Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Podsumowanie

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Streszczenie

Modyfikacja cząsteczek wirusowych przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na ogromny potencjał w zakresie wpływu na terapię genową, zastosowania onkolityczne oraz rozwój szczepionek.^1,2,3 Obecne podejścia do modyfikacji powierzchni wirusowych, oparte głównie na metodach genetycznych, często wiążą się z osłabieniem produkcji wirusa, jego zakaźności oraz transdukcji komórkowej.^4,5 Wykorzystując chemoselektywną chemię klik, opracowaliśmy prostą, alternatywną metodę, która pozwala uniknąć tych problemów, pozostając jednocześnie wysoce elastyczną i dostępną.^1,2

Celem niniejszego protokołu jest wykazanie skuteczności zastosowania bioortogonalnej chemii klik w celu modyfikacji powierzchni cząsteczek adenowirusa typu 5. Ten dwuetapowy proces może być wykorzystywany zarówno terapeutycznie¹, jak i analitycznie,^2,6 ponieważ umożliwia chemoselektywne wiązanie cząsteczek ukierunkowanych, barwników lub innych interesujących cząsteczek z białkami uprzednio znakowanymi tagami azydowymi. Trzema głównymi zaletami tej metody są: (1) znakowanie metaboliczne wykazuje niewielki lub żaden wpływ na sprawność wirusa,^1,7 (2) można wykorzystać szeroką gamę ligandów efektorowych oraz (3) jest ona niezwykle szybka, niezawodna i łatwa do zastosowania.^1,2,7

W pierwszym etapie tej procedury produkuje się cząsteczki adenowirusa zawierające azydohomoalaninę (Aha, zamiennik metioniny) lub nienaturalny cukier O-związaną N-azydoacetyloglukozaminę (O-GlcNAz), z których oba zawierają grupę funkcyjną azydową (-N₃). Po oczyszczeniu zmodyfikowanych azydowo cząsteczek wirusa, sonda alkinowa zawierająca fluorescencyjny fragment TAMRA jest ligowana w sposób chemoselektywny do uprzednio oznakowanych białek lub glikoprotein. Na koniec przeprowadzana jest analiza SDS-PAGE, aby wykazać pomyślną ligację sondy do białek kapsydu wirusowego. Wykazano, że inkorporacja Aha prowadzi do oznakowania wszystkich białek kapsydu wirusowego (heksonu, pentonu i włókna), podczas gdy inkorporacja O-GlcNAz skutkuje oznakowaniem wyłącznie włókna.

W tej rozwijającej się dziedzinie pomyślnie opracowano wiele metod ligacji azydkowo-alkinowej; jednak w niniejszym materiale zaprezentowano jedynie dwie z nich, które uznaliśmy za najwygodniejsze – cykloaddycję azydkowo-alkinową promowaną naprężeniem (SPAAC) oraz cykloaddycję azydkowo-alkinową katalizowaną miedzią (CuAAC) w atmosferze beztlenowej.

Protokół

Przygotowanie wszystkich mediów, buforów i roztworów wymienionych w niniejszym protokole przedstawiono w Tabeli 1.

1. Produkcja adenowirusa znakowanego Aha

1. Przygotować jedenaście 100-mm naczyń hodowlanych z ludzkimi komórkami embrionalnej nerki (HEK 293) utrzymywanymi w pożywce wzrostowej dla komórek HEK 293 (patrz Tabela 1) w temperaturze 37 °C, aż osiągną 80 - 90% konfluencji. (Uwaga: Kultury o konfluencji powyżej 90% mogą być trudne do zainfekowania i mogą nie produkować wirusów w pożądany sposób.)
2. Odczepić komórki w jednym z naczyń, najpierw usuwając pożywkę wzrostową, płucząc raz 5 ml buforu TD, a następnie inkubując komórki przez jedną minutę w 1 ml trypsyny-EDTA (1×).
3. Dodać 9 ml pożywki wzrostowej dla komórek HEK 293 i za pomocą hemocytometru policzyć liczbę zebranych komórek HEK 293 z tego naczynia. Wykorzystać tę liczbę do obliczenia ilości adenowirusa typu 5 (Ad5) wymaganego do infekcji, stosując wartość multiplicity of infection (MOI) równą 10 PFU / komórkę. Należy uwzględnić fakt, że dla standardowego Ad5 indeks infekcyjności (stosunek cząstek zakaźnych do całkowitej liczby cząstek) wynosi zazwyczaj 1:20.
4. Przygotować 10 ml buforu do infekcji.
5. Powoli usunąć pożywkę wzrostową dla komórek HEK 293 z dziesięciu pozostałych naczyń hodowlanych, a następnie przemyć je 5 ml buforu TD. Dodać 1 ml buforu do infekcji do każdego naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h. W czasie infekcji delikatnie kołysać każdym naczyniem hodowlanym z boku na bok w odstępach 15-minutowych.
6. Po infekcji dodać 9 ml świeżej pożywki wzrostowej dla komórek HEK 293 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 h.
7. Przygotować 100 ml pożywki do znakowania Aha (lub pożywki kontrolnej z Met dla próby kontrolnej). Przed przygotowaniem pożywek do znakowania należy przefiltrować skoncentrowane roztwory zapasowe za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2-μm.
8. Po 18 h ostrożnie (tak, aby nie wypłukać zainfekowanych komórek) usunąć pożywkę wzrostową dla komórek HEK 293 i przemyć każde naczynie hodowlane 5 ml buforu TD.
9. Usunąć roztwór płuczący bufor TD i dodać 10 ml pożywki do znakowania Aha do każdego naczynia hodowlanego. W przypadku próby kontrolnej na tym etapie zamiast pożywki do znakowania Aha należy użyć pożywki kontrolnej z metioniną.
10. Inkubować zainfekowane komórki w pożywce do znakowania w temperaturze 37 °C przez 6 h. Znakowanie można przeprowadzić w dowolnym czasie od 12 do 24 h po infekcji, jednak jego czas trwania nie powinien przekraczać 6 h. Przedział ten został ustalony w celu maksymalizacji nakładania się procesu z translacją wirusowych białek strukturalnych, przy jednoczesnym zapewnieniu, że zakaźność nie zostanie znacząco obniżona. ⁷
11. Ostrożnie usunąć pożywkę do znakowania, aby nie uszkodzić komórek. Dodać 10 ml świeżej pożywki wzrostowej dla komórek HEK 293 do każdego naczynia i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 18 h. Aby zminimalizować utratę zainfekowanych komórek podczas tego etapu, nie ma konieczności całkowitego usuwania roztworu do znakowania. Pożywka wzrostowa dla komórek HEK 293 zawiera nadmiar Met, który wyprze wszelkie resztki Aha.
12. Przejść do kroku 3 w celu przeprowadzenia oczyszczania.

2. Produkcja adenowirusa znakowanego azydocukrem

1. Należy postępować zgodnie z procedurą zatytułowaną Production of Aha-Labeled Adenovirus aż do kroku 1.5 włącznie.
2. Przygotować 100 ml pożywki do znakowania cukrami azydowymi.
3. Przykryć komórki 10 ml świeżej pożywki do znakowania cukrami azydowymi i inkubować w temperaturze 37 °C przez 44 hr.

3. Oczyszczanie cząsteczek adenowirusowych znakowanych azotkiem

1. Usunąć pożywkę wraz z zainfekowanymi komórkami z każdej szalki hodowlanej i przenieść do probówek stożkowych. Wirować przy 2 000 g przez 10 min w 4 °C. Odpić supernatant i resuspendować osad w buforze TD (stosując 8 ml buforu TD na 10 szalek).
2. Zlizować zainfekowane komórki poprzez powtarzanie (3 lub więcej) cykli zamrażania i rozmrażania, używając naczynia Dewar z ciekłym azotem oraz łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wirować przy 2 000 g przez 10 min w 4 °C, aby oddzielić szczątki komórkowe od supernatantu.
3. Przygotować probówkę do wirowania z gradientem gęstości CsCl, najpierw pipetując 2,5 ml roztworu CsCl o gęstości 1,25 g/ml do probówki Ultra Clear. Następnie, używając pipety z końcówką umieszczoną na dnie probówki, powoli dodać 2,0 ml roztworu CsCl o gęstości 1,4 g/ml, uważając, aby nie zaburzyć granicy faz gradientu.
4. Pipetować supernatant z kroku 3.2 na wierzch probówki z gradientem gęstości CsCl i w razie potrzeby dodać bufor TD, aby wypełnić probówkę. Wirować próbki w rotorze z koszykami przy 125 000 g przez 1 h w 15 °C w ultrawirowarce.
5. Po zakończeniu ultrawirowania cząsteczki wirusa powinny być widoczne jako gęsty biały prążek na granicy dwóch roztworów CsCl. Wykonać niewielką perforację na dnie probówki za pomocą sterylnej igły, aby umożliwić powolne, kroplowe spływanie roztworu.
6. Zebrać gęsty biały prążek, który powinien zawierać znakowane cząsteczki Ad5, uważając, aby nie pobrać nadmiaru roztworu CsCl. Unikać zbierania białek komórkowych, które tworzą prążek powyżej warstwy wirusa. Należy również wykluczyć puste kapsydy wirionów, które tworzą jaśniejszą warstwę nieco powyżej gęstego białego prążka wirusa.
7. Opcjonalnie przeprowadzić końcowe oczyszczanie znakowanych cząsteczek Ad5. Przenieść zebraną frakcję z kroku 3.6 do 4-ml probówki do ultrawirowarki i wypełnić probówkę roztworem CsCl o gęstości 1,35 g/ml. Wirować przy 125 000 g przez 18 h w 15 °C i zebrać gęsty biały prążek formujący się w środku probówki, zgodnie z opisem w krokach 3.5 i 3.6. (Należy pamiętać, że jeśli miano wirusa jest niskie, po drugim wirowaniu biały prążek może być niewidoczny, co uniemożliwi odzysk znakowanego wirusa).
8. W celu długoterminowego przechowywania cząsteczek wirusa należy przeprowadzić dializę zebranego ekstraktu wirusowego przeciwko buforowi do przechowywania wirusów. Próbki dializowanego wirusa przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Ligacja zmodyfikowanych cząsteczek adenowirusowych z sondami alkinowymi przy użyciu naprężeniowej cykloaddycji azydowo-alkinowej (SPAAC)

1. Do roztworu 50 μl zmodyfikowanego azydą Ad5 w buforze do przechowywania wirusa dodać 0,25 μl roztworu znakującego SPAAC. (Listę dostawców komercyjnie dostępnych naprężonych alkinów znajduje się w tabeli odczynników).
2. Pozostawić reakcję cykloaddycji promowanej naprężeniem na noc w temperaturze pokojowej. W przypadku zastosowania sondy światłoczułej (np. TAMRA) naczynie reakcyjne należy owinąć folią aluminiową.
3. Oczyścić znakowany wirus zgodnie z krokiem 6.

5. Ligacja zmodyfikowanych cząsteczek adenowirusowych z sondami alkinowymi z wykorzystaniem miedziowej (I) katalizowanej cykloaddycji azydkowo-alkinowej (CuAAC) w atmosferze beztlenowej

1. Umieść 7,2 mg proszku bromku miedzi(I) (CuBr) w probówce Eppendorfa, osłoniętej folią aluminiową.
2. Odmierz pipetą 1 ml DMSO do drugiej probówki Eppendorfa.
3. Przygotuj 50 μl roztworu znakującego CuAAC w trzeciej probówce Eppendorfa. Osłoń ją folią aluminiową, jeśli sonda alkiniowa jest światłoczuła (np. TAMRA-Alkyne).
4. Umieść trzy niezakorkowane probówki Eppendorfa w beztlenowym worku rękawicowym na 6 h. Wszystkie próbki powinny pozostać w worku rękawicowym do zakończenia reakcji CuAAC.
5. Przygotuj 50× roztwór zapasowy CuBr, dodając 1 ml DMSO do 7,2 mg proszku CuBr, przy czym oba składniki zostały odtlenione zgodnie z krokiem 5.4.
6. Zainicjuj reakcję CuAAC, dodając pipetą 1 μl tego roztworu zapasowego CuBr do 50 μl roztworu znakującego CuAAC, który został odtleniony zgodnie z krokiem 5.4. Pozostaw reakcję na 12 h wewnątrz worka rękawicowego.
7. Oczyść znakowany wirus zgodnie z krokiem 6.

6. Oczyszczanie i przechowywanie znakowanych cząsteczek wirusa

1. Oczyszczone znakowane próbki wirusa należy poddać filtracji żelowej przy użyciu kolumn wirówkowych Centri-Sep równoważonych buforem do przechowywania wirusów (Virus Storage Buffer), zgodnie z wytycznymi producenta.
2. Alternatywnie oczyszczanie można przeprowadzić poprzez dializę przeciwko buforowi do przechowywania wirusów (Virus Storage Buffer).
3. Znakowane cząsteczki wirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. SDS-PAGE znakowanego adenowirusa i fluorescencyjne skanowanie żelu

1. Do 20 μl oczyszczonego znakowanego wirusa dodać 20 μl buforu do próbek Laemmli (2×) i gotować przez 10 min. Próbki odwirować przez 30 s, aby usunąć wszelkie nierozpuszczalne osady. Jeśli po oczyszczaniu obecna jest resztkowa miedź, gotowanie próbki może spowodować powstanie grubych smug białek na żelu SDS-PAGE, co utrudni wizualizację. W takim przypadku należy zrezygnować z gotowania próbki na tym etapie.
2. Kasetę z żelem zamocować w komorze do elektroforezy i dodać bufor do elektroforezy. Do odpowiedniej liczby studzienek nanieść próbki białek wirusowych. W jednej studziance nanieść wstępnie zabarwione markery masy cząsteczkowej. Elektroforezę prowadzić przez 1 h przy napięciu 200 V. Przez cały czas komorę do elektroforezy należy przykryć folią aluminiową, aby ograniczyć fotobielenie znacznika fluorochromowego.
3. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość i usunąć cały wolny fluorochrom, należy pozwolić barwnikowi śledzącemu wyjść poza żel podczas elektroforezy. Zatrzymać elektroforezę i szybko przenieść żel do fluorescencyjnego skanera żeli, a następnie zeskanować żel w celu pomiaru emisji fluorescencji przy odpowiedniej długości fali (574 nm dla TAMRA).
4. Liczbę cząsteczek barwnika sprzęgniętych z każdą cząsteczką wirusa można określić ilościowo, mierząc fluorescencję kilku standardowych stężeń TAMRA i porównując wyniki z próbką z kroku 7.3.

8. Reprezentatywne wyniki

Wyniki SDS-PAGE oraz fluorescencyjnego skanowania żelu dla Ad5 sprzężonego z TAMRA przedstawiono na Rysunku 3. Chociaż te fluorescencyjne skany żelu wykonano na próbkach zmodyfikowanych za pomocą CuAAC, wyniki powinny być porównywalne w przypadku ligacji sond za pomocą SPAAC. Skany żelowe wskazują, że znakowanie Aha prowadzi do modyfikacji trzech białek kapsydu Ad5 (heksonu, pentonu i włókna), podczas gdy znakowanie cukrem modyfikuje jedynie białko włókna kapsydu. Ponadto zwiększenie stężenia Aha (4 mM vs. 32 mM) skutkuje większym stopniem inkorporacji Aha, ale wykazano również, że zmniejsza ono zakaźność. Wcześniejsze wyniki⁷ wskazują, że dla Ad5 produkowanego w 4 mM Aha, około 5% odsłoniętych miejsc metioninowych jest zmodyfikowanych TAMRA, a liczba ta wzrasta do 10% przy zastosowaniu 32 mM Aha. Odpowiada to odpowiednio około 280 i 510 miejscom znakowanym barwnikiem na cząsteczkę Ad5. Analiza znakowania cukrem¹ wykazała, że około 22 z 36 miejsc glikozylacji w Ad5 jest zajętych przez cukier azydowy, a następnie znakowanych TAMRA.

Jeśli do produkcji Ad5 modyfikowanego azydkowo zgodnie z opisem w niniejszym protokole wykorzystano dziesięć płytek do hodowli tkanek, z białego paska zebranego w kroku 3.6 powinno uzyskać się 200 - 300 μl wirusa modyfikowanego azydkowo o mianie około 1,5 × 10¹² cząsteczek / ml. Częstym problemem w tej procedurze jest brak paska wirusowego na tym etapie oczyszczania, co może wynikać z niskiego miana wirusa. Jest to zazwyczaj następstwem zakażenia komórek o zbyt wysokim lub zbyt niskim stopniu konfluencji lub wypłukania komórek – które poluzowują się od płytki po zakażeniu – podczas płukania w kroku 1.

Rysunek 1. Przegląd protokołu. W pierwszej kolejności do cząstek adenowirusa wbudowywany jest zawierający azyd Aha lub GalNAz. Następnie, za pomocą chemii „klik”, przeprowadzana jest ligacja z fluorescencyjną sondą alkiniową. Na koniec wykorzystuje się SDS-PAGE, aby wykazać ligację sondy fluorescencyjnej.

Rysunek 2. Ligacja sondy alkinowej do wirusa modyfikowanego azydkiem poprzez (a) SPAAC, (b) CuAAC w atmosferze beztlenowej oraz (c) w atmosferze utleniającej.

Rycina 3. Skanowanie fluorescencyjne żelu SDS-PAGE adenowirusa typu 5 (Ad5) znakowanego azydkami po koniugacji CuAAC z TAMRA-Alkinem. (a) Ad5 znakowany Aha, z zastosowaniem dwóch stężeń Aha. Znakowanie wydaje się zachodzić na białkach kapsydu adenowirusa: heksonie, pentonie i włóknie (Fiber), przy czym zakres znakowania zwiększa się wraz ze wzrostem stężenia Aha. (b) Adenowirus znakowany Ac₄GalNAz wydaje się być znakowany wyłącznie na białku kapsydu Fiber.

Roztwór	Przygotowanie	Uwagi
Bufor do przechowywania Ad5	Bufor Tris-HCl 5 mM (pH 8,0) zawierający 0,5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolu i 0,05% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Przechowywać w -20 °C
Bufor do infekcji Ad5	2% (v/v) surowicy cielęcej, 1× roztwór TC, Ad5 w buforze do przechowywania (objętość wyznaczona przy użyciu MOI wynoszącego 10 PFU / komórkę i indeksu infekcyjności 1:20). Dopełnić roztwór do objętości końcowej za pomocą buforu TD	Stężenie Ad5 można wyznaczyć za pomocą absorbancji UV.
Roztwór TC (200×)	136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2	Przechowywać w 4 °C
Bufor TD	137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na2HPO4 oraz 25 mM Tris-HCl, pH 7,5	Przechowywać w 4 °C
Pożywka do wzrostu komórek HEK 293	Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) uzupełnione o 10% (v/v) surowicy cielęcej (BCS) i 1% (v/v) Pen Strep	Przechowywać w 4 °C
Roztwór stokowy Cys (100×)	DMEM (-Met / -Cys) uzupełnione o 200 mM L-cysteiny	Przygotować na świeżo i przefiltrować za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 µm przed użyciem.
Roztwór stokowy Aha (25×)	DMEM (-Met / -Cys) uzupełnione o 100 mM L-azydohomoalaniny	Przygotować na świeżo i przefiltrować za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 µm przed użyciem.
Pożywka do znakowania Aha	DMEM (-Met / -Cys) uzupełnione o 10% BCS, roztwór stokowy Aha (1×), 2 mM L-cysteiny	Przygotować na świeżo przed użyciem. Odpowiada to stężeniu Aha wynoszącemu 4 mM, choć można stosować inne stężenia (patrz Reprezentatywne wyniki).
Roztwór stokowy Met (25×)	DMEM (-Met / -Cys) uzupełnione o 100 mM L-metioniny	Przygotować na świeżo i przefiltrować za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 µm przed użyciem.
Kontrolna pożywka Met	DMEM (-Met / -Cys) uzupełnione o 10% BCS, roztwór stokowy Met (1×), 2 mM L-cysteiny	Przygotować na świeżo przed użyciem.
Roztwór stokowy Ac4GalNAz (1 000×)	50 mM peracetylowanej N-azydacetylogalakozaminy (Ac4GalNAz) w metanolu	Przechowywać w 4 °C. Ac4GalNAz jest prekursorem metabolicznym GlcNAz.
Pożywka do znakowania cukrem azydowym	100 μl roztworu stokowego Ac4GalNAz, 100 ml pożywki do wzrostu komórek HEK 293	Pozwolić metanolowi odparować przed dodaniem pożywki do wzrostu komórek HEK 293.
Roztwory chlorku cezu	CsCl rozpuszczony w buforze TD: 1,25 g/ml (18,08 g / 50 ml H2O) 1,35 g/ml (25,60 g / 50 ml H2O) 1,40 g/ml (31,00 g / 50 ml H2O)	Gradienty gęstości do ultrawirowania
Bufor do przechowywania wirusa	Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna (PBS), pH 7,2, zawierająca 0,5 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2 oraz 10% (v/v) glicerolu	Przechowywać w -20 °C
Roztwór do znakowania TAMRA-BCN (SPAAC)	TAMRA-BCN w DMSO: Użyć absorbancji UV (test OD260), aby wyznaczyć miano roztworu wirusa w kroku 4.1 Wyznaczyć całkowitą liczbę cząsteczek wirusowych w aliquocie 50 μl (NAd5) Moliarność TAMRA-BCN (w M) wyznacza się według wzoru: cBCN = 4 × 108 × (NAd5 / NAvo) NAvo = 6,022 × 1023 (tak aby mieszanina reakcyjna przygotowana w kroku 4 zawierała 100 sond alkinowych na wirion)	Sonda alkinowa aktywowana naprężeniem pierścienia Dla SDS-PAGE sugeruje się miano wirusa wynoszące około 1012 cząsteczek / ml
Roztwór do znakowania TAMRA-Alkin (CuAAC)	50 μl Ad5 modyfikowanego azydowo w buforze do przechowywania wirusa (NAd5 wyznaczone jak wyżej), 1,5 mM disulfonianu batofenantroliny (tj. 1,5 × końcowe stężenie CuBr), TAMRA-Alkin. Moliarność TAMRA-Alkinu (w M) jest wyznaczana według wzoru: cAlk = 2 × 106 × (NAd5 / NAvo) (tak aby mieszanina reakcyjna przygotowana w kroku 5 zawierała 100 sond alkinowych na wirion)	Bufor Tris jest znany jako konkurencyjny i inhibicyjny ligand miedzi.8
Bufor do próbek Laemmli (2×)	125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w/v) SDS, 20% (v/v) glicerolu, 10% (v/v) 2-merkaptoetanolu oraz 0,004% (w/v) błękitu bromofenolowego
Bufor do elektroforezy	187 mM glicyny, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS w H2O	Przechowywać w 4 °C

Tabela 1. Przygotowanie buforów i roztworów wymaganych w tym protokole.

Dyskusja

Rozwój chemoselektywnych i bioortogonalnych reakcji typu click, w tym reakcji z udziałem azydków, jest dynamicznie rozwijającym się obszarem badań, w związku z czym rośnie liczba dostępnych reakcji do zastosowań w biokoniugacji. Zakres niniejszego protokołu ograniczyliśmy do dwóch metod, które wybrano ze względu na ich użyteczność w naszym laboratorium oraz komercyjną dostępność wszystkich odczynników.

W pierwszej z tych dróg – cykloaddycji azydkowo-alkinowej promowanej naprężeniem (SPAAC) – a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adenowirus typu 5 (Ad5) zawierający transgen GFP	BCBC	391
Komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK 293)	ATCC	CRL-1573
Podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy	Invitrogen	11965-092
Podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium, bez metioniny, bez cysteiny (DMEM -Met / -Cys), wysoka zawartość glukozy	Invitrogen	21013-024
Surowica z cielęcej krwi	Invitrogen	16170-078
Roztwór penicyliny i streptomycyny 100× (Pen Strep)	Invitrogen	15140-122
0,5% Trypsyna-EDTA (10×)	Invitrogen	15400-054
Szalka do hodowli komórek 100 mm, polistyren traktowany do hodowli tkankowych	BD Falcon	353003
Inkubator CO2 do hodowli komórek
Hemocytometr
Kabineta bezpieczeństwa biologicznego
Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μm, octan celulozy)	VWR	28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Wirówka Avanti J-E	Beckman Coulter	369001
Probówki stożkowe (50 ml, sterylne)	BD Falcon	352098
Probówka, cienkościenna, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm	Beckman	344059
Ultrawirówka wyposażona w rotory SW 41 i SW 60	Beckman
Probówki Eppendorf Biopur Safe-Lock, 1,5 ml	Eppendorf	0030 121.589
Wirówka 5418	Eppendorf	5418
Kolumny do filtracji żelowej Centri-Sep	Princeton Separations	CS-901
Sterylna igła, 18 G
Rękawica azotowa (jeśli planowane jest beztlenowe CuAAC)
Naczynie Dewara
Azot ciekły
Kuweta elektroforetyczna
Fluorescencyjny skaner żeli
Żel Ready Gel Tris-HCl	Bio-Rad	161-1105
L-azidohomoalanina	AnaSpec	63669
Jena Biosciences	CLK-AA005
Peracetylowana N-azydoacetylogalaktozamina (Ac4GalNAz)	Invitrogen	C33365
Thermo Scientific	88905
Sigma-Aldrich	A7480
Sól sodowa kwasu batofenantrolino-disulfonowego (BDA)	MP Biomedicals	0215011201
Dimetylosulfotlenek (DMSO)
Metanol
Tragedia Tris (tris(hydroksymetyl)aminometan)
Fosforan sodu (Na2HPO4)
Fosforanowy bufor solny (PBS)
1M HCl
Glicerol
Sery albuminy wołowej
L-cysteina
L-metionina
SDS (dodecylosiarczan sodu)
2-merkapto–etanol
Glicyna
Błękit bromofenolowy
Chlorek cezu (CsCl)
Bromek miedzi(I) (CuBr)
Chlorek wapnia (CaCl2)
Chlorek potasu (KCl)
Chlorek magnezu (MgCl2)
Chlorek sodu (NaCl)
Sonda alkinowa do CuAAC*
Alkin TAMRA	Invitrogen	T10183
Sonda alkinowa z naprężeniem do SPAAC*
Alkin TAMRA DIBO	Invitrogen	C10410
* Do głównych dostawców odczynników i zestawów do chemii klik należą Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools oraz Baseclick. W katalogach tych dostawców można znaleźć szeroką gamę barwników alkinowych i ligandów celujących.