Method Article
Opracowaliśmy platformę oprogramowania, która wykorzystuje Imaris Neuroscience, ImarisXT i MATLAB do pomiaru zmian w morfologii niezdefiniowanego kształtu, pobranego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w kształcie komórki po aktywacji receptora, a zatem stanowi potencjalne dodatkowe narzędzie do odkrywania leków.
Najbardziej powszechnymi narzędziami do analizy oprogramowania dostępnymi do pomiaru obrazów fluorescencyjnych są dane dwuwymiarowe (2D), które opierają się na ręcznych ustawieniach włączania i wykluczania punktów danych, oraz wspomagane komputerowo rozpoznawanie wzorców, które wspierają interpretację i wyniki analizy. Coraz ważniejsza staje się możliwość pomiaru obrazów fluorescencyjnych zbudowanych z trójwymiarowych (3D) zestawów danych, aby móc uchwycić złożoność dynamiki komórkowej i zrozumieć podstawy plastyczności komórkowej w systemach biologicznych. Zaawansowane instrumenty mikroskopowe umożliwiły wizualizację obrazów fluorescencyjnych 3D poprzez akwizycję wielospektralnych obrazów fluorescencyjnych i potężnego oprogramowania analitycznego, które rekonstruuje obrazy ze stosów konfokalnych, które następnie zapewniają reprezentację 3D zebranych obrazów 2D. Zaawansowane metody stereologii oparte na projektowaniu rozwinęły się w porównaniu z przybliżeniem i założeniami oryginalnej stereologii opartej na modelu1 nawet w złożonych skrawkach tkanek2. Pomimo tych postępów naukowych w mikroskopii, nadal istnieje zapotrzebowanie na zautomatyzowaną metodę analityczną, która w pełni wykorzystuje wewnętrzne dane 3D, aby umożliwić analizę i kwantyfikację złożonych zmian w morfologii komórek, lokalizacji białek i transporcie receptorów.
Obecne techniki dostępne do ilościowego oznaczania obrazów fluorescencyjnych obejmują Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i Image J (NIH), które zapewniają ręczną analizę. Oprogramowanie Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlandia Północna) udostępnia funkcję MeasurementPro, która umożliwia ręczne tworzenie punktów pomiarowych, które można umieścić na obrazie objętościowym lub narysować na serii plasterków 2D w celu utworzenia obiektu 3D. Ta metoda jest przydatna w przypadku pomiarów punktowych jednym kliknięciem w celu zmierzenia odległości linii między dwoma obiektami lub utworzenia wielokąta otaczającego obszar zainteresowania, ale jest trudna do zastosowania w przypadku złożonych struktur sieci komórkowych. Filament Tracer (Andor) umożliwia automatyczne wykrywanie neuronów 3D przypominających włókna, jednak moduł ten został opracowany do pomiaru zdefiniowanych struktur, takich jak neurony, które składają się z dendrytów, aksonów i kolców (struktura przypominająca drzewo). Moduł ten został genialnie wykorzystany do wykonywania pomiarów morfologicznych komórek nieneuronalnych3, jednak dane wyjściowe dostarczają informacji o rozszerzonej sieci komórkowej za pomocą oprogramowania, które zależy od zdefiniowanego kształtu komórki, a nie jest amorficznym modelem komórkowym. Aby przezwyciężyć problem analizy komórek o kształcie amorficznym i dostosowania oprogramowania do zastosowań biologicznych, firma Imaris opracowała Imaris Cell. Był to projekt naukowy realizowany we współpracy z Eidgenössische Technische Hochschule, który został opracowany w celu obliczenia relacji między komórkami a organellami. Chociaż oprogramowanie umożliwia wykrywanie ograniczeń biologicznych, wymuszając jedno jądro na komórkę i wykorzystując błony komórkowe do segmentacji komórek, nie można go wykorzystać do analizy danych fluorescencyjnych, które nie są ciągłe, ponieważ w idealnym przypadku buduje powierzchnię komórki bez pustych przestrzeni. Zgodnie z naszą wiedzą, obecnie nie opracowano modyfikowalnego przez użytkownika zautomatyzowanego podejścia, które dostarczałoby informacji morfometrycznych z obrazów fluorescencyjnych 3D, które uzyskuje komórkową informację przestrzenną o nieokreślonym kształcie (ryc. 1).
Opracowaliśmy platformę analityczną, korzystając z modułu oprogramowania Imaris core i Imaris XT połączonego z MATLAB (Mat Works, Inc.). Narzędzia te umożliwiają pomiar 3D komórek bez predefiniowanego kształtu i z niespójnymi składnikami sieci fluorescencyjnej. Co więcej, metoda ta pozwoli naukowcom, którzy mają rozszerzoną wiedzę specjalistyczną w zakresie systemów biologicznych, ale nie są zaznajomieni z aplikacjami komputerowymi, na ilościowe określenie zmian morfologicznych w dynamice komórki.
1. Trójwymiarowa analiza morfometryczna zmian fenotypowych w pojedynczych komórkach
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Wykazaliśmy, że leczenie CRF wywołało istotną zmianę w morfologii i lokalizacji CRF-R2. Zmiana CRF-R2 została zahamowana przez selektywne leczenie antagonistami. Wykazaliśmy, że modyfikacje receptorów nie zostały wykryte i nie mogą być mierzone przy użyciu standardowych technik wielospektralnych 2D. Możliwość badania złożonych obrazów 3D ma kluczowe znaczenie dla uwzględnienia złożoności parametrów biologicznych w analizie morfometrycznej. Udało nam się wykonać pomiary 3D komórek bez predefiniowanego kształtu z niespójny.......
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Dziękujemy Centrum Rozwoju Obrazowania Biologicznego (BIDC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco za korzystanie z Imaris, Imaris XT i Matlab. Dziękujemy V. Kharazii za pomoc techniczną oraz A.T. Henry'emu, L.K. Florenowi, L. Daitchowi za ich wkład w redakcję rękopisu. Praca ta była wspierana przez fundusze ze Stanu California Medical Research on Alcohol & Substance Abuse za pośrednictwem UCSF dla SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 oraz nagrodę NIH Fast Track na przegląd kolekcji MLSMR dla SEB, UCSF School of Pharmacy (dziekanat i farmacja kliniczna) oraz School of Medicine (Farmakologia kliniczna i terapia eksperymentalna) dla CLHK.
....Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Ludzka nerka embrionalna (HEK293) | Kolekcja kultur typu amerykańskiego | CRL-1573 | |
| Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| płodowa surowica bydlęca (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoklonalny anty-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission