Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi

DOI:

10.3791/4247

⸱

31 października 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Blood and Marrow Transplant Program, University of Michigan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja wielu potencjalnych biomarkerów o wysokiej przepustowości może być przeprowadzona za pomocą sekwencyjnego testu ELISA w celu zminimalizowania cykli zamrażania/rozmrażania i wykorzystania cennych próbek osocza. W tym miejscu pokazujemy, jak sekwencyjnie przeprowadzać testy ELISA dla sześciu różnych zwalidowanych biomarkerów osocza1-3 choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)4 na tej samej próbce osocza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezstronne strategie proteomiki odkrywczej mają potencjał do identyfikacji dużej liczby nowych biomarkerów, które mogą poprawić testy diagnostyczne i prognostyczne w warunkach klinicznych i mogą pomóc w prowadzeniu interwencji terapeutycznych. W przypadku zidentyfikowania dużej liczby białek kandydujących może być trudno w odpowiednim czasie i skutecznie zweryfikować potencjalne biomarkery z próbek osocza pacjentów, które są sterowane zdarzeniami, mają skończoną objętość i są niezastąpione, na przykład na początku ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), potencjalnie zagrażającego życiu powikłania allogenicznego przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT).

Tutaj opisujemy proces przeprowadzania dostępnych na rynku testów ELISA dla sześciu potwierdzonych białek GVHD: IL-2Rα5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2 i REG3α3 (znany również jako PAP1) w sposób sekwencyjny, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, czas rozmrażania plazmy i zużycie osocza. W tej procedurze przeprowadzamy testy ELISA w kolejności sekwencyjnej, zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia próbki ustalonym w naszym laboratorium, przy użyciu zestawów i protokołów ELISA producenta z niewielkimi korektami, aby ułatwić optymalne wyniki sekwencyjnego testu ELISA. Uzyskane stężenia biomarkerów w osoczu można następnie skompilować i przeanalizować w celu uzyskania istotnych wyników w kohorcie pacjentów. Chociaż te biomarkery są obecnie przeznaczone wyłącznie do celów badawczych, ich włączenie do opieki klinicznej jest obecnie badane w badaniach klinicznych.

Ta technika może być zastosowana do przeprowadzenia testów ELISA dla wielu interesujących białek/cytokin na tej samej próbce (próbkach), pod warunkiem, że próbki nie muszą być mieszane z innymi odczynnikami. Jeśli zestawy ELISA nie są dostarczane z wstępnie powlekanymi płytkami, można użyć 96-dołkowych płytek półdołkowych lub 384-dołkowych, aby jeszcze bardziej zminimalizować użycie próbek/odczynników.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), główna przyczyna śmiertelności bez nawrotu (NRM) po allogenicznym przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT), jest mierzona dysfunkcją trzech układów narządowych: skóry, wątroby i przewodu pokarmowego (GI)4. Ostra GVHD zwykle występuje między dwoma a ośmioma tygodniami po przeszczepie, ale może wystąpić później i często jest klinicznie nie do odróżnienia od innych powikłań po HSCT, takich jak toksyczność schematu kondycjonowania, infekcja lub skutki uboczne leków. Dzięki zastosowaniu strategii proteomicznych i wysokoprzepustowej walidacji przy użyciu sekwencyjnego testu ELISA zidentyfikowaliśmy 6 białek, których stężenie jest podwyższone na początku objawów klinicznych GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF i IL-8 po połączeniu w panel 4-biomarkerowy mogą diagnozować GVHD na początku objawów klinicznych i mogą przewidywać przeżycie po HSCT niezależnie od ciężkości GVHD1. Elafina, biomarker GVHD skóry, może rozróżniać wysypkę GVHD od wysypki z innych przyczyn, takich jak wykwity polekowe, i może przewidywać przeżycie przeszczepu2. Niedawno zidentyfikowaliśmy REG3α jako biomarker GVHD dolnego odcinka przewodu pokarmowego, narządu docelowego najbardziej związanego z NRM. Stężenie REG3α w osoczu może niezawodnie zidentyfikować GVHD jako przyczynę biegunki po HSCT i skorelować z histologicznym nasileniem GVHD w diagnostycznych biopsjach jelit. Stężenia REG3α na początku GVHD w przewodzie pokarmowym mogą również przewidywać odpowiedź na terapię GVHD i NRM3. Włączenie tych zwalidowanych biomarkerów GVHD do opieki klinicznej jest obecnie badane w ramach badań klinicznych.

Te eksperymenty zostały przeprowadzone na małych porcjach osocza pobranych od pacjentów otrzymujących HSCT między 2000 a 2010 rokiem w momencie wystąpienia GVHD, które są niezastąpione i w ograniczonej ilości. Ze względu na cenny charakter tych próbek, opracowaliśmy metodę pomiaru wielu stężeń białek osocza w wydajny i powtarzalny sposób, aby wyeliminować nadmierne cykle zamrażania i rozmrażania, czas rozmrażania i zużycie osocza. Technika ta może być stosowana do przeprowadzania testów ELISA dla wielu białek/cytokin będących przedmiotem zainteresowania na tej samej próbce (próbkach), pod warunkiem, że próbki nie muszą być mieszane z innymi odczynnikami. Jeśli zestawy ELISA nie są dostarczane z wstępnie powlekanymi płytkami, można użyć 96-dołkowych płytek półdołkowych lub 384-dołkowych, aby jeszcze bardziej zminimalizować użycie próbek/odczynników. Niniejszy manuskrypt koncentruje się na technologicznych aspektach pomiaru biomarkerów GVHD.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dzień Eksperymentu 0: Przygotowanie próbki i pokrycie płytki testowej ELISA przeciwciałem wychwytującym dla IL-2Rα, REG3α i HGF

  1. Podwielokrotne próbki osocza, które mają być analizowane, zostaną pobrane, rozmrożone i odwirowane z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut w celu oddzielenia skrzepów na dnie i lipidów na górze od osocza. 150 μl nierozcieńczonego osocza zostanie posiane z każdej próbki na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V (płytka źródłowa) poprzez ręczne pipetowanie zgodnie z wcześniej określonymi mapami. Podwielokrotności zostaną owinięte w parafilm i będą przechowywane w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C podczas całego procesu; nie dłużej niż 72 godziny.
  2. Przeciwciała wychwytujące IL-2Rα i HGF zostaną odtworzone i rozcieńczone zgodnie ze specyfikacją producenta, a 50 μl zostanie posiane w każdym dołku z odpowiednich 96-dołkowych płytek półdołkowych o wysokim poziomie wiązania, które są następnie zamykane i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, wiele płytek można suszyć w temperaturze 37 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania, w zależności od stabilności białka.
  3. Przeciwciało wychwytujące REG3α zostanie rozcieńczone zgodnie z protokołem producenta przy użyciu buforu powlekającego producenta, a 25 μl zostanie posiane w każdym dołku 384-dołkowej płytki Nunc Maxi-Sorp, która jest następnie zamykana i inkubowana przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Dzień 1. Eksperyment Dzień 1: IL-2Rα ELISA (Rysunek 1)

  1. Płytka testowa IL-2Rα jest myta, blokowana za pomocą BLOTTO w TBS, a wzorzec jest odtwarzany i przygotowywana jest 8-punktowa krzywa wzorcowa zgodnie z protokołem producenta.
  2. Po umyciu płytki zgodnie z etapem blokowania, 50 μl nierozcieńczonego osocza jest powlekane w dwóch egzemplarzach od płytki źródłowej do płytki testowej ELISA, a następnie 50 μl każdego wzorca jest powlekane w dwóch egzemplarzach. Płytkę zamyka się i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze płytkowym ustawionym na 300 obr./min.
  3. Osocze jest odzyskiwane z płytki testowej IL-2Rα ELISA i umieszczane z powrotem na nierozcieńczonej płytce źródłowej plazmy. Test ELISA jest wypełniany zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek półdołkowych), a gęstość optyczna każdego dołka zostanie odczytana za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a dane zostaną zapisane i przeanalizowane.

3. Eksperyment Dzień 1: REG3α ELISA (Rysunek 1)

  1. 10 μl nierozcieńczonego osocza zostanie przeniesione na oddzielną płytkę źródłową z dnem w kształcie litery V. Do każdej studzienki dodaje się 90 μl buforu rozcieńczającego dostarczonego przez producenta, aby utworzyć płytkę źródłową rozcieńczenia w stosunku 1:10.
  2. Test ELISA REG3α jest wykonywany zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek 384-dołkowych), a gęstość optyczna każdej studzienki zostanie odczytana za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-620 nm, a dane zostaną zapisane i przeanalizowane.

4. Dzień 1. Eksperyment Dzień 1: Powłoka płytki testowej Elafin i TNFR1 z przeciwciałem wychwytującym

  1. Przeciwciała wychwytujące elafinę i TNFR1 zostaną odtworzone i rozcieńczone zgodnie ze specyfikacją producenta, a następnie 50 μl zostanie posiane w każdym dołku odpowiednich 96-dołkowych płytek półdołkowych o wysokim poziomie wiązania, które są następnie zamykane i inkubowane przez noc w temperaturze pokojowej dla Elafina i w temperaturze 4 °C dla TNFR1.

5. Dzień eksperymentu 1-2: HGF ELISA (Rysunek 1)

  1. Po zakończeniu testu ELISA IL-2Rα i upewnieniu się, że test nie musi być powtarzany, 60 μl nierozcieńczonego osocza zostanie przeniesione na nową płytkę źródłową, a następnie do każdej studzienki dodaje się 60 μl 1% BSA w 1 x PBS, aby uzyskać rozcieńczoną płytkę źródłową osocza w stosunku 1:2.
  2. Płytka testowa HGF jest myta, blokowana za pomocą BLOTTO w TBS, a wzorzec jest odtwarzany i przygotowywana jest 8-punktowa krzywa wzorcowa zgodnie z protokołem producenta.
  3. Po umyciu płytki zgodnie z etapem blokowania, 50 μl osocza rozcieńczonego w stosunku 1:2 jest powlekane dwukrotnie na płytce testowej ELISA, a następnie 50 μl każdego wzorca jest powlekane w dwóch egzemplarzach. Płytka jest zamykana i inkubowana przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze płytkowym ustawionym na 300 obr./min.
  4. Osocze rozcieńczone w stosunku 1:2 jest odzyskiwane z płytki testowej HGF ELISA i umieszczane z powrotem na płytce źródłowej osocza rozcieńczonej w stosunku 1:2. Test ELISA jest wypełniany zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek półdołkowych), a gęstość optyczna każdego dołka zostanie odczytana za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a dane zostaną zapisane i przeanalizowane.

6. Eksperyment Dzień 2: ELISA Elafin

  1. 10 μl nierozcieńczonego osocza zostanie przeniesione na nową płytkę źródłową, a następnie 190 μl 1% BSA w 1 x PBS zostanie dodane do każdej studzienki, aby uzyskać 200 μl osocza rozcieńczonego w stosunku 1:20.
  2. Test ELISA Elafin wykonywany zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek półdołkowych) oraz gęstość optyczna każdej studzienki zostaną odczytane za pomocą czytnika płytek ustawionych na 450-570 nm, a dane zostaną zapisane i przeanalizowane.

7. Eksperyment Dzień 2: Test ELISA TNFR1

  1. 25 μl 1% BSA w PBS zostanie dodane do płytki źródłowej 1:20 (teraz zawierającej 100 μl osocza 1:20), aby uzyskać 125 μl osocza rozcieńczonego w stosunku 1:25.
  2. Test ELISA TNFR1 jest wykonywany zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek półdołkowych), a gęstość optyczna każdego dołka zostanie odczytana za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a dane zostaną zapisane i przeanalizowane.

8. Eksperyment Dzień 2: IL-8 ELISA

  1. 60 μl osocza rozcieńczonego w stosunku 1:2 zostanie przeniesione na nową płytkę źródłową, a następnie do każdej studzienki dodaje się 180 μl rozcieńczalnika IL-8, aby uzyskać rozcieńczoną w stosunku 1:6 płytkę źródłową osocza.
  2. Test ELISA IL-8 jest wypełniany zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek półdołkowych), a gęstość optyczna każdego dołka zostanie odczytana za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a dane zostaną zapisane i przeanalizowane.

Gdy wszystkie testy ELISA zostaną zakończone, niewykorzystane osocze zostanie zastąpione rozmrożonymi porcjami i zamrożone do wykorzystania w przyszłości.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebieg pracy i oś czasu biomarkerów są szczegółowo opisane odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2. Po zakończeniu prac oznaczono ilościowo stężenia 6 różnych białek w tej samej próbce osocza przy użyciu łącznie 150 μl osocza. Powlekanie próbek w dwóch egzemplarzach na test pozwala na wewnętrzne zapewnienie jakości, przy czym CV poniżej 10% jest optymalne. W przypadku wykonywania sekwencyjnego testu ELISA na wielu płytkach, preferowane są stałe gęstości optyczne wysokiego standardu, co pozwala na poprawę niezawodności pomiarów między płytkami; Krzywe standardowe OD można porównać między płytkami w celu oceny niespójności w wynikach testu ELISA (rysunek 2). Czasy rozwoju przy użyciu kolorymetrycznego substratu tetrametylobenzydyny i wysokich stężeń OD obserwowanych dla każdego biomarkera w naszym laboratorium przedstawiono w tabeli 3.

figure-results-1
Rysunek 1. Przebieg pracy dla testów IL-2Rα, REG3α i HGF ELISA. Po posiewie próbek osocza na płytkach testowych IL-2Rα ELISA, są one regenerowane w celu wytworzenia płytek źródłowych do rozcieńczania dla innych testów ELISA. W przypadku testu HGF ELISA osocze jest odzyskiwane w celu przygotowania płytki rozcieńczającej 1:6 dla IL-8. Kliknij tutaj, aby powiększyć figurę.

figure-results-2
Rysunek 2. Gęstości optyczne dla krzywej wzorcowej 7 różnych płytek ELISA mierzących stężenia REG3α odpowiadające 1084 pacjentom badanym pod kątem wstępnego raportu biomarkerów REG3α GI GVHD3. Spójne OD między płytkami zapewniają spójne pomiary stężenia białka między płytkami. Stężenia białek w próbkach osocza oblicza się, porównując gęstości optyczne próbki z gęstościami optycznymi krzywej standardowej.

Eksperyment Dzień 0 1. Przygotuj próbki 2. IL-2Rα, HGF i REG3α wychwytują Ab Eksperyment Dzień 1 1. Test ELISA IL-2Rα 2. REG3αELISA 3. Test ELISA HGF (poprzez posiewanie próbki) 4. Elafin i TNFR przechwytują Ab Eksperyment Dzień 2 1. Wypełnianie testu HGF ELISA 2. ELISA ELISA 3. Test ELISA TNFR1 4. Test ELISA IL-8 5. Ponownie zamroź niewykorzystane osocze

Tabela 1. Przegląd przepływu pracy z biomarkerami GVHD

Dzień 0 Przygotowanie próbki i całonocna inkubacja ciała TEST ELISA IL-2Rα REG3α powiedział: HGF (Fundusz Kapitałowy) Elafin TNFR1 powiedział: IŁ-8 Czas (godz.) 0,0 Blokowanie 1,0 Próbki platerowane Wersja 3.0 Odzyskiwanie próbek osocza; Detekcja Ab Blokowanie; Przygotowanie próbek (rozcieńczenie 1:10) Wersja 4.0 Próbki platerowane (1:10) 5.0 Streptawidyna-HRP Detekcja Ab Rozdział 5.5 TMB (Przedsiębiorstwo Zarządzania Streptawidyna-HRP 6,0 Odczyt z płyty TMB (Przedsiębiorstwo Zarządzania Blokowanie; Przygotowanie próbek (rozcieńczenie 1:2) 6,5 Odczyt z płyty 7,0 Próbki platerowane (1:2) Wychwytywanie Ab (inkubacja przez noc) Wychwytywanie Ab (inkubacja przez noc) Dzień 2 Czas (godz.) 0,0 Odzyskiwanie plazmy, detekcja Ab Blokowanie; Przygotowywanie próbek (1:20) 1,0 Próbkowanie posiewu (1:2) Blokowanie; Dalsze rozcieńczanie próbek w stosunku 1:20 do rozcieńczenia w stosunku 1:25 2.0 Zasoby ludzkie Próbkowanie posiewu (1:25) Rozdział 2.5 TMB (Przedsiębiorstwo Zarządzania Wersja 3.0 Odczyt z płyty Detekcja Ab 3,5 Przygotowanie próbek (rozcieńczenie 1:6) Wersja 4.0 Detekcja Ab Powlekanie próbki (1:6) 5.0 Zasoby ludzkie Rozdział 5.5 TMB (Przedsiębiorstwo Zarządzania 6,0 Odczyt z płyty Zasoby ludzkie Detekcja Ab TMB (Przedsiębiorstwo Zarządzania 7,0 Odczyt z płyty TMB (Przedsiębiorstwo Zarządzania 7,5 Odczyt z tablic rejestracyjnych Po zakończeniu Zamień plazmę źródłową na porcje i zamroź do późniejszego wykorzystania

Tabela 2. Harmonogram przeprowadzania testów ELISA.

Współczynnik rozcieńczenia osocza Wysoki standard stężenia Czas rozwoju podłoża (min) Wysoki OD krzywa IL-2Rα 1:1 2 000 pg/ml 5 1 liniowy HGF (Fundusz Kapitałowy) 1:2 4 000 pg/ml 22 Rozdział 22 2.1 4-parametrowy IŁ-8 1:6 200 pg/ml 12 2.7 4-parametrowy REG3α powiedział: Godzina 1:10 100 ng/ml 12 Pytanie 1.7 4-parametrowy Elafin Godzina 1:20 2 000 pg/ml 20 Pytanie 1.9 4-parametrowy TNFR1 powiedział: 1:25 800 pg/ml 8 2.7 liniowy

Tabela 3. Szczegóły testu ELISA dla 6 biomarkerów GVHD.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj sekwencyjna metoda ELISA pozwala na pomiar wielu białek osocza na małych objętościach osocza, które mogą być trudne do uzyskania i/lub niezastąpione, takie jak próbki od ludzi z rzadkimi chorobami lub próbki osocza uzyskane od myszy9,10. Sekwencyjne testy ELISA są zwykle przeprowadzane w kolejności zwiększania współczynnika rozcieńczania osocza, przy czym testy ELISA wymagające osocza rozcieńczonego ≥ stosunku 1:10 zazwyczaj nie muszą być odzyskiwane, chociaż w razie potrzeby można to zrobić. Zdolność do sekwencyjnego testu ELISA jest ograniczona przez zestawy/protokoły ELISA, w których osocze jest mieszane z innymi odczynnikami lub dla których wymagane są różne rozcieńczające osocze; Wyklucza to możliwość ponownego wykorzystania próbki ze względu na obawy, że niekompatybilny bufor/odczynnik zakłóci działanie określonego testu. Przy starannym planowaniu można przeprowadzić 10 lub więcej testów ELISA na tej samej próbce osocza.

Poszczególne laboratoria mogą być zmuszone do dostosowania rozcieńczeń w osoczu w celu uzyskania wyników możliwych do interpretacji w oparciu o oczekiwane stężenia białka będącego przedmiotem zainteresowania w osoczu w próbkach pobranych od badanych. Różnice w wyposażeniu laboratoryjnym mogą skutkować koniecznością optymalizacji czasu inkubacji i rozwoju kolorymetrycznego, liczby prań i/lub czasów namaczania w celu optymalizacji danego testu ELISA.

W celu zwiększenia przepustowości i dokładności oraz wykonywania analiz w sposób ekonomiczny zaleca się zastosowanie zrobotyzowanej platformy do obsługi cieczy, która umożliwia analizę na płytkach 384-dołkowych, oraz zautomatyzowanej myjki płytek z jednostką sztaplowania. Sprzęt ten może zwiększyć dokładność i precyzję analizy wykonywanej przez wielu użytkowników oraz pomóc w zapewnieniu spójności analizy w celu zmniejszenia zmienności między i wewnątrz testów.

Użyliśmy sekwencyjnego testu ELISA na dostępnych platformach multipleksowych z dwóch powodów: 1) Większość par przeciwciał dla nowych białek nie może być łatwo sprzężona z kulkami lub innym materiałem, a także jest czasochłonna i kosztowna; 2) indywidualne testy ELISA są bardziej precyzyjne niż mikromacierze multipleksowe lub kulki, wtórne do braku reaktywności krzyżowej11 . Jeśli zostanie opracowana wiarygodna metoda wykonywania multipleksowanych mikromacierzy na bazie kulek, może ona być w stanie zastąpić sekwencyjny proces ELISA, ale może być ograniczona przez zdolność do koniugacji przeciwciał z kulkami i/lub liczbę białek pożądanych do analizy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez granty NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, Fundację Hartwell i Fundację Charytatywną Doris Duke. Dr Paczesny jest badaczem funduszu Erica Hartwella i programu badawczego Amy Strelzer Manasevit Research Program.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Człowiek IL-2 R alfa DuosetR& D SystemsDY223
Human HGF DuosetR& D SystemsDY294
Człowiek IL-8 OptEIA KIT IIBecton Dickinson550999
Ab-Match MONTAŻ Ludzki PAP1 (REG3α) ZestawMBL International5323
Ab-Match UNIWERSALNY ZestawMBL International5310
Human sTNFRI/TNFRSF1A DuosetR& D SystemsDY225
Pułapka dla ludzi-2/Elafin DuosetR& D SystemsDY1747
96-dołkowe stożkowe płyty dolne z polistyrenuThermo Scientific249570Używane do płytek źródłowych plazmy
Costar półdołkowe płytki 96-dołkowe o wysokim poziomie wiązaniaCorning3690Do IL-2Rα, HGF, TNFR1 i elafin ELISA
Nunc 384-dołkowe płytki MaxiSorpNunc464718Do REG3α Elisa
HyClone Fosforan Buforowany Soli Fizjologicznej, 1xThermo ScientificSH30256.02
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, poddana szokowi cieplnemuFisher ScientificBP1600-100
Bloker BLOTTO w TBSThermo Scientific37530Środek blokujący dla IL-2R&alfa; ELISA HGF i TNFR1
buforowana fosforanami DulbeccoGibco21600-069Bufor płuczący do testów ELISA IL-2Rα, HGF, Elafin i TNFR1 ELISAs
TMBLaboratories Kirkegaard and Perry50-76-00
Tween 20Acros Organics233362500Bufor do płukania kwasu siarkowego IL-2Rα, HGF, Elafin i TNFR1 ELISA
Sigma-Aldrich84720(rozcieńczony do 2N) do roztworu zatrzymującego
Sól fizjologiczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paczesny, S. A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood. 113, 273-278 (2009).
  2. Paczesny, S. Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin. Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).
  3. Ferrara, J. L. Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease. Blood. , (2011).
  4. Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. Graft-versus-host disease. Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
  5. Miyamoto, T. Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).
  6. Holler, E. Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation. Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).
  7. Okamoto, T. Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).
  8. Uguccioni, M. Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease. Blood. 81, 2252-2256 (1993).
  9. Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes. J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).
  10. Osuchowski, M. F., Remick, D. G. The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA. Methods. 38, 304-311 (2006).
  11. Schweitzer, B. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sequential ELISABiomarker ValidationAcute GVHDPlasma SamplesHigh ThroughputELISA ProtocolsCytokine AnalysisBiomarker DiscoveryGraft Versus HostProteomics Validation

Powiązane artykuły