Nieinwazyjne obrazowanie ostrego odrzucenia allograftu po przeszczepieniu nerki u szczura z wykorzystaniem 18F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjne obrazowanie ostrego odrzucenia allograftu po przeszczepieniu nerki u szczura z wykorzystaniem ¹⁸F-FDG PET

16.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4240

⸱

28 kwietnia 2013

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym przedstawiamy model przeszczepu nerki u szczura do nieinwazyjnej oceny ostrego odrzucenia allograftu przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej z zastosowaniem 18F-fluorodeoksyglukozy.

Streszczenie

Liczba pacjentów z schyłkową niewydolnością nerek oraz liczba biorców przeszczepionych nerek stale rośnie. Epizody ostrego odrzucania komórkowego allograftu (AR) stanowią negatywny czynnik prognostyczny dla długoterminowego przeżycia przeszczepu, a jego terminowa diagnostyka jest kluczowa dla funkcji allograftu ¹. Obecnie AR można jednoznacznie zdiagnozować jedynie za pomocą biopsji gruboigłowej, która jako metoda inwazyjna niesie ze sobą znaczne ryzyko uszkodzenia lub nawet utraty przeszczepu. Co więcej, biopsje nie są możliwe do wykonania u pacjentów przyjmujących leki przeciwkrzepliwe, a ograniczony obszar pobierania próbek w tej technice może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych, jeśli AR ma charakter ogniskowy lub plamisty. W konsekwencji doprowadziło to do ciągłych poszukiwań nowych metod wykrywania AR, które często muszą być przeprowadzane na zwierzętach, z wykorzystaniem różnych modeli transplantacji.

Od początku lat 60. transplantacja nerek szczura jest uznaną metodą eksperymentalną służącą do badania i analizy odrzucania przeszczepu (AR) ². W niniejszej pracy przedstawiamy ponadto zastosowanie pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) dla małych zwierząt z użyciem ¹⁸F-fluorodeoksyglukozy (FDG) w celu oceny AR w allogenicznym modelu transplantacji nerek u szczura po nefrektomii jednostronnej oraz proponujemy obrazowanie FDG-PET przeszczepu jako nową opcję nieinwazyjnej, specyficznej i wczesnej diagnostyki AR, również w przypadku ludzi ³. Co więcej, metoda ta może być stosowana w badaniach kontrolnych w celu usprawnienia monitorowania odrzucania przeszczepu ⁴.

Protokół

1. Pobieranie organów od dawcy

Przygotować mikroskop stereotaktyczny, zważyć szczura w wieku 8-10 tygodni (masa ciała dawcy i biorcy powinna być zbliżona).
Zanestezjować szczura dawcę (Lewis Brown Norway F1, LBN F1) poprzez inhalację tlenu/izofluranu (izofluran 4 %/2 L/min tlenu). Utrzymać znieczulenie, obniżając stężenie izofluranu do 2-2,5%.
Umieścić znieczulonego szczura na podkładce chirurgicznej. Przymocować kończyny szczura do podkładki za pomocą taśmy klejącej i nałożyć maść oftalmiczną (Bepanthen, Bayer) do oczu zwierzęcia.
Wygolić i zdezynfekować brzuch szczura, a następnie wykonać cięcie wzdłuż linii środkowej brzucha od kości łonowej do tylnej krawędzi wątroby. Odsłonić lewą nerkę i jej naczynia, ostrożnie przesuwając jelita na prawą stronę. Położyć cienki arkusz gazy na lewej nerce i zwilżyć go podgrzanym roztworem soli izotonicznej, aby zapobiec wysychaniu.
Ostrożnie wypreparować tkankę tłuszczową otaczającą lewy moczowód, używając pęsety Dumont z zakrzywionym końcem (Dumont SS-45 Forceps Inox Medical, Fine Science Tools, kat. nr 11203-25). Unikać bezpośredniego kontaktu z moczowodem, zamiast tego mobilizować go wraz z wystarczającą ilością otaczającej tkanki tłuszczowej.
Oddzielić lewą żyłę nerkową od tętnicy nerkowej za pomocą pęsety Dumont z zakrzywionym końcem. Usunąć całą tkankę tłuszczową i łączną z obu naczyń oraz wypalić naczynia nadnerczowe i jawowe.
Wypreparować aortę oraz żyłę główną dolną (IVC) powyżej i poniżej miejsca ich połączenia odpowiednio z lewą tętnicą nerkową i żyłą nerkową, a następnie wypalić wszystkie odchodzące tętnice.
Zzacisnąć aortę nadnerkową zaciskiem mikrochirurgicznym (Micro Serrefines, Fine Science Tools, kat. nr 18055-04) powyżej lewej tętnicy nerkowej, jak najbliżej tętnicy krezkowej górnej. Podwiązać aortę podnerkową jedwabiem chirurgicznym (5-0, Vömel, art. nr 14739) około 5 mm poniżej lewej tętnicy nerkowej.
Podwiązać podnerkową IVC jedwabiem chirurgicznym (5-0, Vömel) i zacisnąć nadnerkową IVC zaciskiem mikrochirurgicznym (Micro Serrefines, Fine Science Tools, kat. nr 18055-03).
Przeciąć żyłę nerkową jak najbliżej IVC za pomocą precyzyjnych nożyczek (Iris Scissors - ToughCut Straight 11,5 cm, Fine Science Tools, kat. nr 14058-11).
Powoli przeprowadzić perfuzję nerki in situ przy użyciu 2 ml lodowatego roztworu perfuzyjnego HTK (CUSTODIOL HTK, Dr. Franz Köhler Chemie), wprowadzając kaniulę (Microlance 3 27G ¾, BD, kat. nr 302200) do aorty podnerkowej. Potwierdzić zmianę koloru nerki (na oliwkowy).
Najpierw przeciąć aortę nadnerkową, następnie aortę podnerkową i na koniec moczowód jak najbliżej pęcherza moczowego.
Usunąć nerkę wraz z naczyniami i moczowodem, a następnie przechowywać w roztworze perfuzyjnym HTK w lodzie.
Uśmiercić szczura dawcę poprzez zdjęcie zacisków naczyniowych i następujące po tym wycięcie serca w znieczuleniu.

2. Przygotowanie biorcy i transplantacja

Przygotować mikroskop stereotaktyczny i zapisać masę szczura.
Zanurzyć szczura biorcy (Lewis) w narkozie z użyciem izofluranu 4%. Utrzymywać znieczulenie, obniżając stężenie izofluranu do 2-2,5%.
Umieścić znieczulonego szczura na podkładce chirurgicznej. Przymocować kończyny szczura do podkładki za pomocą taśmy klejącej i nałożyć maść oftalmiczną na oczy zwierzęcia. Monitorować i kontrolować temperaturę głęboką ciała za pomocą rektalnego czujnika temperatury i podgrzewania. Podczas operacji regularnie kontrolować temperaturę, oddychanie oraz tętno zwierzęcia.
Ogolić i zdezynfekować brzuch, a następnie wykonać cięcie w linii środkowej brzucha od spojenia łonowego do tylnej krawędzi wątroby. Do rozcięcia skóry użyć skalpela, aby zminimalizować urazy tkankowe. Obnażyć lewą nerkę i jej naczynia, przesuwając jelita na prawą stronę.
Ostrożnie usunąć torebkę nerkową za pomocą pęsety Dumonta z zakrzywionym końcem i patyczków bawełnianych.
Zacisnąć lewą tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód w pobliżu wnęki nerki za pomocą dwóch podwiązań nicią chirurgiczną (Mersilene 4-0, Ethicon, kat. nr EH6732H). Wyciąć większą część nerki, pozostawiając jedynie wnękę nerki. Oczyścić powierzchnię cięcia patyczkami bawełnianymi i sprawdzić, czy nie występuje krwawienie. W razie potrzeby dodać kolejne podwiązanie.
Ostrożnie przeprowadzić tępe rozczepianie tkanek przez tkankę łączną pokrywającą aortę podnerkową i żyłę główną dolną po stronie tylnej, używając patyczków bawełnianych.
Oddzielić wszelkie widoczne nerwy od aorty podnerkowej i żyły głównej dolnej za pomocą pęsety Dumonta z zakrzywionym końcem.
Ostrożnie rozczepić warstwę tkanki łącznej między aortą podnerkową a żyłą główną dolną, tworząc dwa otwory o długości 2-4 mm: pierwszy poniżej odgałęzienia naczyń jąder, a drugi powyżej odgałęzienia naczyń biodrowo-lędźwiowych. Wypalić tętnice i żyły biodrowo-lędźwiowe znajdujące się pomiędzy tymi otworami.
Przeciągnąć pojedynczą nić chirurgiczną (Mersilene 0; Ethicon, kat. nr EH6665E) przez każdy z dwóch otworów. Używając tych nici, delikatnie odsunąć aortę podnerkową i żyłę główną dolną na prawą stronę zwierzęcia, aby uzyskać dostęp do naczyń odgałęziających się po stronie grzbietowej. Wypalić wszelkie naczynia między dwoma otworami, a następnie usunąć nici chirurgiczne.
Następnie zamknąć aortę i żyłę główną dolną (IVC) poprzez aplikację czterech zacisków mikrochirurgicznych (Micro Serrefines, Fine Science Tools, kat. nr 18055-04) zgodnie z ruchem wskazówek zegara, zaczynając od górnego otworu w aorcie i kończąc na żyle głównej w górnym otworze (Micro Serrefines, Fine Science Tools, kat. nr 18055-03).
Następnie ostrożnie przebić górny koniec wyizolowanej części aorty igłą (Microlance 3 27G ¾, BD, kat. nr 302200), wprowadzić dolne ostrze drobnych nożyczek sprężynowych (Vannas Spring Scissors - 3 mm Blades, Fine Science Tools, kat. nr 15000-00) przez otwór po nakłuciu i wykonać krótkie cięcie podłużne. Przepłukać wyizolowaną aortę lodowatym roztworem perfuzyjnym HTK, aby usunąć pozostałą krew.
Podobnie ostrożnie przebić igłą dolny koniec wyizolowanej części żyły głównej, wprowadzić dolne ostrze drobnych nożyczek sprężynowych przez otwór po nakłuciu i wykonać cięcie podłużne kończące się nieco poniżej cięcia aorty. Ponownie przepłukać naczynie, aby usunąć pozostałą krew.
Wyjąć przeszczep nerki z roztworu do przechowywania. Umieścić go poniżej poprzedniego położenia lewej nerki, upewniając się, że jest on prawidłowo zorientowany.
Sprawdzić orientację tętnicy nerkowej przeszczepu i upewnić się, że nie ma skręceń. Następnie nałożyć na przeszczep cienką gazik i zwilżyć go lodowatym roztworem perfuzyjnym HTK, aby go schłodzić i zapobiec wysychaniu.
Utrwalić otwór nadnerkowej części fragmentu aorty, do którego wpina się tętnica nerkowa przeszczepu, za pomocą nici chirurgicznej (Ethilon 9-0, Ethicon, kat. nr 2809G) – najpierw na górnym, a następnie na dolnym końcu nacięcia aorty. Zamknąć nacięcie zgodnie z ruchem wskazówek zegara szwem ciągłym przy użyciu nici chirurgicznej (Ethilon 9-0), pęsety Dumonta z zakrzywionym końcem i zakrzywionego needle holdera Castroviejo (Fine Science Tools, kat. nr 12061-01). Następnie przykryć pierwszy szew tkanką łączną za pomocą drugiego szwu ciągłego prowadzonego przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Teraz pozostała do zamknięcia jedynie dolna część fragmentu aorty przeszczepu. Regularnie chłodzić przeszczep lodowatym roztworem perfuzyjnym HTK.
Perfundować przeszczep 1 ml lodowatego roztworu perfuzyjnego HTK przez tępą igłę wprowadzoną do otwartego końca fragmentu aorty przeszczepu, aby sprawdzić szczelność i integralność szwu oraz usunąć pozostałą krew z przeszczepu. Następnie podwiązać otwarty koniec fragmentu aorty jedwabną nicią chirurgiczną (5-0, Vömel).
Sprawdzić orientację żyły nerkowej przeszczepu i upewnić się, że nie ma skręceń.
Utrwalić otwór żyły przeszczepu nicią chirurgiczną (Ethilon 9-0) – najpierw na górnym, a następnie na dolnym końcu nacięcia w żyle głównej. Zamknąć nacięcie zgodnie z ruchem wskazówek zegara szwem ciągłym przy użyciu nici chirurgicznej (Ethilon 9-0), pęsety Dumonta z zakrzywionym końcem i zakrzywionego needle holdera Castroviejo. Regularnie chłodzić przeszczep lodowatym roztworem perfuzyjnym HTK.
Zdjąć zaciski mikrochirurgiczne przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, zaczynając od najwyższego zacisku na żyle głównej. Po zdjęciu ostatniego zacisku aorty ostrożnie zatamować ewentualne niewielkie krwawienie patyczkami bawełnianymi. Po kilku sekundach przeszczep nabierze różowego koloru i powinny pojawić się skurcze moczowodu.
Aby wprowadzić moczowód przeszczepu do pęcherza biorcy, ostrożnie usunąć niewielki fragment mięśniówki na szczycie pęcherza za pomocą nożyczek sprężynowych Vannasa (Student Vannas Spring Scissor straight, Fine Science Tools, kat. nr 91500-09). Następnie usunąć tkankę otaczającą (głównie tłuszcz) z moczowodu przeszczepu za pomocą pęsety Dumonta z zakrzywionym końcem. W tym celu ostrożnie chwycić końcówkę moczowodu i delikatnie oddzielić od niej otaczający tłuszcz, tkankę łączną i wtopione naczynia, odciągając je w przeciwnym kierunku. Utrwalić końcówkę moczowodu na końcu nici chirurgicznej (Prolene 6-0, Ethicon, kat. nr 8697H) i przebić przygotowany wcześniej szczyt pęcherza dołączoną igłą. Przeciągnąć moczowód przez pęcherz i wyprowadzić go u podstawy poprzez drugą perforację.
Utrwalić wcześniej oddzieloną od moczowodu tkankę na szczycie pęcherza nicią chirurgiczną (Ethilon 9-0). Odciąć końcówkę moczowodu z dołączoną nicią chirurgiczną i wsunąć moczowód z powrotem do pęcherza, delikatnie pchając od dołu. Następnie zamknąć drugie nakłucie pęcherza nicią chirurgiczną (Ethilon 9-0).
Zamknąć ścianę brzucha i skórę dwoma ciągłymi, ale oddzielnymi szwami przy użyciu nici chirurgicznej (Mersilene 0). Zdezynfekować ranę Povidon-jodem i podawać buprenorfinę (0,1 mg na kg m.c./bid) s.c. przez trzy dni po operacji w celu kontrolowania bólu rany.

3. Obrazowanie odrzucania alloprzeszczepu

Zanestetyzować szczura (niebędącego na czczo) przy użyciu izofluranu 2-2,5%.
30 MBq FDG (30 MBq FDG w 0,1 ml 0,9% NaCl) podaje się dożylnie (i.v.) poprzez kaniulację bocznej żyły ogonowej przy użyciu kaniuli 24 G (Braun, Introcan, 4252500-01). Następnie przepłukać kaniulę 0,9 ml roztworu 0,9% NaCl.
Pozostawić szczura w stabilizatorze bez znieczulenia do momentu rozpoczęcia skanowania, nawadniając zwierzę poprzez dożylne wstrzykiwanie 1 ml roztworu 0,9% NaCl co godzinę.
Ponownie zanieczulić szczura izofluranem 2% bezpośrednio przed rozpoczęciem skanowania.
Umieścić zanieczulonego szczura w wysokorozdzielczej kamerze PET dla zwierząt opartej na wielodrutowej komorze quadHIDAC (Oxford Positron Systems Ltd, Oxford, UK). Rozdzielczość przestrzenna skanera PET wynosi 1,0 mm i jest stała w całym polu widzenia FOV (średnica 165 mm; długość osiowa 280 mm). Monitorować i kontrolować temperaturę ciała podczas skanowania za pomocą rektalnego czujnika temperatury oraz kontrolować znieczulenie za pomocą pulsoksymetru.
Rozpocząć akwizycję dynamiczną trwającą 60 min, zaczynając 180 min po wstrzyknięciu FDG, aby zmniejszyć akumulację znacznika w nerkach spowodowaną wydalaniem FDG drogą nerkową.
Podać dożylnie 5 MBq ¹⁸F-fluorku i wykonać kolejne skanowanie PET bezpośrednio po wstrzyknięciu ¹⁸F-fluorku przez 60 min, bez zmiany pozycji szczura w skanerze, w celu identyfikacji miąższu nerek i obliczenia klirensu ¹⁸F ⁵. Zrekonstruować obrazy z obu skanowań. Ręcznie wyznaczyć objętość zainteresowania (VOI) na zrekonstruowanych obrazach 2 min po wstrzyknięciu ¹⁸F-fluorku (faza perfuzji) wokół kory nerek i przenieść VOI na obrazy FDG. Starannie wykluczyć miedniczkę nerkową z VOI. Zrekonstruować obrazy z obu skanowań i ręcznie wyznaczyć objętość zainteresowania (VOI) wokół kory nerek. Dane w trybie list-mode zrekonstruowano w obrazy o rozmiarze voxela 0,4 × 0,4 × 0,4 mm³. Starannie wykluczyć miedniczkę nerkową z VOI.
Obliczyć pobranie FDG na podstawie stosunku całkowitej liczby zliczeń do objętości i wyznaczyć procent wstrzykniętej dawki (%ID). Do analizy obrazów wykorzystano oprogramowanie MATLAB (Version R2011b, MathWorks, Natick, MA, USA) oraz tomographic imaging (TIM) Version 2.8.