w temperaturze 4 °C (rotor GH 3.8, 1 500 obr./min = 350 x g). Usunąć supernatant. Resuspender osad w 500 μl buforu do barwienia komórek w ciemności, a następnie krótko wymieszać na wortexie.
Za pomocą cytometrii przepływowej sprawdzić obecność CD45.1 (reprezentującego WT) oraz CD45.2 (reprezentującego KO) w immunobarwionych próbkach krwi i szpiku kostnego. Wybrać FITC dla reprezentacji WT CD45.1 oraz PE dla reprezentacji KO CD45.2.
Przeanalizować wyniki cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania FlowJo. Obliczyć stosunek FITC:PE lub PE:FITC, aby określić, czy genotyp dawcy jest genotypem dominującym we krwi i szpiku kostnym.