Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Podsumowanie

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.^1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Streszczenie

Ośrodkowy układ nerwowy pochodzi z płytki neuronalnej, która przechodzi serię złożonych ruchów morfogenetycznych prowadzących do powstania cewy neuronalnej w procesie zwanym neurulacją. Uważa się, że podczas neurulacji morfogeneza mezenchymy znajdującej się pod płytką neuronalną napędza unoszenie fałdów neuronalnych. Mezenchyma czaszki składa się z mezodermy paraksjalnej i komórek grzebienia neuronalnego. Komórki mezenchymy czaszki tworzą porowatą sieć złożoną z komórek o kształcie gwiaździstym oraz przeplatających się włókien macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które wspierają fałdy neuronalne. Podczas neurulacji mezenchyma czaszki przechodzi stereotypowe reorganizacje prowadzące do jej rozrostu; uważa się, że ruchy te stanowią siłę napędową unoszenia fałdów neuronalnych. Jednakże szlaki sygnałowe i zachowania komórkowe napędzające morfogenezę mezenchymy czaszki pozostają słabo zbadane. Interakcje między ECM a komórkami mezenchymy czaszki leżą u podstaw tych zachowań komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy prosty test z eksplantem ex vivo, opracowany w celu scharakteryzowania zachowania tych komórek. Test ten pozwala na zastosowanie manipulacji farmakologicznych w celu analizy zaangażowanych szlaków sygnałowych oraz obrazowania na żywo, aby dokładniej zbadać zachowanie tych komórek. Przedstawiamy reprezentatywny eksperyment wykazujący użyteczność tego testu w charakteryzacji właściwości migracyjnych mezenchymy czaszki na różnych komponentach ECM.

Wprowadzenie

Zamknięcie cewy nerwowej w regionie czaszkowym u zarodka myszy zachodzi między 8,5 (E8.5) a 9,5 dniem embrionalnym. Brak prawidłowego zamknięcia cewy nerwowej w obrębie głowy prowadzi do anencefalii, częstej strukturalnej wady wrodzonej u ludzi, która jest niekompatybilna z życiem. Siły napędzające zamknięcie cewy nerwowej w części głownej są generowane zarówno przez samą tkankę nerwową, jak i otaczający ją naskórek oraz mezenchymę³. W szczególności uważa się, że ekspansja mezenchymy czaszkowej jest niezbędna do uniesienia fałdów nerwowych czaszki^1,2. Mezenchyma czaszkowa jest bogata w białka ECM, zwłaszcza w białka glikozylowane, takie jak proteoglikany siarczanu heparanu, siarczany chondroityny i hialuronian^4-8.

W przeciwieństwie do zarodka kurczaka, w którym komórki grzebienia neuronalnego emigrują z grzbietowej części rurki neuralnej po jej zamknięciu, grzebień neuronalny w zarodku myszy migruje w tym samym czasie, w którym zaczynają unosić się fałdy neuralne (po stadium 5 somytów). Zatem podczas neurulacji w zarodku myszy mezenchyma czaszkowa składa się z komórek pochodzących z grzebienia neuronalnego oraz mezojarmy paraksjalnej. Populacje grzebienia neuronalnego i mezojarmy paraksjalnej są indukowane w różnych momentach rozwoju; są zlokalizowane w różnych miejscach zarodka i przekształcają się w różne struktury^9,10. Mezojarma paraksjalna pochodzi z prążka pierwotnego i migruje do przedniego regionu zarodka, aby znaleźć się pod domniemaną płytką neuralną. Grzebień neuronalny jest indukowany na styku płytki neuralnej i ektodermy epidermalnej, przechodzi przejście nabłonkowo-mezenchymalne i ulega delaminacji tuż przed uniesieniem fałda neuralnego w zarodku gryzonia. Komórki grzebienia neuronalnego migrują stereotypowymi drogami w podektodermalnej mezojarmie paraksjalnej do łuków skrzelowych oraz mezenchymy czołowo-nosowej i okołogałkowej. Mezojarma paraksjalna przyczyni się do powstania niektórych kości sklepienia czaszki i mięśni twarzy, podczas gdy grzebień neuronalny przyczyni się do powstania innych kości czaszki i twarzy, a także nerwów czaszkowych^9-11. Linie komórkowe mezojarmy paraksjalnej i grzebienia neuronalnego mogą być różnicowo znakowane odpowiednio za pomocą transgenicznych linii myszy Mesp1-cre oraz Wnt1-cre ⁹.

Kluczową rolę mezenchymy czaszkowej w zamykaniu rurki neuralnej wywnioskowano z eksperymentów, w których traktowanie embrionów gryzoni czynnikami zaburzającymi ECM, takimi jak hialuronidaza, chondroitynaz ABC, heparytinaza lub diazo-okso-norleucyna (DON), podczas neurulacji upośledzało zamykanie rurki neuralnej^7,12-14. W eksperymentach tych analiza histologiczna statycznych przekrojów po neurulacji ujawniła towarzyszącą dysmorfogenezę mezenchymy czaszkowej^7,12-14. Jednakże, ponieważ czynnik teratogenny miał dostęp do wielu tkanek, należy jeszcze ustalić, czy mezenchyma czaszkowa jest rzeczywiście tkanką docelową. Na wsparcie wniosku, że tkanka ta jest niezbędna dla neurulacji, wskazuje fakt, że w niektórych mutantach myszy z ekscencefalą mezenchyma czaszkowa wydaje się nieprawidłowa w analizach histologicznych^15-17. Niemniej jednak w większości przypadków wpływ mutacji na zachowanie komórkowe mezenchymy czaszkowej nie został zbadany.

Opracowaliśmy test z wycinkami ex vivo, aby bezpośrednio zbadać wpływ mutacji genetycznych lub manipulacji farmakologicznych na zachowanie komórek mezenchymy czaszkowej¹⁵. Test ten jest podobny do opisanego przez Tzahora et al w 2003 roku w celu oceny potencjału różnicowania mezenchymy czaszkowej leżącej pod rombomerami¹⁸, z tą różnicą, że zmodyfikowaliśmy sposób wycinania eksplantów, aby badać właściwości migracyjne populacji mezenchymy czaszkowej położonych bardziej przednio, pod przednią płytką neuronalną. Nasza metoda jest również modyfikacją testów z wycinkami przeprowadzanych na embrionach kurczaka w celu analizy zachowania migracyjnego grzebienia neuronalnego, z istotnymi różnicami. Wcześniejsze przygotowania obejmowały wycinanie grzebienia neuronalnego lub położonej bardziej tylnie mezodermy paraksjalnej^19,20. Ponadto, podczas unoszenia fałdów neuronalnych u embrionu kurczaka, grzebień neuronalny nie wyemigrował jeszcze z grzbietowej części rurki neuralnej, w związku z czym eksplanty pobrane z przedniej mezodermy paraksjalnej nie zawierałyby komórek grzebienia neuronalnego. W naszym teście przygotowuje się eksplanty mezenchymy czaszkowej składające się z mezodermy paraksjalnej, grzebienia neuronalnego i ektodermy powierzchniowej, a następnie wysiewa się je na podłożu. Można przeprowadzać manipulacje eksperymentalne, takie jak izolacja eksplantów od mutantów genetycznych, wysiewanie eksplantów na różne ECM lub stosowanie preparatów farmakologicznych. Komórki migrują z eksplantu, a dystans, liczba i zachowanie mogą być analizowane i porównywane pomiędzy grupami badawczymi. Dodatkowo, przygotowanie to nadaje się do analizy migracji komórkowej za pomocą technik obrazowania na żywo. Po eksperymencie migracyjnym eksplanty można utrwalić i poddać analizom immunohistochemicznym, aby dokładniej wyjaśnić efekt zastosowanych zabiegów. Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół jest prostym testem ex vivo do badania zachowania mezenchymy czaszkowej. Jako reprezentatywny eksperyment wykorzystujemy ten test do zbadania migracji mezenchymy czaszkowej na różnych podłożach zewnątrzkomórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie naczyń hodowlanych lub szkiełek podstawkowych powlekanych ECM

1. Przygotuj roztwór stokowy ECM, rozpuszczając podłoże ECM w PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Invitrogen, #14040-133). Przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 mm (VWR, #28145-495) i zamroź w alikwotach w temperaturze -80 °C.
2. Rozcieńcz roztwór stokowy ECM w PBS do pożądanego stężenia. W przypadku MaxGel rozcieńcz w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, #11995-065).
3. Jeśli planowane jest wykonanie immunofluorescencji, wysterylizuj okrągłe szklane szkiełka nakrywki o średnicy 12 mm (VWR, #89015-724), zanurzając je w etanolu, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Czynność tę należy przeprowadzić w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Jeśli immunofluorescencja nie będzie wykonywana, przejdź do kroku 1.5.
4. Umieść wysterylizowane szkiełka nakrywki w każdym dołku płytki 24-dołkowej (Corning, #3526).
5. Dodaj 0,5 ml rozcieńczonego roztworu podłoża do każdego dołka płytki 24-dołkowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 hr.
6. Odsącz roztwór ECM i przemyj trzy razy w PBS.
7. Odsącz PBS i użyj natychmiast lub owiń parafilmem i przechowuj w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

2. Przygotowanie narzędzi do sekcji

Płytki Sylgard z dodatkiem węgla aktywnego przygotowuje się zgodnie z protokołem producenta. Odporne czarne tło tych płytek umożliwia stabilne przypięcie zarodka, a kolor zapewnia dobry kontrast, co ułatwia wizualizację przezroczystego zarodka.

1. Aby przygotować płytki, odważyć bezpośrednio do zlewki trójwylewowej na wadze 150 g cieczy Część A, 15 g cieczy Część B oraz 1 g proszku węglowego (World Precision Instruments, #SYLG184). Wymieszać całość za pomocą drewnianego patyczka lub depresora języka. Prelać do szklanych lub plastikowych szalek o średnicy 100 cm. Użyć małego palnika butanowego trzymanego w odległości około 10–12 cali nad szalkami, aby wypalić pęcherzyki powietrza. Przykryć płytki pokrywkami i pozostawić na co najmniej 24 hr do stężenia.
2. Aby przygotować narzędzia do sekcji, wsunąć szpilkę Minutien (średnica 0.1 mm) do uchwytu na szpilki (odpowiednio Fine Scientific Tools, #26002-10 i #26018-17); alternatywnie jako narzędzia sekcyjne można wykorzystać igły 26 G (BD, # 309597) zgięte pod kątem prostym przy pomocy pęsety. Naostrzyć pęsetę Student Dumont #5 (Fine Science Tools, #91150-20) za pomocą kamienia ostrzącego (Fine Scientific Tools, #29008-22).
3. Przed użyciem wysterylizować wszystkie narzędzia do sekcji 70% etanolem.

3. Pobieranie zarodków

1. Eutanazyjnie uśmierć mysz w 8,5 dniu po kopulacji zgodnie z regulacjami komisji ds. wykorzystania zwierząt i wyjmij macicę.
2. Umieść macicę w plastikowej szalce Petri z jałowym PBS.
3. Przepłucz macicę raz jałowym PBS.
4. Pod mikroskopem sekcyjnym ostrożnie wyjmij zarodek z decidua za pomocą pęsety.
5. Usuń błony pozazarodkowe i zachowaj je do genotypowania, jeśli jest to konieczne.
6. Określ stadium rozwoju zarodka poprzez policzenie somytów. Idealne stadia do przygotowania eksplantów w celu analizy zachowania komórek podczas unoszenia fałdów neuronalnych to stadia między 6 a 10 somytami, kiedy fałdy neuronalne dopiero zaczynają się unosić, a przed wystąpieniem głównej morfogenezy mezenchymy czaszkowej.
7. Przepłucz zarodek w PBS. Umieść go w czarnej płytce sylgard z DMEM niezawierającym czerwieni fenolowej (Invitrogen, #21063-029). Usuń błony pozazarodkowe i zachowaj je do genotypowania, jeśli jest to konieczne.

4. Przygotowanie eksplantatów

1. Ponownie ustaw ostrość mikroskopu przy najwyższym możliwym powiększeniu nad obszarem głowy zarodka.
2. Wykonaj nacięcia za pomocą igieł sekcyjnych trzymanych w obu dłoniach. Użyj jednej igły do unieruchomienia tkanki, a drugiej do wykonywania nacięć.
3. Odcię głowę zarodka przednio od rombomerów.
4. Wykonaj nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej, aby podzielić głowę na dwie równe połowy.
5. Wykonaj nacięcia wokół zewnętrznych krawędzi głowy oraz wzdłuż linii pośrodkowej. Nacięcia te usuną przedmigracyjną grzebień i ektodermę powierzchniową na zewnętrznej granicy oraz płytkę przedstrunową w linii pośrodkowej. Pozostała tkanka będzie stanowiła eksplant i będzie zawierać migrującą czaszkową grzebień neuralną, mezodermę paraksjalną oraz ektodermę powierzchniową.
6. W miarę wycinania tkanki usuwaj resztki z naczynia za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Zapobiegnie to pomyleniu eksplantu z odpadami sekcyjnymi.
7. Delikatnie wypłucz eksplant, pipetując go w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety 20 μl i pipety automatycznej. Usunie to słabo przylegające komórki i zapobiegnie powstawaniu poszarpanych krawędzi eksplantów.
8. Ostrocznie pobierz każdy eksplant w około 10 μl cieczy, używając końcówki do pipety 20 μl i pipety automatycznej, a następnie umieść go w centrum powleczonej studni hodowlanej.
9. Dodaj 20 μl pożywki hodowlanej uzupełnionej o 15% FBS, aby przykryć eksplant.
10. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek z nawilżaniem (5% CO₂, 37 °C) na 1-2 h, aby umożliwić przytwierdzenie się eksplantu do dna naczynia. Sprawdzaj okresowo, czy eksplant nie wysycha.
11. Po przytwierdzeniu się eksplantu ostrożnie dodaj do każdej studni 250 μl DMEM uzupełnionego o 10% FBS, podgrzanego do 37 °C w łaźni wodnej. Po przytwierdzeniu eksplanty nie będą się przemieszczać podczas delikatnego potrząsania płytką pod mikroskopem.
12. Wróć naczynie do inkubatora do hodowli tkanek.
13. Po 24 h eksplanty będą mocno przytwierdzone, a komórki zaczną emigrować. W tym momencie do pożywki można dodać odczynniki farmakologiczne.
14. 48 h po wysianiu komórki wymigrują z eksplantów. Odległość migracji można zwizualizować i utrwalić na obrazach. Zazwyczaj kończymy hodowlę na tym etapie, ponieważ przy dłuższej inkubacji eksplanty zaczynają wykazywać oznaki zmniejszonej żywotności. Do sprawdzenia żywotności eksplantu można również użyć barwnika witalnego, takiego jak pomarańcz akrydynowy lub błękit trypanu.
15. Na tym etapie można wykonać zdjęcia w celu udokumentowania odległości oraz liczby komórek migrujących z eksplantu. Alternatywnie, jeśli eksplanty zostały wysiane na szkiełkach podstawkowych, można je utrwalić i przeprowadzić analizy immunohistochemiczne w celu wizualizacji wybranych białek.

Kluczowe etapy protokołu

1. Wytnij eksplanty o zbliżonej wielkości.
2. Podczas preparowania usuwaj wszystkie resztki tkanek z płytki sekcyjnej, aby uniknąć pomylenia ich z pożądaną tkanką eksplantu.
3. Podczas osadzania eksplantów w dołkach lub na szkiełkach nakrywkowych należy umieścić kroplę pożywki wraz z eksplantem w centrum dołka.
4. Pozostaw eksplant na czas wystarczający do przytwierdzenia przed całkowitym wypełnieniem dołka pożywką.
5. Warunki traktowania powinny być ustandaryzowane dla każdego użytego podłoża testowego i środka farmakologicznego.
6. Z każdego embrionu można przygotować dwa eksplanty (jeden z lewej i jeden z prawej strony rurki neuralnej).
7. Podczas badania migracji komórek z mutantowych linii myszy w różnych warunkach eksperymentalnych, jeden eksplant mutantowy należy umieścić w grupie kontrolnej, a drugi w grupie traktowanej.

Rozwiązywanie problemów

1. Jeśli eksplanty nie przytwierdzają się do podłoża, należy wydłużyć czas przeznaczony na adhezję. W naszym doświadczeniu około połowa eksplantów nie przytwierdza się, przy czym większe eksplanty przylegają bardziej efektywnie.
2. Jeśli eksplanty przytwierdzą się do obrzeży dołka, ich obrazowanie będzie utrudnione. Należy upewnić się, że eksplanty są umieszczone w centrum dołka.
3. W idealnym przypadku eksplanty powinny mieć zbliżoną wielkość. Ewentualne różnice w rozmiarze eksplantów można jednak skorygować, przyjmując ich średnicę jako czynnik korekcyjny podczas ilościowego oznaczania migracji komórek z eksplantów.
4. W przypadku wystąpienia kontaminacji należy upewnić się, że zachowano sterylne warunki pracy. Wszystkie narzędzia i powierzchnie robocze powinny zostać wysterylizowane 70% etanolem. Pipety i szalki Petriego powinny być nowe i sterylne.
5. Jeśli eksplanty giną podczas sekcji, należy okresowo usuwać resztki tkankowe, aby zapobiec utracie eksplantu.
6. Opanowanie techniki sekcji jest czasochłonne i wymaga praktyki. Pomocne jest zastosowanie optymalnego powiększenia, ostrych narzędzi sekcyjnych oraz igieł.

Wyniki

Wygląd komórek migrujących z eksplantów mezenchymy czaszki przedstawiono na Rysunku 2. Badano migrację na różnych podłożach ECM obecnych w mezenchymie czaszki podczas neurulacji, w tym na fibronektynie (100 mg/ml; Sigma #F1141), lamininie (100 mg/ml; Sigma #L2020), MaxGel ECM (rozcieńczenie 1:500 w DMEM; Sigma #E0282) oraz kwasie hialuronowym (1 mg/ml; Sigma, # 53747). Komórki nie migrują z eksplantu w przypadku braku ECM (dane nie zostały przedstawione), natomiast wszystkie testowane podłoża wspierały migrację komórek. Zarówno kształt, jak i wielkość komórek migrujących z eksplantów zależą od podłoża. Jest to spodziewane, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że siły mechaniczne generowane przez interakcję komórek z różnymi ECM wpływają zarówno na kształt, jak i właściwości migracyjne komórek²¹.

Rycina 1. Przygotowanie eksplantów. (A) W celu przygotowania eksplantów zarodki w stadium E8.5 są wycinane z decidua i tkanek pozazarodkowych. (B) Głowy zarodków są oddzielane od ciała przed rombomerami. Eksplanty przygotowuje się poprzez usunięcie tkanki z linii pośrodkowej oraz z zewnętrznych krawędzi głowy, aby usunąć odpowiednio płytkę przedstrunową w linii pośrodkowej oraz premigracyjną grzebień neuronalny i ektodermę powierzchniową na obwodzie. (C) Eksplanty przygotowuje się poprzez odcięcie tkanki z linii pośrodkowej i zewnętrznych krawędzi głowy, aby usunąć płytkę przedstrunową w linii pośrodkowej oraz premigracyjną grzebień neuronalny i ektodermę powierzchniową na obwodzie. (D) Eksplanty umieszcza się w małej objętości pożywki na naczyniach/szkiełkach podstawkowych pokrytych ECM i pozostawia do przyczepienia przed dodaniem większej ilości pożywki.

Rysunek 2. Migracja komórek mezenchymy czaszki z eksplantów wysianych na różnych podłożach. Eksplanty wysiano na fibronektynę, lamininę, MaxGel ECM lub kwas hialuronowy i sfotografowano po 48 hr hodowli. Pasek skali = 200 mm.

Dyskusja

Zastosowana tutaj metoda stanowi potężne narzędzie analityczne do badania zachowania komórek mezenchymy czaszki. Oprócz przedstawionych tutaj analiz statycznych, do badania zachowania komórek w czasie rzeczywistym podczas ich migracji z eksplantu można wykorzystać eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek w jasnym polu lub w połączeniu z ekspresją białek znakowanych GFP. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek, eksplanty można znakować DiI, a w celu odróżnienia migracji grzebienia neuronalnego od mezodermy paraksjalnej można wykorzystać linie ROSA-YFP;Mesp1-cre, ROSA-YFP;Wnt1-cre lub inne linie transgeniczne. Wykorzystując ten test z eksplantami można również badać oddziaływania między mezenchymą czaszki a ECM. W niniejszej pracy wysiewamy eksplanty na różne podłoża ECM występujące w mezenchymie czaszki, aby wykazać, że komórki migrują po nich w różnym stopniu oraz że ECM wpływa na morfologię komórek. Ponadto eksplanty można osadzić w macierzy trójwymiarowej, aby ocenić zachowanie komórek w takim kontekście. Ten test z eksplantami nadaje się do analizy wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na zachowanie mezenchymy czaszki w celu analizy sygnałów wewnętrznych i zewnętrznych, które mogą regulować i modyfikować migrację. Na przykład wykorzystaliśmy ten test w naszych badaniach, aby rozpoznać rolę nadmiernej sekrecji Hsp90 w nieprawidłowym zachowaniu komórkowym w mezenchymie czaszki mutantów Hectd1¹⁵. W tych eksperymentach traktowaliśmy eksplanty przeciwciałem anty-Hsp90, białkiem Hsp90, geldanamycyną oraz DMA (dimetyloamelorydem), aby zablokować sekrecję Hsp90 i wykazać, że nieprawidłowe zachowanie komórek mutantów Hectd1 wynika z nadmiaru zewnątrzkomórkowego Hsp90¹⁵. Podobne podejścia można zastosować do farmakologicznej analizy dodatkowych szlaków leżących u podstaw prawidłowej lub nieprawidłowej morfogenezy mezenchymy czaszki. Po zakończeniu testu eksplanty i migrujące komórki można analizować za pomocą szeregu metod. Na przykład analizy immunohistochemiczne mogą zostać wykorzystane do badania lokalizacji białek kluczowych dla ruchów komórkowych. Można również zastosować analizy transkryptomu, aby określić, w jaki sposób poszczególne zabiegi wpływają na ekspresję genów.

Istotnym ograniczeniem tej techniki jest fakt, że nie modeluje ona zachowań w trzech wymiarach w taki sposób, w jaki występują one in vivo. Aby rozwiązać ten problem, można by zastosować modyfikację protokołu, w której eksplantaty są osadzane w macierzy trójwymiarowej (np. matrigel) wraz z ekspresją komórkowych przedziałów znakowanych białkiem fluorescencyjnym. Nawet po wprowadzeniu tych modyfikacji konieczne byłyby dalsze eksperymenty w celu skorelowania zachowań obserwowanych w tym teście ex vivo z tymi występującymi in vivo. Inne ograniczenia obejmują konieczność wykorzystania dużej liczby embrionów w celu uzyskania wystarczającej ilości danych do wykazania istotności statystycznej. Co najważniejsze, choć sama sekcja jest stosunkowo prosta, opanowanie jej wymaga praktyki.