Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowatorskie podejście chirurgiczne do wewnątrztrachealnego podawania substancji bioaktywnych w płodowym modelu mysim

16.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4219

⸱

31 października 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Virology and Gene Therapy, KU Leuven, 2Department of Woman and Child, KU Leuven, 3Neurobiology and Gene Therapy, KU Leuven, 4Division of Nuclear Medicine, KU Leuven, 5Biomedical NMR Unit/ MoSAIC, KU Leuven

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy nową metodę chirurgiczną podawania czynników bioaktywnych drogą wewnątrz tchawiczną do płodu myszy. Ta droga podania jest bardziej efektywna w celowaniu w płuca płodu myszy niż powszechnie stosowane wstrzyknięcia do jamniówki. Procedura ta nie była dotychczas opisana w modelu mysim.

Streszczenie

Przedszczepowe podanie do płuc komórek, genów lub środków farmakologicznych mogłoby stanowić podstawę nowych strategii terapeutycznych w leczeniu wielu chorób genetycznych i nabytych. Poza wadami wrodzonymi lub dziedzicznymi, wymagającymi długotrwałej ekspresji dostarczonego genu, potencjalnymi przyszłymi wskazaniami do tego rodzaju podejścia są również kilka niedziedzicznych stanów okołoporodowych, w których do osiągnięcia efektów terapeutycznych wystarczająca jest krótkotrwała ekspresja genu lub interwencja farmakologiczna. Chorobami kwalifikującymi się do zastosowania krótkotrwałej terapii przedszczepowej mogą być przejściowy noworodkowy niedobór białka surfaktantu B powodujący zespół niewydolności oddechowej noworodka1,2 lub uszkodzenia hiperoksygenacyjne płuc noworodka3. Chorobami kwalifikującymi się do trwałej korekty terapeutycznej są mukowiscydoza (CF)4, genetyczne warianty niedoborów surfaktantu5 oraz niedobór α1-antytrypsyny6.

Zasadniczo istotną zaletą prenatalnej terapii genowej jest możliwość wczesnego rozpoczęcia interwencji terapeutycznej w rozwoju, w momencie lub nawet przed wystąpieniem objawów klinicznych u pacjenta, co pozwala zapobiec nieodwracalnym uszkodzeniom organizmu. Ponadto organy płodowe charakteryzują się zwiększonym tempem proliferacji komórek w porównaniu z organami osób dorosłych, co może umożliwić bardziej efektywny transfer genów lub komórek macierzystych do płodu. Co więcej, dostarczanie genów in utero odbywa się w czasie, gdy układ odpornościowy osobnika nie jest jeszcze w pełni dojrzały. W związku z tym transplantacja komórek heterologicznych lub suplementacja brakującego lub niefunkcjonalnego białka jego poprawną wersją nie powinna powodować uczulenia immunologicznego na komórkę, wektor lub produkt transgenu, co zostało niedawno potwierdzone zarówno w przypadku terapii komórkowych, jak i genetycznych7.

W niniejszym badaniu zbadaliśmy możliwość bezpośredniego celowania w tchawicę płodu w modelu mysim. Procedura ta jest stosowana w modelach większych zwierząt, takich jak króliki i owce8, a nawet w warunkach klinicznych9, lecz do tej pory nie była przeprowadzana w modelu mysim. Przy badaniu potencjału płodowej terapii genowej w chorobach genetycznych, takich jak CF, model mysi jest bardzo użyteczny jako pierwszy dowód koncepcji ze względu na szeroką dostępność różnych transgenicznych szczepów myszy, dobrze udokumentowany proces embriogenezy i rozwoju płodu, mniej rygorystyczne regulacje etyczne, krótki okres gestation oraz liczne mioty.

Opisano różne drogi dostępu w celu celowania w płuca płodu gryzonia, w tym wstrzyknięcia do jamniowej10-12, wstrzyknięcia dopłucne (pod kontrolą USG)13,14 oraz podanie dożylne do naczyń pęcherzyka żółtkowego15,16 lub żyły pępkowej17. Nasza nowa procedura chirurgiczna umożliwia badaczom wstrzykiwanie wybranego środka bezpośrednio do tchawicy płodu myszy, co pozwala na wydajniejsze dostarczenie substancji do dróg oddechowych niż w przypadku istniejących technik18.

Protokół

1. Kojarzenie myszy w celu uzyskania pożądanego stopnia zaawansowania ciąży

Dobierz w czasie pary ciężarnych myszy szczepu NMRI tak, aby w dniu operacji były w 18. dniu ciąży (E18) (całkowity okres gestacji wynosi E19,5). Przed i po zabiegu myszy są utrzymywane w klatkach z filtrami w normalnej temperaturze pokojowej i przy naturalnym cyklu dobowym, z wolnym dostępem do wody i karmy.

2. Płodowe wstrzyknięcie dotchawicze (I.T.) (Rysunek 1)

  1. Najpierw poddaj ciężarną mysz NMRI znieczuleniu ogólnemu przy użyciu 1,5% isofluranu w mieszaninie z O2 przy przepływie 1,5 L/min. Stężenie isofluranu zależy od wieku i szczepu myszy, jednak ogólnie powinno być ono na poziomie zapewniającym stan znieczulenia zwierzęcia. Następnie umieść ciężarną mysz na podkładce grzewczej (37 °C), aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji.
  2. Cały zabieg chirurgiczny jest przeprowadzany przez dwóch chirurgów. Pierwszy chirurg wykonuje sekcję ciężarnej myszy i następujące po niej odsłonięcie płodu w celu wykonania wstrzyknięcia do tchawicy. Drugi chirurg wykonuje samo wstrzyknięcie do tchawicy płodu. Procedura chirurgiczna jest przeprowadzana z użyciem sterylnych narzędzi i technik aseptycznych.
  3. Zdezynfekuj brzuch jodkiem powidonu i wykonaj laparotomię pośrodkową, aby odsłonić ciężarną macicę. Wyciągaj po jednym rogu macicy i policz liczbę pęcherzy ciążowych. Operację przeprowadza się na jednym płodzie na róg, wybierając go na podstawie optymalnej pozycji pozwalającej na wyciągnięcie głowy płodu w kolejnych krokach. Najbardziej odpowiedni płód wybiera się poprzez wizualizację przez ścianę macicy. Nos głowy płodu powinien być skierowany w stronę chirurga, który wykona wstrzyknięcie do tchawicy po odsłonięciu głowy płodu i jej odgięciu do tyłu (zgodnie z wyjaśnieniem w kolejnym kroku 2.5).
  4. Najpierw przeprowadź przez ścianę macicy i błony płodowe (błonę owodniową i parietalny worek żółtkowy) szew sakulacyjny z polipropylenu (Prolene) 6-0 o średnicy około 1 cm w miejscu, w którym później zostanie odsłonięta głowa płodu. Szew ten utrzymuje płoda w stałej pozycji wewnątrz macicy od poziomu barków w dół. Następnie, używając ostrych nożyczek, wykonaj w macicy nacięcie o długości około 0,8 cm wewnątrz szwu sakulacyjnego.
  5. Ostrożnie wysuń głowę i szyję płodu przez nacięcie w macicy. Delikatnie zaciśnij szew sakulacyjny wokół szyi i utrwal go w tej pozycji za pomocą dwóch kleszczyków typu Micro-Mosquito. Głowa płodu jest utrzymywana w maksymalnym wyproście za pomocą szwu z poliglaktyny 910 (Vicryl) 5-0 nałożonego na dwa kleszczyki umieszczone w jamie ustnej wokół górnej szczęki.
  6. Pod stereoskopowym mikroskopem powiększającym (powiększenie x10) wizualizuje się tchawicę płodu, wykonując pionowe nacięcie szyi przy użyciu sekcji ostrej i tępej. Nacięcie w okolicy szyi ma około 5 mm długości. Jest to nacięcie powierzchowne, ponieważ leżące pod nim tkanki są dalej rozdzielane metodą tępą, aby dotrzeć do tchawicy.
  7. Pod bezpośrednim nadzorem przez stereoskopowy mikroskop powiększający wstrzyknij całkowitą objętość 30 μl substancji (np. kulek fluorescencyjnych lub wektora wirusowego) do tchawicy, używając szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl z ostrą igłą 30 G. Po usunięciu igły minimalny wyciek wstrzykniętego płynu potwierdza prawidłowe wykonanie iniekcji. Po wstrzyknięciu nacięcie nie jest zamykane.
  8. Aby umieścić głowę z powrotem w macicy, wywrzyj delikatny nacisk na nos. Najpierw do macicy wraca szyja, a następnie głowa. Nos wchodzi na samym końcu. Następnie zamknij nacięcie w macicy poprzez zaciśnięcie szwu sakulacyjnego. Potem wstrzyknij łącznie około 0,5 ml roztworu fizjologicznego do jamy owodniowej, aby zapobiec oligowodniu. W tym celu wprowadź igłę do nacięcia wewnątrz szwu sakulacyjnego. Następnie zaciśnij szew wokół igły, po czym wstrzyknij sól fizjologiczną. W ostatnim kroku wycofaj igłę, a następnie całkowicie zaciśnij szew sakulacyjny.
  9. Zamknij brzuszną ścianę matki (t해주세요tneum oraz wewnętrzną i zewnętrzną warstwę mięśniową) oraz skórę szwem ciągłym Vicryl 5-0 w dwóch oddzielnych warstwach. Następnie infiltruj nacięcie 0,2% ksylokainą w celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego. Do łagodzenia bólu pooperacyjnego zaleca się stosowanie buprenorfiny (0,05 - 0,1 mg/kg SC lub IP). Nie stosuje się leków tokolitycznych ani antybiotyków profilaktycznie. Myszy są utrzymywane na podkładce grzewczej (37 °C) do czasu pełnego wybudzenia (około 1 h).

3. Wewnątrzowoczniakowe (I.A.) wstrzykiwanie do płodu

  1. Patrz 2.1
  2. Zdezynfekuj brzuch za pomocą powidonu jodowego i wykonaj laparotomię pośrodkową, aby odsłonić macicę z ciążą. Wyciągnij na zewnątrz kolejno każdy róg macicy i policz liczbę pęcherzy płodowych.
  3. Iniekcję dojamową (I.A.) można wykonać u wszystkich płodów, ponieważ zajmuje ona mniej czasu. Ponadto pozycja płodu nie jest tak krytyczna jak w przypadku iniekcji dotchawiczej. Ponieważ ściana macicy jest półprzezroczysta, struktury płodu, takie jak głowa, kończyny i ogon, a także położenie łożyska są dobrze widoczne.
  4. Używając tej samej igły i strzykawki co powyżej (2.7), wstrzyknij 30 μl substancji w okolicy pyska płodu. Można to zrobić najłatwiej albo między głową a przednimi kończynami płodu, albo między tylnymi kończynami a ogonem. Iniekcję wykonuje się dopiero po dokładnym sprawdzeniu położenia igły, aby upewnić się, że w momencie wstrzykiwania żadne struktury płodu nie stykają się z jej końcówką.
  5. Macicę umieszcza się z powrotem w jamie brzusznej, a ścianę brzucha i skórę zaszywa zgodnie z opisem powyżej (2.9).

4. Ocena wstrzykniętych płodów i immunosubstytucja

  1. Uśmierć samicę za pomocą zatwierdzonej metody eutanazji 36 h po interwencji płodowej (w dniu E19.5). Najlepszą metodą będzie zwichnięcie kręgów szyjnych bez dodatkowej anestezji, ponieważ wszystkie inne formy eutanazji obejmujące znieczulenie (np. izofluran, pentobarbital) znieczulą lub nawet zabiją płody, czego należy za wszelką cenę unikać. Wyjmij operowane płody poprzez cięcie cesarskie. Operowane płody są identyfikowane w macicy na podstawie ich pozycji. Pęcherzyki owodni są numerowane, zaczynając od końca jajnikowego macicy dwurożnej.
  2. Po wyjęciu, do oceny żywotności płodów stosuje się następujące kryteria: obecność (1) bicia serca, (2) różowego koloru skóry (w przeciwieństwie do sinicy) oraz (3) ruchów spontanicznych. Do lęgu matki zastępczej, zawierającego jednodniowe młode, umieść tylko te szczenięta, które spełniają powyższe kryteria. Z doświadczenia wiemy, że szczenięta ze słabym biciem serca, sinicą skóry i/lub minimalnymi ruchami spontanicznymi często nie przeżywają z powodu odrzucenia przez lęg matki zastępczej lub kanibalizmu matczynego.
  3. Po podaniu widocznego barwnika poprzez wstrzyknięcie drogą I.T. lub I.A. (np. czerwonych cząsteczek fluorescencyjnych), poprawność wstrzyknięcia można potwierdzić obecnością tego barwnika (różowy kolor wstrzykniętych czerwonych fluosfer) w jamie klatki piersiowej (poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do płuc po iniekcji I.T. lub poprzez inhalację do płuc po iniekcji I.A.) lub w jamie brzusznej (poprzez połknięcie). Jest to możliwe dzięki temu, że noworodki myszy są półprzezroczyste, co pozwala na ocenę płuc i żołądka in vivo.
  4. Oznacz poprawnie wstrzyknięte szczenięta tuszem chińskim podskórnie nad nasadą ogona. Umieść wszystkie szczenięta spełniające wymagania wspomniane w punkcie 4.2 w lęgu matki zastępczej.
  5. Aby zapewnić maksymalną akceptację i przeżywalność operowanych szczeniąt, pozostaw w lęgu matki zastępczej łącznie nie więcej niż 10 szczeniąt (zarówno jej własne jednodniowe młode, jak i szczenięta przeniesione). Przed umieszczeniem operowanych szczeniąt w lęgu matki zastępczej, pokryj je materiałem z ściółki matki zastępczej, zawierającym jej kał i mocz, aby zamaskować nieznane zapachy.
  6. Umieść klatkę w cichym otoczeniu i nie niepokój lęgu przez co najmniej 12 h (przez noc).
  7. Następnego dnia dokładnie oceń wskaźnik przeżywalności po przeniesieniu, licząc wszystkie szczenięta i odróżniając młode matki zastępczej od szczeniąt operowanych (oznaczonych tuszem chińskim i średnio mniejszych od pozostałych). Zminimalizuj czas manipulacji tymi szczeniętami, aby uniknąć odrzucenia przez matkę oraz zapobiec hipotermii. Generalnie, jeśli w żołądkach szczeniąt nie ma mleka (co jest widoczne ze względu na półprzezroczystość noworodków myszy), rokowania co do dalszego przeżycia tych zwierząt są bardzo złe.

5. Reprezentatywne wyniki

Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2.

Wyznaczenie optymalnej objętości do iniekcji wewnątrzkrtaniowej

Aby określić optymalną objętość do iniekcji do Cisterny (I.T.), empirycznie wybrano różne objętości w zakresie od 10, 20 do 30 μl (n=3/objętość). Dla ułatwienia detekcji zdecydowano się na wstrzyknięcie czerwonych cząsteczek fluorescencyjnych (fluospheres, Molecular Probes, Leiden, Holandia) o rozmiarze 100 nm. Po iniekcji I.T. u płodów w 18. dniu embrionalnym (E18), płuca pobrano po 24 h, utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C i wykonano mrożone skrawki o grubości 6 μm. Jądra komórkowe oraz filamenty aktynowe barwiono odpowiednio Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia) oraz faloidyną Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Merelbeke, Belgia) przez 20 min w temperaturze pokojowej. Obrazy konfokalne wykonano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Biorad Radiance 2100 z oprogramowaniem LaserSharp2000.6 firmy Carl Zeiss. Względną fluorescencję (stosunek fluorescencji czerwonej do niebieskiej, reprezentujących odpowiednio fluospheres i barwienie jąder) zmierzono za pomocą oprogramowania online ImageJ (Rycina 3). Chociaż w czasie operacji płodu cofanie się płynu (backflow) zaobserwowano jedynie po wstrzyknięciu 30 μl, co wskazywało na nadmiar wstrzykniętych płynów, objętość 30 μl dała najwyższy poziom sygnału fluorescencyjnego w miąższu płuca, co określono poprzez pomiar względnej fluorescencji (analiza wariancji, porównania każdej pary za pomocą testu t Studenta, *p < 0.05, ***p < 0.001).

Ilościowa ocena fluosfer w tkance płucnej oraz biodystrybucja do przewodu pokarmowego

Następnie chcieliśmy porównać efektywność celowania w płuca myszy płodowej po wstrzyknięciu drogą dotrachealną (I.T.) w porównaniu z drogą dożylną (I.A.). W tym celu 30 μl fluosfery podano do płuc myszy płodowej po wstrzyknięciu I.T. lub I.A. u ciężarnych myszy NMRI w 18. dniu ciąży (E18) (n=5 na grupę). Wstrzyknięcie I.T. doprowadziło do istotnie wyższego dostarczenia fluosfer do płuc płodu w porównaniu z drogą I.A. (odpowiednio 1,43 ±0,56 i 0,05 ± 0,02 fluorescencji względnej (stosunek fluosfer do Hoechst), analiza wariancji, test t-Studenta, *** p<0,001) (Ryciny 4 a-c). Nieleczone płody kontrolne wykorzystano do normalizacji fluorescencyjnego sygnału tła. Przewód pokarmowy był dodatni u zwierząt po wstrzyknięciu I.T. oraz I.A. (Rycina 4 d). Nie zaobserwowano czerwonej fluorescencji w innych tkankach płodów traktowanych ani u zwierząt w grupie kontrolnej ujemnej (dane nie zostały przedstawione).

Porównanie iniekcji wewnątrztchawiczej i wewnątrzowocznianej po dostarczeniu genów za pomocą rAAV2/6.2 do płodu w obszarze płuc

Po porównaniu obu metod dostarczania poprzez wstrzyknięcie cząsteczek fluorescencyjnych, chcieliśmy ocenić wydajność transdukcji wirusowej i następującą po niej ekspresję genów po wstrzyknięciu I.T. i I.A. z wykorzystaniem wektorów rAAV. rAAV2/6.2 kodujący lucyferazę świetlika (fLuc) (3x1010 GC/płod) pod kontrolą promotora chicken-β-actin (CBA) wstrzykiwano I.T. (n=8) lub I.A. (n=6) płodom myszy NMRI w dniu E18. Po cięciu cesarskim i przekazaniu pod opiekę kocicy, przeżyłe młode poddawano badaniom kontrolnym za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) i monitorowano aktywność fLuc (fotony/sekunda, p/s) w 1. tygodniu życia (Rycina 5). Całkowity strumień fotonów dla grupy I.T. był znacząco wyższy niż w grupie I.A. oraz w grupie kontrolnej negatywnej (analiza wariancji, porównania dla każdej pary z użyciem testu t Studenta, *p<0.05). Średni sygnał BLI w grupie I.A. nie był znacząco wyższy niż w grupie kontrolnej negatywnej.

Różnica między prawidłowym a nieprawidłowym wstrzyknięciem intratrachealnym u płodu

Rozróżnienie między prawidłową a nieprawidłową iniekcją dotchawiczą (I.T.) można ocenić na kilku poziomach. W momencie operacji, podczas wstrzykiwania do tchawicy płodu, nie zostanie zauważony żaden opór, gdy igła zostanie umieszczona w tchawicy. Jednakże, większy opór zostanie odnotowany podczas wstrzykiwania do przestrzeni przytchawiczej. Po drugie, podczas cięcia cesarskiego, ponieważ płód jest półprzezroczysty, możliwe jest zobaczenie płuc, a w konsekwencji obecność widocznego barwnika (np. tuszu chińskiego, cząsteczek fluorescencyjnych). Ostatnią opcją oceny prawidłowości iniekcji jest obrazowanie optyczne, a dokładniej obrazowanie bioluminescencyjne. BLI jest eleganckim systemem do nieinwazyjnego monitorowania ekspresji genu reporterowego lucyferazy świetlika, jednak rozdzielczość przestrzenna i informacje anatomiczne są ograniczone. Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) zapewnia wysoką rozdzielczość oraz obrazy tomograficzne zawierające szczegółowe informacje anatomiczne. Dlatego zbadaliśmy kombinację BLI z MRI w celu uzyskania obrazu nakładkowego, który łączy powierzchniowy sygnał BLI z wizualizacją głębszych struktur anatomicznych (narządów wewnętrznych). Naszym celem było uzyskanie bardziej szczegółowych informacji in vivo na temat lokalizacji ekspresji genów, aby móc odróżnić prawidłową iniekcję I.T. od błędnej.

Połączone obrazy BL-MR pozyskano od kilku zwierząt, którym w wieku jednego tygodnia wykonano wtrysk do cisterny (Figure 6) rAAV2/6.2 CBA-fLuc oraz CBA-LacZnls (3x1010 GC/fetus dla każdego wektora, n=10). Obrazowanie BL wykazało sygnał pochodzący z okolic szyi i klatki piersiowej. Korejestracja MRI z BLI pozwoliła zlokalizować ekspresję genu lucyferazy w obszarze płuc po prawidłowym wtrysku (Figure 6 a), natomiast w obszarze szyi i jamy brzusznej po nieprawidłowym wtrysku (Figure 6 b). Analiza histologiczna z użyciem barwienia X-gal potwierdziła korejestrację in vivo.

Przeżywalność po wstrzyknięciu dotchawiczym i do jammingu płynu owodniowego

  1. Fluorosfery
    Przeżywalność do porodu płodów NMRI w 18. dniu rozwoju (E18), którym wstrzyknięto d.t. lub d.a. 30 μl 100 nm czerwonych cząsteczek fluorescencyjnych, wyniosła 100% w obu grupach; zdefiniowano ją jako liczbę wstrzykniętych płodów żyjących w momencie pobrania, 24 h po zabiegu chirurgicznym na płodach (Tabela 1).
  2. Wektor rAAV
    Przeżywalność do porodu płodów, którym wstrzyknięto d.t. lub d.a. rAAV2/6.2, zdefiniowana jako liczba płodów żyjących w momencie cesarskiego cięcia 36 h po wstrzyknięciu płodowemu, wyniosła odpowiednio 85,3% i 86,3% (Tabela 1). Wskaźnik przeżywalności wczesnonoworodkowej wyniósł odpowiednio 53,3% (d.t.) i 74,5% (d.a.) i został obliczony poprzez zestawienie liczby młodych żyjących 1 dzień po przekazaniu do adopcji z początkową liczbą wstrzykniętych płodów. Aby uzyskać te końcowe wskaźniki przeżywalności, zoptymalizowaliśmy protokół procedury okołooperacyjnej, stosując (1) izofluran wziewny jako znieczulenie zamiast podawania mieszaniny ketaminy (75 mg/kg d.b.) i medetomidyny (1 mg/kg d.b.), (2) matę grzewczą w celu zapobiegania hipotermii podczas operacji, (3) stereoskopowy mikroskop zoom oraz (4) zwiększenie doświadczenia operatorów w przeprowadzaniu procedury chirurgicznej.

Technika chirurgiczna anastomozy jelitowej, procedura medyczna, wizualny przewodnik krok po kroku.
Rycina 1. Iniekcja wewnątrztrachealna u płodów myszy w dniu E18. Na tej rycinie przedstawiono główne etapy procedury chirurgicznej iniekcji wewnątrztrachealnej (I.T.) u płodów. W pierwszym kroku jeden róg macicy zostaje wyewagowany. W kolejnym kroku szew purse-string przechodzi przez ścianę macicy i błony płodowe (błonę owodniową i kątową woreczka żółtkowego) nad obszarem, przez który później zostanie odsłonięta głowa płodu. Następnie głowa i szyja płodu zostają wyewagowane poprzez hysterotomię, po czym głowa płodu jest utrzymywana w maksymalnym wyproście za pomocą szwu z polyglactin 910 5-0 na dwóch kleszczykach między szczękami. Pod stereomikroskopem (powiększenie x10) tchawica płodu zostaje uwidoczniona poprzez wykonanie pionowego nacięcia szyi przy użyciu ostrej i tępej dyssekcji. W ostatnim kroku całkowita objętość 30 μl substancji jest wstrzykiwana do tchawicy pod bezpośrednią kontrolą wizualną przez stereomikroskop.

Schemat oceny płodowej i ponatalnej; obejmuje wstrzyknięcie płodowe, cięcie cesarskie, przeżywalność.
Rycina 2. Ogólny przegląd eksperymentu.

Mikroskopia fluorescencyjna, obrazy histologiczne, wykres słupkowy, wpływ objętości wewnątrztchawiczej, poziomy fluorescencji.
Rycina 3. Wyznaczenie optymalnej objętości do wstrzykiwania wewnątrztchawiczego. W celu wyznaczenia optymalnej objętości do wstrzyknięcia drogą I.T., płodom w 18. dniu embrionalnym (E18) podano 10, 20 lub 30 μl (n=3/objętość) czerwonych fluosfer o rozmiarze 100 nm, a płuca pobrano 24 h później. Jądra komórkowe i filamenty aktynowe barwiono odpowiednio Hoechst 33258 oraz faloidyną Alexa Fluor 488. Względną fluorescencję (stosunek fluorescencji czerwonej do niebieskiej, reprezentujących odpowiednio fluosfery i barwienie jąder) oznaczono przy użyciu oprogramowania ImageJ online. Średnia ± SD, analiza wariancji, porównania dla każdej pary za pomocą testu t Studenta, *p<0.05, ***p<0.001.

Mikroskopia fluorescencyjna wstrzyknięć wewnątrztchawiczych i wewnątrzowodniowych; wykres względnej fluorescencji.
Rycina 4. Ilościowa ocena fluosfer w tkance płucnej i biodystrybucja do przewodu pokarmowego. 30 μl czerwonych fluosfer dostarczono do płuc myszy płodowej po wstrzyknięciu (a) I.T. lub (b) I.A. u ciężarnych myszy NMRI w dniu E18 w celu porównania wydajności celowania w płuca myszy płodowej. Nieleczone płody kontrolne wykorzystano do normalizacji sygnału tła fluorescencji. Jądra komórkowe i filamenty aktynowe barwiono odpowiednio Hoechst 33258 oraz faloidyną Alexa Fluor 488. (c) Względną fluorescencję (stosunek fluorescencji czerwonej do niebieskiej, reprezentujących odpowiednio fluosfery i barwienie jąder) określono ilościowo przy użyciu oprogramowania ImageJ online. (d) Przewód pokarmowy był dodatni u zwierząt po wstrzyknięciach I.T. i I.A. Średnia ± SD, analiza wariancji, test t Studenta, ***p<0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Obrazowanie bioluminescencyjne myszy; wykres porównujący strumień fotonów w zależności od metody iniekcji.
Rycina 5. Porównanie iniekcji wewnątrztachealnej i wewnątrzowodniowej po dostarczeniu genu za pośrednictwem rAAV2/6.2 do płuc płodu. Sygnał BLI w 1. tygodniu po iniekcji rAAV2/6.2 (3 × 1010 GC/płód CBA-fLuc) wraz z odpowiadającą kwantyfikacją całkowitego strumienia fotonów. Wszystkie zwierzęta zostały przeskanowane, będąc oddzielonymi czarnymi przegrodami, aby uniknąć rozpraszania fotonów na sąsiednie osobniki. Skala pseudokolorów przedstawia strumień fotonów na sekundę, na centymetr kwadratowy na steradian (p/s/cm2/sr). Pomiary uzyskano w prostokątnym obszarze zainteresowania o powierzchni 4,3 cm2. Średnia ± SD, analiza wariancji, porównania dla każdej pary za pomocą testu t Studenta, *p<0.05. Rycina zaadaptowana z Carlon et al., 2010. Przedrukowano za zgodą Macmillan Publishers Ltd: [Molecular Therapy] (doi:10.1038/mt.2010.153), copyright (2010). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Ocena wstrzykiwania dotchawiczego z użyciem BLI i MRI; metody prawidłowa i błędna; analiza przekrwienia płuc.
Rysunek 6. Rozróżnienie między prawidłowym a błędnym wstrzyknięciem dotchawicznym u płodu po dostarczeniu genów za pomocą rAAV2/6.2 do płuc płodu. Połączone obrazy BL-MR uzyskano od kilku zwierząt, którym w pierwszym tygodniu życia wstrzyknięto dotchawicznie rAAV2/6.2 CBA-fLuc oraz CBA-LacZnls (3x1010 GC/płód dla każdego wektora). Obrazowanie BL ujawniło sygnał pochodzący z obszaru szyi i klatki piersiowej. Korejestracja MRI z BLI zlokalizowała ekspresję genu lucyferazy w obszarze płuc po prawidłowym wstrzyknięciu (a), natomiast w obszarze szyi i jamy brzusznej po błędnym wstrzyknięciu (b). Analiza histologiczna potwierdziła korejestrację in vivo. Pasek skali = 100 μm. Rysunek zaadaptowano z Carlon et al., 2010. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Substancja wstrzykiwanaMetoda wstrzykiwaniaPrzeżywalność do porodu aWskaźnik przeżywalności podczas adopcji bWczesny wskaźnik przeżywalności noworodków c
fluospheresI.T.100 (8/8)n.d.n.d.
 I.A.100 (5/5)n.d.n.d.
rAAV2/6.2I.T.85,3 (64/75)62,553,3 (40/75)
 I.A.86,3 (44/51)86,474,5 (38/51)

Tabela 1. Przeżywalność po płodowym wstrzyknięciu dotchawiczym ORAZ do jamniowej. a Przeżywalność do momentu urodzenia, t.j. po operacji płodu i podczas cięcia cesarskiego, przed przekazaniem do opieki kocicy. b Szczenięta zostały przekazane do opieki kocicy tylko wtedy, gdy były różowe, poruszały się i oddychały prawidłowo. c Wczesna przeżywalność noworodkowa jest wyrażona jako funkcja początkowej liczby wstrzykniętych szczeniąt. Skróty: I.T. wstrzyknięcie dotchawicze; I.A. wstrzyknięcie do jamniowej; n.a. nie dotyczy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe etapy

  • Wybraną przez nas linią myszy do pracy są myszy NMRI, ponieważ dają one liczne mioty (średnia wielkość miotu 14,4 ± 1,8, dane własne), dobrze tolerują interwencje i wykazują dobre cechy macierzyńskie.
  • Przeciągnięcie sznurka zaciskowego przez ścianę macicy i błony płodowe jest krytycznym krokiem, ponieważ celem jest odsłonięcie wyłącznie głowy płodu, a nie barków; w przeciwnym razie repozycjonowanie jest niemal niemożliwe bez spowodowania urazu.
  • Optymalne ustawienie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

M.C. i A.V.d.P. są doktorantami wspieranymi z grantów Instytutu Promocji Innowacji poprzez Naukę i Technologię w Flandrii (IWT-Vlaanderen). J.T. posiada niepełny etat stypendialny w ramach Clinical Research Fellowship (KOOR) z UZ Leuven. D.V. jest doktorantem wspieranym z grantu KU Leuven, DBOF/10/062. M.M.d.C jest doktorantem wspieranym z grantu Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) oraz Erasmus Mundus. Badania zostały sfinansowane przez IWT-Vlaanderen, grant EC DIMI (LSHB-CT-2005-512146) oraz grupę badawczą In vivo Molecular Imaging Research (IMIR) z KU Leuven. Chcielibyśmy podziękować UPenn Vector Core, założonemu przez Jamesa M. Wilsona, za uprzejme przekazanie plazmidu pakującego AAV6.2 do produkcji wektora rAAV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
myszy NMRIJanvier, Le Genest St Isle, Francja
Izofluran Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Wielka Brytania
Prolene 6-0Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgia
Vicryl 5-0Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgia
50 μstrzykawka szklana Hamilton, model 1710.5 TLLX SYRHamilton, Reno, NV, USA5495-20
ostra igła 30GHamilton, Reno, NV, USA7762-03
2% ksylokaina AstraZeneca, Zoetermeer, Holandia

Bibliografia

  1. Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
  2. Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
  3. Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
  4. Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
  5. Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
  6. Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
  7. Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
  8. Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
  9. Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
  10. Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
  11. Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
  12. Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
  13. Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
  14. Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
  15. Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
  16. Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
  17. Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
  18. Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
  19. Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
  20. Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

tchawica myszy p odowejwstrzykni cie wewn trztchawicznegenoterapia p odowaprocedura chirurgicznatechnika hysterotomiikuleczki fluorescencyjnedostarczanie wektora wirusowegoobrazowanie konfokalneobrazowanie bioluminescencyjneobrazowanie metod rezonansu magnetycznego
Nowatorskie podejście chirurgiczne do wewnątrztrachealnego podawania substancji bioaktywnych w płodowym modelu mysim
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.