Artykuł metodologiczny

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

14.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4233

⸱

31 sierpnia 2012

 ,  , 
1Medications Development, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco , 2Clinical Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of California, San Francisco , 3Translational Research Institute and the Institute for Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Streszczenie

Najpowszechniejsze dostępne narzędzia do analizy programowej służące do pomiaru obrazów fluorescencyjnych dotyczą danych dwuwymiarowych (2D), które opierają się na ręcznych ustawieniach w celu włączenia lub wykluczenia punktów danych oraz na wspomaganym komputerowo rozpoznawaniu wzorców, aby wesprzeć interpretację i wyniki analizy. Coraz ważniejsza staje się zdolność do pomiaru obrazów fluorescencyjnych zbudowanych z zestawów danych trójwymiarowych (3D), aby móc uchwycić złożoność dynamiki komórkowej i zrozumieć podstawy plastyczności komórek w systemach biologicznych. Zaawansowane instrumenty mikroskopowe umożliwiły wizualizację trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych poprzez akwizycję wielospektralnych obrazów fluorescencyjnych oraz zastosowanie potężnego oprogramowania analitycznego, które rekonstruuje obrazy ze stosów konfokalnych, zapewniając tym samym reprezentację 3D zebranych obrazów 2D. Nowoczesne metody stereologii oparte na projekcie ewoluowały z przybliżeń i założeń pierwotnej stereologii opartej na modelach1, nawet w przypadku złożonych przekrojów tkankowych2. Pomimo tych postępów naukowych w mikroskopii, nadal istnieje potrzeba opracowania zautomatyzowanej metody analitycznej, która w pełni wykorzystuje natywne dane 3D, aby umożliwić analizę i kwantyfikację złożonych zmian w morfologii komórek, lokalizacji białek oraz transporcie receptorów.

Obecne techniki dostępne do kwantyfikacji obrazów fluorescencyjnych obejmują Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) oraz Image J (NIH), które umożliwiają analizę manualną. Oprogramowanie Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlandia Północna) oferuje funkcję MeasurementPro, która pozwala na ręczne tworzenie punktów pomiarowych, które można umieścić w obrazie wolumetrycznym lub narysować na serii przekrojów 2D w celu utworzenia obiektu 3D. Metoda ta jest użyteczna przy pomiarach punktowych jednym kliknięciem w celu zmierzenia odległości liniowej między dwoma obiektami lub utworzenia wielokąta obejmującego obszar zainteresowania, jednak trudno ją zastosować do złożonych struktur sieci komórkowych. Moduł Filament Tracer (Andor) umożliwia automatyczną detekcję trójwymiarowych struktur przypominających włókna neuronalne, jednak moduł ten został opracowany do pomiaru zdefiniowanych struktur, takich jak neurony, składających się z dendrytów, aksonów i kolców (struktura drzewiasta). Moduł ten był pomysłowo wykorzystywany do pomiarów morfologicznych komórek nieneuronalnych3, jednak dane wyjściowe dostarczają informacji o rozległej sieci komórkowej przy użyciu oprogramowania opartego na zdefiniowanym kształcie komórki, a nie na modelu komórkowym o kształcie amorficznym. Aby rozwiązać problem analizy komórek o kształcie amorficznym i uczynić oprogramowanie bardziej odpowiednim do zastosowań biologicznych, firma Imaris opracowała Imaris Cell. Był to projekt naukowy z Eidgenössische Technische Hochschule, stworzony w celu obliczenia relacji między komórkami a organellami. Choć oprogramowanie to umożliwia detekcję ograniczeń biologicznych poprzez wymuszanie obecności jednego jądra na komórkę i wykorzystanie błon komórkowych do segmentacji komórek, nie może być ono użyte do analizy danych fluorescencyjnych, które nie są ciągłe, ponieważ w idealnych warunkach buduje ono powierzchnię komórki bez pustych przestrzeni. Z naszej wiedzy, obecnie nie opracowano żadnego modyfikowalnego przez użytkownika automatycznego podejścia do uzyskiwania informacji morfometrycznych z obrazów fluorescencyjnych 3D, które pozwalałoby na uzyskanie informacji przestrzennych o komórkach o niezdefiniowanym kształcie (Rycina 1).

Opracowaliśmy platformę analityczną wykorzystującą podstawowy moduł oprogramowania Imaris oraz Imaris XT zintegrowany z programem MATLAB (Mat Works, Inc.). Narzędzia te umożliwiają trójwymiarowy pomiar komórek o niezdefiniowanym kształcie i niespójnych komponentach sieci fluorescencyjnych. Ponadto metoda ta pozwoli badaczom posiadającym szeroką wiedzę w zakresie systemów biologicznych, lecz niebędącym ekspertami w obsłudze aplikacji komputerowych, na przeprowadzenie ilościowej oceny zmian morfologicznych w dynamice komórek.

Protokół

1. Trójwymiarowa analiza morfometryczna zmian fenotypowych pojedynczych komórek

  1. Komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK293) przetransfekowano receptorem 2 czynnika uwalniającego kortykotropinę (CRF-R2) z znacznikiem hemaglutyniny (HA), będącym receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), zgodnie z wcześniejszym opisem4, 5.
  2. Komórki pozostawiono nieleczone (brak opracowania, NT), stymulowano endogennym ligandem CRF-R2, czynnikiem uwalniającym kortykotropinę, CRF (1 μM, 30 min) lub poddano wstępnemu leczeniu selektywnym antagonistą CRF-R2, anti-sauvagine 30 (AS-30, 1 μM, 30 min) przed podaniem agonisty.
  3. Następnie komórki utrwalono, permeabilizowano i inkubowano z przeciwciałem anty-HA. CRF-R2 wizualizowano przy użyciu przeciwciała anty-mysiego (IgG1) sprzężonego z barwnikiem Alexa 594 nm. DAPI wykorzystano do wizualizacji fazy mitotycznej jąder.
  4. Aby ograniczyć subiektywizm eksperymentatora, warunki doświadczalne nie były znane aż do momentu pozyskania i przeanalizowania obrazów.
  5. Obrazy utrwalonych komórek HEK293 pozyskano przy użyciu obiektywu Plan-apochromat 63x/1.4 oil DIC i konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 META połączonego z zintegrowanym dwufotonowym systemem laserowym Coherent, składającym się z lasera Verdi-V5 oraz systemu laserowego Mira 900-F.
  6. Podczas procesu akwizycji danych komórki podzielono na przedziały zarówno poprzez sekcjonowanie wielospektralne (488 nm i 790 nm (~350 nm 2ph Ex.)), jak i partycjonowanie w osi z (przyrosty 0.5 μm), aby uwzględnić dane od błony jądrowej po zewnętrzne krańce receptorów zewnątrzkomórkowych.
  7. Dane fluorescencyjne przetworzono najpierw w programie Imaris, który umożliwia wizualizację i segmentację trójwymiarowych zbiorów danych z mikroskopii, a następnie utworzono model 3D złożony z sześciennych wokseli do analizy morfometrycznej.
    Następnie wykorzystano moduł Imaris XT do połączenia programu Imaris z językiem programowania MATLAB w celu wyznaczenia współrzędnych punktów (spots) wypustek GPCR.
    Aby uwzględnić zmienność komórkową, pozyskano i przeanalizowano obrazy fluorescencyjne z 22 komórek: bez leczenia (NT) (n = 7), po leczeniu agonistą (CRF) (n = 8) oraz po wstępnym leczeniu antagonistą (AS-30) przed podaniem agonisty (n = 7) (Rysunek 2).
    1. Obszar zainteresowania (ROI) powinien obejmować jedną komórkę, która nie znajduje się w aktywnej fazie mitotycznej i nie leży blisko innych komórek. W ten sposób analiza obejmie komórki z tylko jednym jądrem, a wypustki receptorowe nie będą zaburzone przez bliskość innych komórek.
    2. Trójwymiarową strukturę komórkową zrekonstruowano najpierw z wielospektralnych danych fluorescencyjnych przy użyciu programu Imaris (v.7.1.1).
    3. Zgodnie z algorytmem opracowanym przez Imaris, najpierw wykorzystano renderowanie powierzchni (Surface rendering) do reprezentacji błony jądrowej. Program Imaris określi, czy w obszarze ROI znajduje się więcej niż jedno jądro.
    4. Następnie wykorzystano algorytm tworzenia punktów (spots-creation) do zlokalizowania wypustek CRF-R2. Detekcję punktów zastosowano, ponieważ kompensuje ona szum tła i nieregularną intensywność złożonej sieci amorficznych komórek.
    5. Aby zmaksymalizować uwzględnienie każdej jednostki detekcji fluorescencji CRF-R2, średnicę punktów ustawiono na 0.2 μm, co stanowi najmniejszą jednostkę w obrazie pozwalającą na ekstrapolację odrębnych informacji w postaci zmierzonej intensywności przy użyciu filtra Gaussa. Filtrowanie punktów włączono do procesu zautomatyzowanego tworzenia punktów. Oprogramowanie daje jednak użytkownikowi możliwość elastycznego stosowania filtrów do definiowania parametrów.
    6. Aby uniknąć ucinania danych, zbiór danych przekonwertowano z 8-bitowego (bez znaku) punktu stałego na 32-bitowy format dziesiętny.
    7. Dane o intensywności wokseli zamieniono na dane o współrzędnych punktów za pomocą modułu Imaris XT zintegrowanego z programem MATLAB, a dokładną lokalizację przestrzenną każdego punktu wyznaczono poprzez transformację odległości, przyjmując błonę jądrową jako punkt odniesienia (Rysunek 3).
  8. Otrzymane dane można skwantyfikować i przedstawić w formie graficznej do analizy statystycznej. Porównania między grupami przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (Two-way ANOVA) i testu post-hoc Bonferroniego. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Różnice uznano za istotne przy *p < 0.05. Obliczenia wykonano w programie GraphPad Prism 5.02 (Rysunek 4).

2. Reprezentatywne wyniki

Aby zaprezentować skuteczność naszego podejścia, ilościowo określono zmiany komórkowe wynikające z oddziaływania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCRs) oraz receptora kortykoliberyny 2 (CRF-R2) z jego endogennym ligandem CRF w transfektowanych komórkach HEK293.

Wykazujemy, że receptory CRF-R2 znajdują się w błonie plazmatycznej i wystają z ograniczonych obszarów błony komórkowej (Rycina 2A oraz Film 1). Przy użyciu konwencjonalnej analizy 2D wykrycie tej podgrupy zewnątrzkomórkowych receptorów CRF-R2 jest możliwe tylko wtedy, gdy analizujemy punkty adhezji receptorów na szkiełkach podstawowych. W konsekwencji tracimy wszelkie inne informacje wynikające z wielospektralnych danych z serii obrazów w osi z (Rycina 5).

Po potraktowaniu komórek CRF liczba receptorów zewnątrzkomórkowych znacznie spada, co objawia się zmniejszeniem odległości plamek od błony komórkowej. Następuje również ich redystrybucja z lokalizacji głównie ograniczonych do wielu rozproszonych punktów (Rysunek 2B oraz Film 2).

Efekt CRF na dystrybucję receptorów w błonie jest zapobieganym poprzez wstępne podanie specyficznego antagonisty CRF-R2, antisavagine 30 (AS-30), i stwierdzamy, że rozszerzenia CRF-R2 nie ulegają zmianie (Rycina 2C oraz Film 3).

Dystalny rozkład plamek, naniesiony na interwały widmowo-kolorowe co 5 μm, służy do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak traktowania oraz pretreatment antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed traktowaniem agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) nie wykazują istotnej (n.s.) różnicy w kontrakcji GPCR. Traktowanie komórek agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) progresywnie redukuje liczbę wokseli zawierających CRF-R2 w porównaniu do braku traktowania: 0-5 μm (n.s.), 6-15 μm (**p<0.01) i >15 μm (***p< 0.005), lub w porównaniu do traktowania AS-30: 0-10 μm (n.s.), 11-15 μm (**p<0.01) i >15 μm (***p< 0.005) (Rycina 4).

Schemat metod obrazowania fluorescencyjnego 3D; automatyzacja; ograniczenia; struktury neuronów.
Rycina 1 . Schemat obecnie dostępnych technik i ich ograniczeń w analizie obrazów fluorescencyjnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Mikrografie z mikroskopii fluorescencyjnej porównujące struktury komórkowe przy różnych traktowaniach: NT, CRF, AS-30.
Rycina 2. Trójwymiarowe wielospektralne obrazy fluorescencyjne komórek HEK293 przetransfekowanych HA-CRF-R2 przed i po traktowaniu agonistą oraz antagonistą. Obrazy złożone pokazują HA-CRF-R2 wykryty za pomocą przeciwciał anty-HA i wizualizowany przy użyciu przeciwciała wtórnego anty-mysiego (IgG1) koniugowanego z Alexa 488; do wizualizacji jąder komórkowych użyto DAPI. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLS). Pasek skali 5 μm.

Analiza morfologii komórek; obraz z mikroskopii konfokalnej; dane o strukturach komórkowych z kodowaniem kolorystycznym.
Rycina 3. Model 3D transfektowanych komórek HEK293 z HA-CRF-R2 zrekonstruowany z obrazów CLS przy użyciu oprogramowania Imaris. Rendering powierzchni jądra komórkowego oraz tworzenie punktów opisujących rozszerzenia GPCR przekształcone w małe pęcherzyki. Dane fluorescencyjne zostały najpierw przetworzone w programie Imaris, który umożliwia wizualizację i segmentację zestawu danych z mikroskopii 3D. Następnie wykorzystano Imaris XT do połączenia Imaris z MATLAB. Intensywności wokseli zostały zamienione na współrzędne punktów. Kolor kodujący widmo punktów (niebieski 0-5 μm, zielony 6-10 μm, żółty 11-15 μm i czerwony >15 μm) reprezentuje odległość od błony jądrowej. Skala 5 μm.

Wykres słupkowy; liczba pęcherzyków względem odległości od jądra, istotność statystyczna; analiza biologii komórki.
Rycina 4. Graficzna reprezentacja dystalnego rozkładu punktów naniesionych na widmo z kodowaniem kolorami w interwałach 5 μm służy do wizualizacji odległości wokseli od błony jądrowej. Brak terapii oraz pretreatment antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed podaniem agonisty (CRF, 1 μM, 30 min) nie wykazują istotnych (n.s.) różnic w kontrakcji GPCR. Traktowanie komórek agonistą (CRF, 1 μM, 30 min) progresywnie zmniejsza odległość liczby wokseli zawierających CRF-R2 w porównaniu do braku terapii: 0-5 μm (n.s.), 6-15 μm (**p<0.01) i >15 μm (***p< 0.005); lub w porównaniu do traktowania AS-30: 0-10 μm (n.s.), 11-15 μm (**p<0.01) i >15 μm (***p< 0.005).

Analiza adhezji komórek, mikroskopia fluorescencyjna; NT vs CRF, wariacje ostrości w płaszczyźnie z, schemat.
Rycina 5. Ograniczenia 2D analizy morfometrycznej komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2. Przekrój przez płaszczyznę środkową komórek (3-4μm powyżej szkiełka podstawowego) pokazujący centrum jąder wizualizowanych za pomocą DAPI oraz HA-CRF-R2 wykrywane przy użyciu przeciwciała anty-HA i wizualizowane za pomocą koniugowanego z Alexa 488nm wtórnego przeciwciała anty-mysiego (IgG1), obrazowane przy użyciu CLS, nie wykazuje różnic między (A) brakiem traktowania (NT) a (B) agonistą (CRF, 1 μM, 30 min), podczas gdy punkty adhezji receptorów różnią się drastycznie.

Film 1. Swobodnie obracający się model 3D w trybie „Surpass” komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2, bez obróbki, w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym pomiędzy białkami receptorowymi. Pasek skali od 5 do 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Film 2. Swobodnie obracający się model 3D w trybie „Surpass” komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2, po zastosowaniu agonisty, CRF (CRF, 1 μM, 30 min), w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym między białkami receptorowymi. Pasek skali od 5 do 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Film 3. Swobodna rotacja 3D w trybie „Surpass” komórek HEK 293 przetransfekowanych HA-CRF-R2, z wstępną inkubacją z antagonistą (AS-30, 1 μM, 30 min) przed podaniem agonisty (CRF, 1 μM, 30 min) w celu oceny różnic w fenotypie komórkowym białek receptorowych. Pasek skali od 5 do 20 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykazaliśmy, że traktowanie CRF indukuje istotną zmianę morfologii i lokalizacji CRF-R2. Zmiana CRF-R2 została zahamowana przez traktowanie selektywnym antagonistą. Wykazaliśmy, że modyfikacje receptorów nie zostały wykryte i nie mogą być mierzone przy użyciu standardowych technik multispektralnych 2D. Zdolność do badania złożonych obrazów 3D jest kluczowa dla uwzględnienia złożoności parametrów biologicznych w analizie morfometrycznej. Byliśmy w stanie przeprowadzić pomiary 3D komórek o niezdefiniowanym kształcie z nies...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Biological Imaging Development Center (BIDC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco za możliwość korzystania z oprogramowania Imaris, Imaris XT oraz Matlab. Dziękujemy V. Kharazia za pomoc techniczną oraz A.T. Henry, L.K. Floren i L. Daitch za wkład w redakcję tekstu. Praca ta była finansowana ze środków stanowych Kalifornii na badania medyczne nad nadużywaniem alkoholu i substancji psychoaktywnych (State of California Medical Research on Alcohol & Substance Abuse) przekazanych za pośrednictwem UCSF dla SEB, z National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 oraz grantu NIH Fast Track na przesiewową analizę kolekcji MLSMR dla SEB, a także przez UCSF School of Pharmacy (Dean's Office and Clinical Pharmacy) oraz School of Medicine (Clinical Pharmacology & Experimental Therapeutics) dla CLHK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzkie embrionalne komórki nerki (HEK293) American Type Culture CollectionCRL-1573
Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Invitrogen11965118
Płodowa surowica bydlęca (FBS)InvitrogenSH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b) InvitrogenA-11001
monoklonalne przeciwciało anty-HA.11 (IgG1)Covance16B12
DAPIVector LaboratoriesH-1200
CRFSigmaC2917
Antisauvagine-30 (AS-30)SigmaA4727

Bibliografia

  1. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  2. Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
  3. Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
  4. Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
  5. Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
  6. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
  7. Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
  8. Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
  9. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
  10. Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
  11. Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe obrazowanie fluorescencyjneanaliza morfologii kom rkowejmikroskopia konfokalnaoprogramowanie Imarisintegracja z MATLABledzenie receptor w GPCRzautomatyzowana kwantyfikacja morfometrycznaanaliza transportu receptor wtest w odkrywaniu lek wsegmentacja obraz w fluorescencyjnych

Powiązane artykuły