Artykuł metodologiczny

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4238

⸱

17 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Australian Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of Botany, University of Melbourne, 2Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne, 3CSIRO Plant Industry, Black Mountain Laboratories, 4Department of Plant Biology and Biotechnology, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Streszczenie

Ściany komórkowe roślin to złożone macierze heterogenicznych glikanów, które odgrywają istotną rolę w fizjologii i rozwoju roślin oraz dostarczają surowców dla społeczeństw ludzkich (np. przemysł drzewny, papierniczy, tekstylny i biopaliwowy)1,2. Niemniej jednak zrozumienie biosyntezy i funkcji tych komponentów pozostaje wyzwaniem.

Glikany ścian komórkowych są chemicznie i konformacyjnie zróżnicowane ze względu na złożoność ich jednostek budulcowych, czyli reszt glikozylowych. Tworzą one wiązania w wielu pozycjach i różnią się strukturą pierścienia, konfiguracją izomeryczną lub anomeryczną, a ponadto są podstawione szeregiem reszt niecukrowych. Skład glikanów różni się w zależności od typu komórek i/lub tkanek, a nawet poddomen w obrębie jednej ściany komórkowej3. Co więcej, ich skład ulega modyfikacjom podczas rozwoju1 lub w odpowiedzi na sygnały środowiskowe4.

Przewiduje się, że ponad 2 000 genów bierze udział w biosyntezie i modyfikacji glikanów ścian komórkowych w Arabidopsis5. Ściany komórkowe roślin są złożonymi macierzami heterogenicznych glikanów. Jednak stosunkowo niewielu genów biosyntetycznych zostało scharakteryzowanych funkcjonalnie 4,5. Podejścia genetyki odwrotnej są trudne, ponieważ geny te są często różnicowo ekspresjonowane, często na niskich poziomach, w zależności od typu komórek6. Ponadto badania nad mutantami są często utrudnione przez redundancję genów lub mechanizmy kompensacyjne, które mają zapewnić utrzymanie odpowiedniej funkcji ściany komórkowej7. W związku z tym niezbędne są nowe podejścia, aby szybko scharakteryzować zróżnicowany zakres struktur glikanów i ułatwić zastosowanie metod genomiki funkcjonalnej w celu zrozumienia biosyntezy i modyfikacji ścian komórkowych.

Przeciwciała monoklonalne (mAbs)8,9 stały się istotnym narzędziem do określania struktury i rozmieszczenia glikanów w roślinach. Rozpoznają one odrębne epitopy występujące w głównych klasach glikanów ściany komórkowej roślin, w tym pektyn, ksyloglukanów, ksylanów, mannanów, glukanów i arabinogalaktanów. Ostatnio ich zastosowanie rozszerzono na wielkoskalowe badania przesiewowe w celu jednoczesnego określenia względnej zawartości glikanów w szerokim zakresie typów roślin i tkanek9,10,11.

Przedstawiamy tutaj metodę przesiewową glikanów opartą na mikrotablicach, zwaną kompleksowym profilowaniem polimerów mikrotablicowych (Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP) (Ryc. 1 i 2)10,11, która umożliwia analizę wielu próbek (100 sek.) przy użyciu zminiaturyzowanej platformy mikrotablicowej z zredukowanymi objętościami reagentów i próbek. Sygnały z plamek na mikrotablicy mogą być formalnie kwantyfikowane, co pozwala na uzyskanie danych półilościowych dotyczących występowania epitopów glikanów. Podejście to jest dobrze dostosowane do śledzenia zmian w glikanach w złożonych systemach biologicznych12 i zapewnia globalny przegląd składu ścian komórkowych, szczególnie w sytuacjach, gdy wcześniejsza wiedza na ten temat jest niedostępna.

Protokół

1. Pobieranie i przygotowanie tkanek

  1. Pobrać 100 mg świeżej masy tkanek roślinnych (minimum 10 mg masy suchej) w co najmniej trzech powtórzeniach dla każdej badanej tkanki. Poniższe kroki opisują przygotowanie materiału ścian komórkowych z tkanek wegetatywnych. W przypadku tkanek spichrzowych niepożądany skrobia jest usuwana enzymatycznie przed przystąpieniem do ekstrakcji polimerów ścian komórkowych zgodnie z wcześniejszym opisem13.
  2. Zhomogenizować próbki do postaci drobnego proszku w ciekłym azocie za pomocą Qiagen TissueLyser II, stosując zestawy adapterów do 24 probówek i kulki z węglika wolframu o średnicy 3 mm (30 Hz, 2 x 30 s). Alternatywnie, w przypadku przetwarzania tylko kilku próbek, należy użyć moździerza i tłuczka.
  3. Przenieść homogenaty do plastikowych probówek stożkowych o pojemności 10 ml.
  4. Przygotować materiał ścian komórkowych, przemywając homogenaty w 10 ml 80% v/v etanolu w temperaturze pokojowej i intensywnie mieszając na wortexie przez 2 min.
  5. Wirować próbki przy 3 500 x g i odrzucić nadsącz. Powtórzyć przemywanie 70% etanolem co najmniej trzy razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny, szczególnie w przypadku tkanek zawierających chlorofil.
  6. Przeprowadzić końcowe przemywanie 100% acetonem i pozostawić osady zawierające pozostałość nierozpuszczalną w alkoholu (AIR) do wysuszenia na powietrzu przez noc.
  7. Przesiać próbki AIR przez sito o oczkach 0,4 mm2, aby uzyskać drobny, jednorodny proszek i usunąć większe, słabo zmielone cząstki, które czasem pozostają w homogenacie.
  8. Odważyć 10 mg próbki AIR do mikroprowówek, z których każda zawiera szklaną kuleczkę o średnicy 3 mm w celu ułatwienia mieszania próbek.

2. Ekstrakcja glikanów ściany komórkowej

  1. pektyny oraz polimery z nimi powiązane są ekstrahowane z próbek poprzez dodanie 500 μl 50 μM CDTA (pH 7.5) do każdej próbki.
  2. Krótko wymieszaj próbki w wortexie, aby zapewnić kontakt rozpuszczalnika z materiałem próbki, a następnie mieszaj za pomocą TissueLyser przez 3 hr przy 8 Hz.
  3. Wirowkuj próbki przy 12 000 x g, ostrożnie zlej nadsączyny i przechowuj w temperaturze 4 °C.
  4. Przemyj osady w 1 ml wody dejonizowanej w celu rozcieńczenia i usunięcia pozostałego rozpuszczalnika, wymieszaj w wortexie i wirowkuj przy 13 000 x g. Powtórz ten krok, nie naruszając osadu, i usuń cały płyn z probówek przed przejściem do następnego etapu.
  5. Glikany sieciujące są ekstrahowane sekwencyjnie z pozostałego osadu ściany komórkowej przy użyciu 500 μl 4M NaOH z 0.1% w/v NaBH4, stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 2.1 - 2.4 dla ekstrakcji CDTA. NaBH4 dodaje się w celu zredukowania grupy aldehydowej (lub ketonowej) na redukującym końcu polisacharydów do alkoholu, co zapobiega odszczepianiu polisacharydów w środowisku zasadowym.
  6. Po wirowaniu nadsączyny są ponownie usuwane i przechowywane w temperaturze 4 °C, a osady dwukrotnie przemywane wodą dejonizowaną przed przejściem do kolejnej ekstrakcji.
  7. Jako krok opcjonalny, polimery resztkowe, takie jak celuloza, są ekstrahowane za pomocą 500 μl cadoxenu (31% v/v 1,2-diaminoetanu z 0.78 M CdO), stosując tę samą procedurę, która opisana została w krokach 2.1 - 2.4. Alternatywnie, całkowitą zawartość celulozy w pozostałych osadach można określić za pomocą testów kwasu octowego/azotowego (patrz Dyskusja).

3. Drukowanie mikromacierzy

  1. Odwirować nadsączniki zawierające wyekstrahowane polimery ścian komórkowych przy 13 000 x g, aby usunąć wszelkie cząstki stałe.
  2. Nanieść 50 μl każdej próbki do polipropylenowej płytki mikrotytrującej z 384 dołkami, korzystając z wcześniej przygotowanego niestandardowego układu, w którym próbki są rozmieszczone zgodnie z rodzajem tkanki i sposobem ekstrakcji.
  3. Rozcieńczyć próbki polimerów ścian komórkowych w serii rozcieńczeń seryjnych 0, 5 i 25× przy użyciu wody dejonizowanej.
  4. Parametry takie jak wysokość pinów, czas poboru i czas przebywania oraz etapy płukania są ustawiane w oprogramowaniu sterującym urządzeniem do mikroarrayów.
  5. Wilgotność w komorze drukowania jest utrzymywana na poziomie 60%, aby zapobiec odparowaniu próbek.
  6. Proces drukowania jest uruchamiany za pomocą oprogramowania LabNEXT i programu odpowiadającego układowi mikroarraya.
  7. Robot wykorzystuje piny z kanałami kapilarnymi do nanoszenia roztworów z płytki z próbkami na membranę nitrocelulozową o wymiarach 20 x 20 cm, która jest przymocowana do płaskiej płyty w urządzeniu. Każda plamka na matrycy zawiera 15 nl roztworu i jest nanoszona w trzech powtórzeniach.
  8. Identyczne mikroarraye są drukowane obok siebie na membranie, a po zakończeniu procesu drukowania są wycinane na pojedyncze matryce.
  9. W każdym eksperymencie układ matryc może być modyfikowany, aby pomieścić większą lub mniejszą liczbę próbek, rozcieńczeń lub powtórzeń.

4. Skanowanie macierzy glikanowych

  1. Po wydrukowaniu, poszczególne macierze mikroarray należy blokować w 5% w/v roztworze odtłuszczonego mleka w proszku rozpuszczonego w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (MPBS) w temperaturze pokojowej przez 2 hr w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.
  2. Macierze mikroarray inkubować z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla epitopów glikanów ściany komórkowej przez 2 hr w MPBS. Większość przeciwciał monoklonalnych przeciwko glikanom ściany komórkowej jest dostępna komercyjnie od trzech firm: Biosupplies (www.biosupplies.com.au), Carbosource Services (www.carbosource.net) oraz PlantProbes (www.plantprobes.net).
  3. Należy uwzględnić kontrolę negatywną w postaci macierzy mikroarray inkubowanej wyłącznie z MPBS, bez przeciwciał pierwszorzędowych.
  4. Macierze mikroarray płukać 3 razy w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 5 min, aby usunąć niespecyficznie związane cząsteczki.
  5. Macierze mikroarray inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w MPBS przez 2 hr. Większość przeciwciał monoklonalnych przeciwko glikanom ściany komórkowej wymaga przeciwciał wtórnych anty-mysich lub anty-szczurzych.
  6. Powtórzyć etapy płukania 3 razy buforem PBS przez 5 min, aby usunąć niespecyficzne wiązanie.
  7. Wywołać macierze mikroarray, stosując substraty chromogenne (3,3-diaminobenzydyna) lub chemiluminescencyjne (luminol).

5. Ilościowe oznaczanie

  1. Po wywołaniu zeskanuj poszczególne macierze mikroarray za pomocą skanera biurkowego o wysokiej rozdzielczości (1 200 dpi) i zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki TIFF w negatywie (Rycina 3).
  2. Oblicz całkowitą intensywność każdego punktu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów Xplore Image Processing Software (LabNEXT) z wykorzystaniem zautomatyzowanego narzędzia do tworzenia siatki. Całkowita intensywność punktu jest wyznaczana na podstawie sumy pikseli w obszarze siatki otaczającym każdy punkt.
  3. Dane siatki dla każdej macierzy mikroarray są eksportowane do pliku txt, który można ręcznie zaimportować do arkusza Excel w celu analizy. Opracowano narzędzie online (http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/), które automatycznie tłumaczy i przetwarza dane z poszczególnych plików txt.
  4. Całkowitą intensywność punktu uśrednia się dla powtórzeń nadruku oraz rozcieńczeń, aby uzyskać wartość „średniej intensywności punktu” dla każdej próbki (Rycina 2). Alternatywnie, do ilościowego określenia względnej zawartości epitopów glikanowych dla każdej próbki wykorzystuje się sygnały z punktów odpowiadających tylko jednej wartości rozcieńczenia na macierzy.
  5. Względne średnie intensywności punktów pomiędzy różnymi próbkami są przedstawiane w formie mapy ciepła (Rycina 4) przy użyciu formatowania warunkowego w programie Excel lub internetowych narzędzi do tworzenia map ciepła (http://bar.utoronto.ca/welcome.htm). Dane dla każdego typu przeciwciała są korygowane do wartości 100 i stosowana jest wartość odcięcia 5%, aby usunąć sygnał tła oraz wyniki fałszywie dodatnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Względną liczebność glikanów w sześciu typach tkanek (nitkach pręcików, pyłku, zalążniach, płatkach, działkach i znaku) kwiatów Nicotiana alata określono za pomocą metody CoMPP. Rycina 3A przedstawia reprezentatywną macierz mikroprzepływową poddaną analizie z użyciem przeciwciała monoklonalnego mAb JIM5 specyficznego dla częściowo (nisko) zmetylowanego homogalakturonanu (HG), epitopu występującego w polisacharydach pektynowych14. Epitop JIM5 jest wykrywany w ekstraktach CDTA wszystkich tkanek kwiatu, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CoMPP jest szybką i czułą metodą profilowania składu glikanów w setkach próbek pochodzenia roślinnego w ciągu zaledwie kilku dni. Metoda ta uzupełnia istniejące platformy macierzy glikanów bakteryjnych lub ssawich służące do wysokoprzepustowego przesiewania interakcji węglowodanów z białkami wiążącymi glikany, takimi jak lektyny, receptory i przeciwciała16. Dzięki szerokiej różnorodności dostępnych sond do wykrywania glikanów ścian komórkowych możliwe jest uzyskanie szczegółowych informacji o epitopach glikano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

IEM pragnie podziękować Duńskiej Radzie Badawczej (FTP oraz FNU) za dofinansowanie. ERL dziękuje za wsparcie w ramach grantu ARC DP. AB dziękuje za wsparcie udzielone przez grant ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kuleczki z węglika wolframu 3 mmQiagen69997
Mikroprobówki do zbierania (1,2 mm)Qiagen19560Można również stosować probówki do wirówek o pojemności 1,5 ml
Qiagen TissueLyser IIQiagen85300
Kuleczki szklane 3 mmSigma AldrichZ143928
CDTASigma Aldrich34588
Tlenek kadmuSigma Aldrich202894
1,2-diamino–etanSigma Aldrich03550
Membrana nitrocelulozowa (rozmiar porów 0,22 μm)GE-water process technologiesEP2HY00010Membrany o różnych rozmiarach porów są odpowiednie dla różnych typów pinów
Robot do mikromacierzy Xact IILabnext001ARobot Xact II został wyposażony w niestandardową ceramiczną płytkę 20 x 20 cm, do której przymocowano membranę nitrocelulozową
Piny do mikromacierzy Xtend RMLabnext0037-350Piny muszą być odpowiednie do nanoszenia próbek na membrany
Płytki mikrotitracyjne 384-dołkowe (polipropylenowe)Greiner781207
Przeciwciała monoklonalne przeciwglikanowePlant Probes/
CarboSource/Biosupplies		Strony internetowe: PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) oraz Biosupplies (www.biosupplies.com.au).
Przeciwciało Anti-Rat IgG (cała cząsteczka) – peroksydaza produkowana w kozie.SigmaA9037Typ przeciwciał wtórnych zależy od użytego przeciwciała pierwszorzędowego (np. wytworzone u szczura, myszy, kozy itp.).
Tabletki SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzydynySigmaD4293Typ odczynnika wywoływującego zależy od użytych przeciwciał wtórnych i metody detekcji (kolorymetrycznej lub chemiluminescencyjnej).
Substrat chemiluminescencyjny SuperSignal West PicoThermoscientific34080Patrz powyżej
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów XploreLabNext008Dostępnych jest wiele rodzajów oprogramowania z automatycznymi narzędziami do tworzenia siatki w celu pomiaru wartości pikseli plamek mikromacierzy.
Polisacharydy roślinneSigma/Megazyme

Bibliografia

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506(2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza mikromacierzyprzeciwcia a monoklonalneglikany ciany kom rkowejkompleksowe profilowanie polimer w za pomoc mikromacierzyosad nierozpuszczalny w alkoholuekstrakcja CDTAekstrakcja wodorotlenkiem soduilo ciowe okre lanie sygna u plamki

Powiązane artykuły