Artykuł metodologiczny

Narzędzie analityczne, które określa ilościowo zmiany morfologii komórek na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/4233

⸱

31 sierpnia 2012

 ,  , 
1Medications Development, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco , 2Clinical Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of California, San Francisco , 3Translational Research Institute and the Institute for Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy platformę oprogramowania, która wykorzystuje Imaris Neuroscience, ImarisXT i MATLAB do pomiaru zmian w morfologii niezdefiniowanego kształtu, pobranego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w kształcie komórki po aktywacji receptora, a zatem stanowi potencjalne dodatkowe narzędzie do odkrywania leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej powszechnymi narzędziami do analizy oprogramowania dostępnymi do pomiaru obrazów fluorescencyjnych są dane dwuwymiarowe (2D), które opierają się na ręcznych ustawieniach włączania i wykluczania punktów danych, oraz wspomagane komputerowo rozpoznawanie wzorców, które wspierają interpretację i wyniki analizy. Coraz ważniejsza staje się możliwość pomiaru obrazów fluorescencyjnych zbudowanych z trójwymiarowych (3D) zestawów danych, aby móc uchwycić złożoność dynamiki komórkowej i zrozumieć podstawy plastyczności komórkowej w systemach biologicznych. Zaawansowane instrumenty mikroskopowe umożliwiły wizualizację obrazów fluorescencyjnych 3D poprzez akwizycję wielospektralnych obrazów fluorescencyjnych i potężnego oprogramowania analitycznego, które rekonstruuje obrazy ze stosów konfokalnych, które następnie zapewniają reprezentację 3D zebranych obrazów 2D. Zaawansowane metody stereologii oparte na projektowaniu rozwinęły się w porównaniu z przybliżeniem i założeniami oryginalnej stereologii opartej na modelu1 nawet w złożonych skrawkach tkanek2. Pomimo tych postępów naukowych w mikroskopii, nadal istnieje zapotrzebowanie na zautomatyzowaną metodę analityczną, która w pełni wykorzystuje wewnętrzne dane 3D, aby umożliwić analizę i kwantyfikację złożonych zmian w morfologii komórek, lokalizacji białek i transporcie receptorów.

Obecne techniki dostępne do ilościowego oznaczania obrazów fluorescencyjnych obejmują Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i Image J (NIH), które zapewniają ręczną analizę. Oprogramowanie Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlandia Północna) udostępnia funkcję MeasurementPro, która umożliwia ręczne tworzenie punktów pomiarowych, które można umieścić na obrazie objętościowym lub narysować na serii plasterków 2D w celu utworzenia obiektu 3D. Ta metoda jest przydatna w przypadku pomiarów punktowych jednym kliknięciem w celu zmierzenia odległości linii między dwoma obiektami lub utworzenia wielokąta otaczającego obszar zainteresowania, ale jest trudna do zastosowania w przypadku złożonych struktur sieci komórkowych. Filament Tracer (Andor) umożliwia automatyczne wykrywanie neuronów 3D przypominających włókna, jednak moduł ten został opracowany do pomiaru zdefiniowanych struktur, takich jak neurony, które składają się z dendrytów, aksonów i kolców (struktura przypominająca drzewo). Moduł ten został genialnie wykorzystany do wykonywania pomiarów morfologicznych komórek nieneuronalnych3, jednak dane wyjściowe dostarczają informacji o rozszerzonej sieci komórkowej za pomocą oprogramowania, które zależy od zdefiniowanego kształtu komórki, a nie jest amorficznym modelem komórkowym. Aby przezwyciężyć problem analizy komórek o kształcie amorficznym i dostosowania oprogramowania do zastosowań biologicznych, firma Imaris opracowała Imaris Cell. Był to projekt naukowy realizowany we współpracy z Eidgenössische Technische Hochschule, który został opracowany w celu obliczenia relacji między komórkami a organellami. Chociaż oprogramowanie umożliwia wykrywanie ograniczeń biologicznych, wymuszając jedno jądro na komórkę i wykorzystując błony komórkowe do segmentacji komórek, nie można go wykorzystać do analizy danych fluorescencyjnych, które nie są ciągłe, ponieważ w idealnym przypadku buduje powierzchnię komórki bez pustych przestrzeni. Zgodnie z naszą wiedzą, obecnie nie opracowano modyfikowalnego przez użytkownika zautomatyzowanego podejścia, które dostarczałoby informacji morfometrycznych z obrazów fluorescencyjnych 3D, które uzyskuje komórkową informację przestrzenną o nieokreślonym kształcie (ryc. 1).

Opracowaliśmy platformę analityczną, korzystając z modułu oprogramowania Imaris core i Imaris XT połączonego z MATLAB (Mat Works, Inc.). Narzędzia te umożliwiają pomiar 3D komórek bez predefiniowanego kształtu i z niespójnymi składnikami sieci fluorescencyjnej. Co więcej, metoda ta pozwoli naukowcom, którzy mają rozszerzoną wiedzę specjalistyczną w zakresie systemów biologicznych, ale nie są zaznajomieni z aplikacjami komputerowymi, na ilościowe określenie zmian morfologicznych w dynamice komórki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Trójwymiarowa analiza morfometryczna zmian fenotypowych w pojedynczych komórkach

  1. Ludzkie embrionalne komórki nerki (HEK293) transfekowano receptorem czynnika uwalniającego kortykotropinę znakowaną hemaglutyniną (HA) 2 (CRF-R2), receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), jak opisano wcześniej4, 5.
  2. Komórki pozostawiono bez leczenia (brak leczenia, NT), stymulowano endogennym ligandem CRF-R2, czynnikiem uwalniającym kortykotropinę, CRF (1 μM, 30 min) lub wstępnie traktowano selektywnym antagonistą CRF-R2, anty-sauvagine 30 (AS-30, 1 μM, 30 min) przed leczeniem agonistycznym .
  3. Komórki zostały następnie utrwalone, przepuszczalne i potraktowane anty-HA. CRF-R2 wizualizowano przy użyciu sprzężonego przeciwciała anty-mysiego (IgG1) Alexa 594 nm. DAPI wykorzystano do wizualizacji stadium mitotycznego jąder.
  4. Aby ograniczyć subiektywność eksperymentatora, warunki eksperymentu nie były znane, dopóki obrazy nie zostały pozyskane i przeanalizowane.
  5. Uzyskaliśmy obrazy ze stałych komórek HEK293 za pomocą planapochromatycznego obiektywu DIC 63x/1,4 oil i mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510 META połączonego z koherentnym zintegrowanym dwufotonowym systemem laserowym składającym się z lasera Verdi-V5 i systemu laserowego Mira 900-F.
  6. Podczas procesu pozyskiwania danych komórki podzielono na sekcje zarówno przez przekroje wielospektralne, 488 nm i 790 nm (~ 350 nm 2ph Ex.), jak i partycjonowanie z (przyrosty 0,5 μm), aby uwzględnić dane z błony jądrowej do zewnętrznych kończyn receptora zewnątrzkomórkowego.
  7. Dane fluorescencyjne zostały najpierw przetworzone przy użyciu Imaris, który umożliwia wizualizację i segmentację zestawu danych mikroskopii 3D, a następnie stworzono model 3D złożony z wokseli sześciennych do analizy morfometrycznej.
    Następnie moduł Imaris XT został wykorzystany do połączenia Imaris z językiem programu komputerowego MATLAB w celu określenia współrzędnych punktowych rozszerzeń GPCR.
    Aby uwzględnić zmienność komórkową, uzyskaliśmy i przeanalizowaliśmy obrazy fluorescencyjne pobrane z 22 komórek: bez leczenia (NT) (n = 7), leczenia agonistą (CRF) (n = 8) i przed leczeniem antagonistą (AS-30) przed leczeniem agonistycznym (n = 7) (Figura 2).
    1. Obszar zainteresowania (ROI) powinien obejmować jedną komórkę, która nie jest w aktywnej fazie mitotycznej i nie znajduje się blisko innych komórek. W ten sposób analiza obejmie komórki z tylko jednym jądrem, a rozszerzenia receptorów nie są zaburzone przez bliskość innych komórek.
    2. Komórkowa struktura 3D została najpierw zrekonstruowana na podstawie wielospektralnych danych fluorescencyjnych przy użyciu Imaris (v.7.1.1).
    3. Zgodnie z algorytmem zaprojektowanym przez Imaris, najpierw wykorzystano renderowanie powierzchni do przedstawienia membrany jądrowej. Imaris określi, czy w ROI znajduje się więcej niż jedno jądro.
    4. Następnie algorytm tworzenia spotów został wykorzystany do zlokalizowania rozszerzenia CRF-R2. Wykorzystano detekcję plam, ponieważ kompensuje ona szum tła i nieregularną intensywność złożonej sieci komórek o kształcie amorficznym
      5. .
    5. Aby zmaksymalizować włączenie każdej jednostki detekcji fluorescencji CRF-R2, średnica plamek została ustawiona na 0,2 μm, co jest najmniejszą jednostką na obrazie w celu ekstrapolacji odrębnych informacji w postaci zmierzonej intensywności przy użyciu filtra Gaussa. Filtrowanie punktowe zostało włączone do automatycznego procesu tworzenia spotów. Oprogramowanie daje jednak użytkownikowi elastyczność w korzystaniu z filtrów do definiowania parametrów.
    6. Aby uniknąć obcinania danych, zestaw danych został przekonwertowany z 8-bitowego (bez znaku) stałego na 32-bitowy dziesiętny.
    7. Dane o intensywności wokseli wymieniono na dane o współrzędnych punktowych za pomocą modułu Imaris XT sprzężonego z MATLAB, a dokładna lokalizacja przestrzenna każdego punktu została określona poprzez wykonanie transformacji odległości przy użyciu błony jądrowej jako punktu odniesienia (rysunek 3).
  8. Uzyskane dane można określić ilościowo i przedstawić w formie graficznej do analizy statystycznej. Porównania między grupami przeprowadzono za pomocą dwukierunkowej ANOVA i posttestu Bonferroniego. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Różnice uznaje się za istotne przy *p < 0,05. Obliczenia wykonano za pomocą GraphPad Prism 5.02 (Rysunek 4).

2. Reprezentatywne wyniki

Aby zademonstrować moc naszego podejścia, określiliśmy ilościowo zmiany komórkowe, które wynikają z interakcji receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) i receptora czynnika uwalniającego kortykotropinę-2 (CRF-R2) z jego endogennym ligandem CRF w transfekowanych komórkach HEK293.

Pokazujemy, że receptory CRF-R2 znajdują się w błonie plazmatycznej i wychodzą ze skończonych obszarów błony komórkowej (Rysunek 2A i Film 1). Za pomocą konwencjonalnej analizy 2D możliwe jest wykrycie tego podzbioru zewnątrzkomórkowych receptorów CRF-R2 tylko wtedy, gdy przeanalizujemy punkty adhezji receptorów na szklanych osłonach. W związku z tym tracimy wszelkie inne informacje pochodzące z danych wielospektralnych z-stacked (Rysunek 5).

Gdy komórki są leczone CRF, receptory zewnątrzkomórkowe są znacznie zredukowane, co pokazuje zmniejszenie odległości plamek od błony plazmatycznej. Są one również redystrybuowane z pierwotnie skończonych lokalizacji do wielu dyskretnych lokalizacji (Rysunek 2B i Film 2).

Wpływ CRF na dystrybucję błony receptorowej jest zapobiegany przez wstępne leczenie specyficznym dla CRF-R2 antagonistą, antysavagine 30 (AS-30) i stwierdzamy, że rozszerzenia CRF-R2 nie zmieniają się (Rysunek 2C i Filmik 3).

Dystalny rozkład plamek, wykreślony w odstępach 5 μm oznaczonych kolorami, jest wykorzystywany do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak leczenia i wstępne leczenie antagonistami (AS-30, 1 μM, 30 min) przed leczeniem agonistycznym (CRF, 1 μM, 30 min) nie wykazują istotnej (n.s.) różnicy w skurczu GPCR. Traktowanie komórek agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) stopniowo zmniejsza liczbę wokseli zawierających CRF-R2 w porównaniu z brakiem leczenia, 0-5 μm (n.s.), 6-15 μm (**p<0,01) i >15 μm (***p< 0,005) lub w porównaniu z traktowaniem AS-30, 0-10 μm (n.s.), 11-15 μm (**p<0,01) i >15 μm (***p< 0,005) (Figura 4).

figure-protocol-1
Rysunek 1 . Schemat aktualnie dostępnych technik i ich ograniczeń do analizy obrazów fluorescencyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Wielospektralne obrazy fluorescencyjne 3D komórek transfekowanych HEK293 HA-CRF-R2 przed i po leczeniu agonistą i antagonistą. Scalone obrazy przedstawiające HA-CRF-R2 sondowane przy użyciu anty-HA i wizualizowane przy użyciu sprzężonego przeciwciała anty-mysiego Alexa488 (IgG 1); Do wizualizacji jąder wykorzystano DAPI. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego laserowego (CLS). Podziałka 5 μm.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Model 3D komórek transfekowanych HEK293 za pomocą HA-CRF-R2 zrekonstruowany z obrazów CLS przy użyciu oprogramowania Imaris. Odwzorowanie powierzchni jądra i tworzenie plamek opisujących rozszerzenia GPCR przekształcone w małe pęcherzyki. Dane dotyczące fluorescencji zostały najpierw przetworzone przy użyciu oprogramowania Imaris, które umożliwia wizualizację i segmentację zestawu danych mikroskopii 3D. Następnie Imaris XT został wykorzystany do połączenia Imaris z MATLAB. Natężenia wokseli zostały zamienione na współrzędne punktowe. Kolor oznaczony widmem plamek (niebieski 0-5 μm, zielony, 6-10 μm, żółty 11-15 μm i czerwony >15 μm) reprezentują odległość od błony jądrowej. Skala 5 μm.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Graficzne przedstawienie dystalnego rozkładu plamek wykreślonych w widmie oznaczonym kolorem w odstępach 5 μm jest wykorzystywane do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak leczenia i wstępne leczenie antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed leczeniem agonistycznym (CRF, 1 μM, 30 min) nie wykazują istotnej (b.s.) różnicy w skurczu GPCR. Traktowanie komórek agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) stopniowo zmniejsza odległość liczby wokseli zawierających CRF-R2 w porównaniu z brakiem leczenia 0-5 μm (n.s.), 6-15 μm (**p<0,01) i >15 μm (***p< 0,005); lub obróbka AS-30 0-10 μm (n.s.), 11-15 μm (**p<0,01) i >15 μm (***p< 0,005).

figure-protocol-5
Rysunek 5. Ograniczenie analizy morfometrycznej 2D komórek transfekowanych HEK 293 za pomocą HA-CRF-R2. Przekrój środkowej płaszczyzny komórek (3-4 μm powyżej szkiełka nakrywkowego) pokazujący środek jąder uwidoczniony za pomocą DAPI i HA-CRF-R2 sondowany za pomocą anty-HA i uwidoczniony za pomocą sprzężonego przeciwciała anty-mysiego (IgG1) Alexa 488nm i uzyskany za pomocą CLS nie wykazuje różnicy między (A) nieleczonym (NT) a (B) agonistą (CRF, 1 μM, 30 min), podczas gdy punkty adhezji receptorów są diametralnie różne.

Film 1. Swobodnie obracający się model 3D w trybie "Surpass" komórek transfekowanych HEK 293 z HA-CRF-R2, bez leczenia, w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym między białkami receptorowymi. Skala od 5 do 20 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Swobodnie obracający się model 3D w trybie "Surpass" transfekowanych komórek HEK 293 z HA-CRF-R2, leczenie agonistyczne, CRF (CRF, 1 μM, 30 min) w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym między białkami receptorowymi. Skala od 5 do 20 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 3. Swobodnie obracający się obraz 3D w trybie "Surpass" transfekowanych komórek HEK 293 z HA-CRF-R2, wstępne traktowanie antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed leczeniem agonistycznym (CRF, 1 μM, 30 min) w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym między białkami receptorowymi. Skala od 5 do 20 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazaliśmy, że leczenie CRF wywołało istotną zmianę w morfologii i lokalizacji CRF-R2. Zmiana CRF-R2 została zahamowana przez selektywne leczenie antagonistami. Wykazaliśmy, że modyfikacje receptorów nie zostały wykryte i nie mogą być mierzone przy użyciu standardowych technik wielospektralnych 2D. Możliwość badania złożonych obrazów 3D ma kluczowe znaczenie dla uwzględnienia złożoności parametrów biologicznych w analizie morfometrycznej. Udało nam się wykonać pomiary 3D komórek bez predefiniowanego kształtu z niespójny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Centrum Rozwoju Obrazowania Biologicznego (BIDC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco za korzystanie z Imaris, Imaris XT i Matlab. Dziękujemy V. Kharazii za pomoc techniczną oraz A.T. Henry'emu, L.K. Florenowi, L. Daitchowi za ich wkład w redakcję rękopisu. Praca ta była wspierana przez fundusze ze Stanu California Medical Research on Alcohol & Substance Abuse za pośrednictwem UCSF dla SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 oraz nagrodę NIH Fast Track na przegląd kolekcji MLSMR dla SEB, UCSF School of Pharmacy (dziekanat i farmacja kliniczna) oraz School of Medicine (Farmakologia kliniczna i terapia eksperymentalna) dla CLHK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzka nerka embrionalna (HEK293) Kolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-1573
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)Invitrogen11965118
płodowa surowica bydlęca (FBS)InvitrogenSH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b) InvitrogenA-11001
monoklonalny anty-HA.11 (IgG1)Covance16B12
DAPIVector LaboratoriesH-1200
CRFSigmaC2917
Antisauvagine-30 (AS-30)SigmaA4727

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  2. Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
  3. Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
  4. Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
  5. Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
  6. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
  7. Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
  8. Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
  9. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
  10. Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
  11. Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D Fluorescence ImagingCellular Morphology AnalysisConfocal MicroscopyImaris SoftwareMATLAB IntegrationGPCR Receptor TrackingAutomated Morphometric QuantificationReceptor Trafficking AnalysisDrug Discovery AssayFluorescence Image Segmentation

Powiązane artykuły