Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Podsumowanie

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Streszczenie

Złożony proces prowadzenia aksonów jest w dużej mierze sterowany przez stożek wzrostu, który jest dynamiczną, ruchomą strukturą znajdującą się na końcu rosnącego aksonu. Podczas wzrostu aksonu stożek wzrostu musi integrować informacje z wielu źródeł sygnałów prowadzących, aby modulować swój cytoszkielet w celu napędzania stożka naprzód i dokładnego nawigowania w poszukiwaniu konkretnych celów¹. Sposób, w jaki ta integracja zachodzi na poziomie cytoszkieletu, jest wciąż przedmiotem badań, a analiza dynamiki białek cytoszkieletowych i efektorów wewnątrz stożka wzrostu pozwala na wyjaśnienie tych mechanizmów. Stożki wzrostu Xenopus laevis są wystarczająco duże (10-30 mikronów średnicy), aby przeprowadzać obrazowanie na żywo dynamiki cytoszkieletu w wysokiej rozdzielczości (np.^2-4) i są łatwiejsze do izolacji oraz manipulacji w warunkach laboratoryjnych w porównaniu z innymi kręgowcami. Żaba jest klasycznym systemem modelowym dla badań nad neurobiologią rozwojową, a ważne, wczesne spostrzeżenia dotyczące dynamiki mikrotubul w stożku wzrostu zostały początkowo odkryte przy użyciu tego systemu^5-7. W tej metodzie⁸ jaja są zbierane i zapładniane in vitro, wstrzykiwane RNA kodujące fluorescencyjnie znakowane białka fuzyjne cytoszkieletu lub inne konstrukty służące do manipulacji ekspresją genów, a następnie pozostawiane do rozwoju do etapu cewy nerwowej. Cewy nerwowe są izolowane poprzez dyssekcję, a następnie hodowane, po czym obrazowane są stożki wzrostu na wyrastających neurytach. W niniejszym artykule opisujemy, jak przeprowadzić tę metodę, której celem jest hodowla stożków wzrostu Xenopus laevis do późniejszej analizy obrazowej w wysokiej rozdzielczości. Choć przedstawiamy przykład białka fuzyjnego +TIP EB1-GFP, metodę tę można zastosować do dowolnej liczby białek w celu wyjaśnienia ich zachowania wewnątrz stożka wzrostu.

Protokół

Uwaga: Kroki opisane w dwóch pierwszych sekcjach przedstawiamy jedynie w skrócie, ponieważ w innych publikacjach opublikowano doskonałe protokoły z dokładnymi informacjami, które koncentrują się bardziej szczegółowo na tych etapach (np.^8-12). Ponadto ogólny protokół pracy z neuronami rdzenia kręgowego Xenopus w hodowli żywych komórek został wcześniej opublikowany w szczegółowym artykule dotyczącym metod⁸. Gorąco zalecamy zapoznanie się z tym artykułem jako uzupełnienie do niniejszego filmu, choć tutaj dostarczamy wystarczających informacji, aby pomyślnie przeprowadzić i rozwiązać problemy związane z protokołem wycinania rurki neuralnej i wysiewania w kroku 3.

1. In vitro Zapłodnienie Xenopus Jaja

1. Pozyskać jaja od samic żab, którym 12-18 h przed pobraniem jaj wstrzyknięto gonadotropinę kosmotropową (400 units/frog). Jaja zbierać w 1X roztworze Marc's Modified Ringer (MMR) (0.1 M NaCl, 2.0 mM KCl, 1.0 mM MgSO₄, 2.0 mM CaCl₂, 5.0 mM HEPES, pH 7.4⁹).
2. Zapłodnić jaja in vitro za pomocą rozdrobnionych jąder, zgodnie z wcześniejszym opisem⁹.
3. Po co najmniej 20 min usunąć galaretowatą otoczkę embrionów poprzez inkubację w 2% cysteinie w 1X MMR (doprowadzonym do pH 7.8 za pomocą NaOH) przez 3-5 min. Przemyć 0.1X MMR (lub 0.1X MBS (Modified Barth's Saline, przepis 1X: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 2.5 mM NaHCO₃, 5 mM HEPES, pH 7.8)) 3-5 razy i przechowywać embriony w temperaturze pokojowej do momentu iniekcji lub, jeśli jest to pożądane, umieścić embriony w temperaturze 14-18 °C w celu spowolnienia rozwoju.

2. Mikroiniekcja RNA

Uwaga: choć w niniejszym przypadku wykorzystujemy iniekcję RNA, techniki te nie są ograniczone wyłącznie do RNA; do manipulacji genetycznych można również stosować DNA, białka lub zmodyfikowane kwasy nukleinowe, co zostało opisane we wcześniejszych publikacjach¹².

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu cząsteczki RNA służące do znakowania cytoszkieletu lub innych struktur są transkrybowane z linearyzowanych matryc DNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine (Ambion). mRNA wymagają czapeczki 5' oraz ogona poli(A) 3', aby promować translację i zapobiegać degradacji w embrionach. W tym celu powszechnie stosowanym wektorem jest pCS2+, a zestaw do transkrypcji zawiera analog czapeczki stosowany podczas reakcji syntezy. Przetranskrybowane mRNA resuspendujemy w nuclease-free ddH₂0 do stężenia zapasowego od 500 do 2 000 ng/μl, a następnie bezzwłocznie przechowujemy w temperaturze -80 °C. Przed iniekcją RNA należy rozcieńczyć w ddH₂0 do odpowiedniego stężenia iniekcyjnego. Ponieważ do embrionów wstrzykuje się jedynie niewielką objętość, resuspensja w buforze nie jest konieczna. Nasze końcowe stężenie iniekcyjne wynosi zazwyczaj 50-200 pg/nl, w zależności od konstruktu; zazwyczaj wstrzykujemy do 4 nl na embrion, choć wiele laboratoriów tradycyjnie wstrzykuje do 10 nl, co stanowi około 1% całkowitej objętości embrionu. RNA może być toksyczne w wysokich dawkach, a dawka na embrion zazwyczaj mieści się w zakresie od 10 pg do 1 ng, choć w zależności od konkretnego genu i czystości tolerowane może być do 5 ng. Jednakże w celu obrazowania lokalizacji białek należy wstrzyknąć jak najniższą ilość, aby uniknąć artefaktów wynikających z nadekspresji. RNA dla EB1-GFP w tym protokole jest stosowane w końcowej ilości 250 pg na embrion.
2. Igły do iniekcji przygotowuje się poprzez wyciąganie kapilar za pomocą wyciągarki do igieł⁹ do średnicy końcówki ok. 0,2 μm. Korzystając z wyciągarki Sutter P-87, stosujemy następujące ustawienia: heat 644, pull 125, velocity 70, time 250, jednak parametry te różnią się w zależności od urządzenia i muszą zostać ponownie dostosowane po wymianie włókna (obecnie używamy kwadratowego włókna 2,5 mm o szerokości 2,5 mm). Pod mikroskopem końcówkę igły należy odłamać pęsetą pod kątem, aby uzyskać kształt przypominający pióro. Istnieją inne metody łamania i napełniania igieł iniekcyjnych (np.^11,12), jednak my napełniamy igłę RNA, nakładając małą kroplę (0,5 - 1 μl) na tylny koniec igły. Do mikroiniekcji w embrionach dostępnych jest wiele komercyjnych systemów iniekcyjnych, z których dwa najpopularniejsze to Pico-injector (Medical Systems) oraz Nanoject (Drummond Scientific) (więcej informacji w¹¹). Używamy urządzenia Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, które wykorzystuje sprężony gaz przez cyfrowo ustawiony czas w celu podania stałych objętości nanolitrowych. Objętość iniekcji musi być skalibrowana dla każdej nowej mikropipety przy użyciu mikrometru przedmiotowego, a czas iniekcji należy dostosować, aby uzyskać pożądaną ilość wstrzykniętego RNA.
3. Zapłodnione embriony w stadium od 1 do 4 komórek umieszcza się w plastikowej płytce zawierającej 5% Ficoll w 0,1X MMR. Unieruchamiając embrion pęsetą lub umieszczając go na platformie stabilizującej (plastikowa siatka o oczkach ok. 1 mm, przyklejona do dna płytki plasteliną lub woskiem dentystycznym), wstrzykuje się pożądaną objętość do blastomerów zwierzęcych (szczegóły dotyczące objętości iniekcji znajdują się w kroku 2.1). Substancję należy rozdzielić w kilku miejscach w obrębie embrionu, wykonując co najmniej jedną iniekcję do każdego z blastomerów zwierzęcych, aby uzyskać bardziej jednorodne rozprzestrzenienie (na przykład w przypadku embrionu w stadium 4 komórek zazwyczaj wstrzykujemy 1-2 razy do każdego blastomeru, natomiast w stadium 2 komórek wstrzykujemy 2-4 razy do każdego blastomeru). Korzyścią z oczekiwania do stadium 2-4 komórek jest pewność, że embrion rozpoczął prawidłowe podziały. Jednakże, jeśli czas jest kluczowy, można rozpocząć w stadium 1 komórki, co daje niemal identyczny wynik końcowy, z tą różnicą, że konieczne jest wstrzyknięcie większej liczby embrionów. Można również stosować embriony w starszych stadiach, co jest szczególnie przydatne, jeśli celem iniekcji są specyficzne typy komórek, jednak ponieważ zazwyczaj preferujemy szerszą ekspresję, wstrzykujemy w młodsze embriony, aby zmniejszyć liczbę potrzebnych iniekcji.
4. Wstrzyknięte embriony przenosi się do plastikowej płytki zawierającej 0,1X MMR i pozostawia do rozwoju do stadium 20-23¹³. Embriony inkubuje się w temperaturze od 14 do 22 °C, w zależności od pożądanej szybkości rozwoju. (W przypadku preparowania cewek nerwowych następnego dnia należy stosować temp. ok. 22 °C. W przypadku preparowania dzień później – ok. 14 °C).

3. Disekcja i wysiew cewy nerwowej

1. Przed przystąpieniem do sekcji należy przygotować naczynia hodowlane¹⁴. Najpierw pokryć szkiełka podstawowe ilością roztworu 200 μg/ml poli-lizyny w PBS wystarczającą do całkowitego pokrycia powierzchni szkiełka (stosując naczynia hodowlane Mattek lub Lab-Tek) i inkubować przez jedną godzinę (alternatywnie można użyć szkiełek podstawkowych luźno umieszczonych w szalce Petriego, aby później przenieść je na szkiełka przedmiotowe do obrazowania i immunocytochemii). Odessać płyn i wypłukać nadmiarem PBS 3 razy, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Następnie pokryć naczynia roztworem 10 μg/ml lamininy w PBS (zazwyczaj stosujemy 500 μl na szkiełko, co wystarcza do pokrycia powierzchni) i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni. Odessać roztwór lamininy i wypłukać 3 razy nadmiarem PBS, dbając o to, aby powierzchnie pokryte lamininą nie miały kontaktu z powietrzem. Zastąpić PBS pożywką hodowlaną (50% roztwór Ringera, 49% pożywka L-15, 1% surowicy plodowej cielęcej, dodatkowo 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny i gentamycyny, pH 7.4, sterylizowana filtracyjnie). (Pożywka Ringera: 115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM Hepes pH 7.4, 0.5 mM EDTA). Choć w naszym protokole zastosowano tę pożywkę, należy zaznaczyć, że jest to pożywka wzbogacona, powszechnie stosowana w starszych kulturach zwojów siatkówki Xenopus, gdzie neurony mają ograniczone zapasy energii. Młode kultury rdzenia kręgowego przeżyją i będą rosnąć przez ponad 24 hr w czystej pożywce Ringera bez dodatkowych czynników wzrostu, co jest istotną zaletą tego systemu. Opcjonalnie: dodać NT3 i BDNF (do stężeń końcowych 25 ng/μl każdego z nich) do pożywki hodowlanej, aby zwiększyć wyrastanie aksonów.
2. Ze względu na zmienność ekspresji wstrzykniętego mRNA, embriony mogą wykazywać fluorescencję mozaikową. Przed przystąpieniem do sekcji należy przesiewić embriony pod kątem obecności fluorescencji, aby zidentyfikować te, które wykazują ekspresję fluorescencyjnego białka fuzyjnego w rurce neuralnej. Fluorescencyjne embriony w stadium 20-23 umieścić w plastikowym naczyniu pokrytym agarozą, wypełnionym pożywką Steinberga (58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 0.44 mM Ca(NO₃)₂, 1.3 mM MgSO₄, 4.6 mM Tris, pH ustawione na 7.8, a następnie autoklawowane)⁵. Aby przygotować naczynie pokryte agarozą, należy pokryć dno plastikowego naczynia stopioną 1% agarozą w 0.1X MMR i pozostawić do zastygnięcia. Zapewnia to miękką powierzchnię, dzięki czemu nie dochodzi do uszkodzeń drobnych pęset i igieł wolframowych używanych podczas kolejnych etapów sekcji. Sekcja embrionów powyżej stadium 23 jest możliwa, ale trudniejsza, ponieważ tkanki przylegają do siebie silniej i wymagają tym samym dłuższego traktowania kolagenazą.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym usunąć błonę witelinową za pomocą drobnej pęsety, a następnie wyizolować całą część grzbietową embrionu, wykonując serię nacięć. Podczas gdy jedna pęseta utrzymuje embrion w miejscu, drugą należy wykonać nacięcie z boku embrionu, aby odsłonić jego wnętrze. Następnie, używając obu pęset, należy ucisnąć tkankę między połową grzbietową a brzuszną embrionu, przecinając go w ten sposób na pół, aby wyizolować część grzbietową zawierającą rurkę neuralną.
4. Eksplant grzbietowy umieścić w probówce Eppendorf z 2 mg/ml kolagenazy w pożywce Steinberga na 15-20 min na rotatorze, aby rozluźnić tkanki, a następnie przenieść eksplant pipetą do plastikowego naczynia pokrytego agarozą ze świeżym roztworem Steinberga. Alternatywnie, eksplant można umieścić w szalce Petriego zawierającej roztwór kolagenazy na 15 min, gdzie następnie można przeprowadzić całą sekcję.
5. Za pomocą pęsety delikatnie oddzielić rurkę neuralną od nabłonka grzbietowego i brzusznej struny grzbietowej. Wsunąć końcówkę pęsety między nabłonek a leżącą pod nim tkankę i powoli odciągnąć nabłonek, odsłaniając znajdującą się pod nim rurkę neuralną. Następnie jedną pęsetą przytrzymać tkankę, a drugą wsunąć końcówkę między rurkę neuralną a strunę grzbietową. Na koniec za pomocą pęsety usunąć somity po obu stronach rurki.
6. Przenieść rurkę neuralną do naczynia pokrytego agarozą wypełnionego pożywką hodowlaną, zgodnie z opisem w kroku 3.1.
7. Po zebraniu kilku rurek neuralnych, pociąć je na liczne fragmenty (około 20, jeśli wyizolowano całą rurkę) za pomocą zaostrzonych igieł wolframowych lub pęsety, a następnie wysiać fragmenty w naczyniach hodowlanych wypełnionych pożywką (przygotowaną w kroku 3.1), rozkładając eksplanty równomiernie w rzędach.
8. Po wysianiu nie przesuwać naczyń, ponieważ mogłoby to zakłócić przywieranie komórek. Inkubować wysiane eksplanty rurki neuralnej w temperaturze około 20-22 °C. Zazwyczaj pozostawiamy naczynie z komórkami na blacie w temperaturze pokojowej przez noc. Jedną z zalet neuronów Xenopus laevis jest to, że nie jest wymagany specjalny inkubator do hodowli komórkowej regulujący poziom CO₂ lub temperaturę. Neuryty i stożki wzrostu można obserwować i obrazować w temperaturze pokojowej 12-24 hr po wysianiu, choć wyrastanie można przyspieszyć poprzez dodanie czynników wzrostu. Generalnie ekspresja produktu RNA lub plazmidu skutkuje zmienną ekspresją między komórkami, w związku z czym poziomy ekspresji fluorescencji między stożkami wzrostu mogą być zróżnicowane. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja białek fluorescencyjnych z RNA utrzymuje się powyżej 48 hr po wysianiu, choć zależy to od konkretnej konstrukcji.

4. Reprezentatywne wyniki

Po zastosowaniu protokołu, którego streszczenie przedstawiono na Rysunku 1A, zdrowe, prawidłowo wypreparowane i hodowlane eksplanty neuronalne będą emitować liczne aksony lub neuryty we wszystkich kierunkach na podłożu z lamininy/poli-lizyny, co pokazano na Rysunku 1B. Stożki wzrostu na końcach aksonów można obrazować za pomocą optyki DIC, jak widać na Rysunku 1C, w celu zobrazowania ogólnej dynamiki ruchliwości, lub za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, aby zbadać lokalizację fluorescencyjnie znakowanych białek cytoszkieletu; na przykład EB1-GFP przedstawiono na Rysunku 1D.

Rysunek 1. Podsumowanie protokołu eksperymentalnego i oczekiwanego wyniku. A) Schemat blokowy protokołu. Szczegóły dotyczące sekcji w dniu 3 znajdują się w filmie. Całą cewkę neuralną należy pociąć na około 20 równych części i rozłożyć równomiernie w rzędach na szkiełku nakrywkowym. Na tym rysunku nożyczki symbolizują cięcie tkanki za pomocą precyzyjnej pęsety. CG gonadotropina kosmórkowa B) Obraz DIC aksonów lub neurytów wyrastających z eksplantu (eksplant w lewym górnym rogu). C) Obraz w większym powiększeniu stożka wzrostu na końcówce rosnącego aksonu. D) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej EB1-GFP w stożku wzrostu. Pasek skali 10 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Dyskusja

Xenopus laevis eksplanty neuronalne emitują neuryty w bardzo intensywny sposób w ciągu 24 hr po wysianiu na podłożu z lamininy/poli-lizyny, jeśli panują odpowiednie warunki. Na tym podłożu stożki wzrostu są bardzo ruchliwe i mogą osiągać długość aksonów do 1 mm, rozrastając się we wszystkich kierunkach na zewnątrz z eksplantu, choć typowe długości wynoszą 100 μm lub więcej. Jeśli neuryty nie wyrosną, przyczyn takiego stanu jest ograniczona liczba. Jedną z możliwości jest to, że eksplanty neuronalne nie przytwier...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gonadotropina kosmórkowa	Argent Labs	C-HCG-ON-10
Cysteina	Sigma-Aldrich	52-90-4
Zestaw mMessage mMachine	Ambion	AM1340
Kapilary borokrzemowe 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID)	FHC, Inc.	30-31-0
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637
Pinceta biologiczna Dumont #5 Inox	Fine Science Tools	11252-20
Kolagenaza	Sigma-Aldrich	9001-12-1
Szalki Mattek	Mat Tek Corporation	P35G-1.5-14-C
L-15	Invitrogen	21083-027
Poly-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P-1399
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
NT3	Sigma-Aldrich	N1905
BDNF	Sigma-Aldrich	B3795