Wysokoprzepustową walidację wielu potencjalnych biomarkerów można przeprowadzić za pomocą sekwencyjnego testu ELISA, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania oraz zużycie cennych próbek osocza. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak sekwencyjnie wykonać testy ELISA dla sześciu różnych zwalidowanych biomarkerów osocza1-3 w chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD)4 w tej samej próbce osocza.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Strategie bezstronnej proteomiki odkrywczej mają potencjał do identyfikacji dużej liczby nowych biomarkerów, które mogą usprawnić diagnostykę i testy prognostyczne w warunkach klinicznych oraz pomóc w kierowaniu interwencjami terapeutycznymi. W przypadku zidentyfikowania wielu potencjalnych białek, walidacja kandydatów na biomarkery w sposób szybki i wydajny może być trudna, gdy wykorzystuje się próbki osocza pacjentów pobierane w odpowiedzi na zdarzenia kliniczne, o ograniczonej objętości i niepodlegające odtworzeniu, na przykład w momencie wystąpienia ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), która jest potencjalnie zagrażającym życiu powikłaniem allogenicznego przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT).
W niniejszym opracowaniu opisujemy proces przeprowadzania dostępnych komercyjnie testów ELISA dla sześciu zwalidowanych białek związanych z GVHD: IL-2Rα5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafiny2 oraz REG3α3 (znanego również jako PAP1) w sposób sekwencyjny, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, czas przebywania rozmrożonej plazmy w temperaturze pokojowej oraz zużycie plazmy. W ramach tej procedury testy ELISA wykonujemy w kolejności wynikającej z czynnika rozcieńczenia próbek, ustalonej w naszym laboratorium z wykorzystaniem zestawów i protokołów ELISA producenta, z niewielkimi modyfikacjami mającymi na celu optymalizację sekwencyjnego przebiegu analiz. Uzyskane stężenia biomarkerów plazmy mogą następnie zostać zestawione i przeanalizowane pod kątem istotnych wyników w obrębie kohorty pacjentów. Chociaż biomarkery te służą obecnie wyłącznie do celów badawczych, ich wprowadzenie do praktyki klinicznej jest obecnie badane w ramach badań klinicznych.
Tę technikę można zastosować do przeprowadzenia testów ELISA dla wielu białek/cytokin w tej samej próbce lub próbkach, pod warunkiem że próbki nie muszą być mieszane z innymi odczynnikami. Jeśli zestawy ELISA nie zawierają płyt przedpowlekanych, w celu dalszej minimalizacji zużycia próbek/odczynników można zastosować płytki 96-dołkowe typu half-well lub płytki 384-dołkowe.
Wprowadzenie
Ostra choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), będąca główną przyczyną śmiertelności niezwiązanej z nawrotem (NRM) po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT), jest diagnozowana na podstawie dysfunkcji trzech układów narządowych: skóry, wątroby i przewodu pokarmowego (GI)4. Ostra GVHD pojawia się zazwyczaj od drugiej do ósmej tygodnia po przeszczepie, choć może wystąpić później, i często jest klinicznie nieodróżnialna od innych powikłań po HSCT, takich jak toksyczność schematu warunkowania, infekcje lub działania niepożądane leków. Dzięki zastosowaniu strategii proteomicznych i walidacji wysokoprzepustowej za pomocą sekwencyjnego testu ELISA zidentyfikowaliśmy 6 białek, których stężenia są podwyższone w momencie wystąpienia klinicznych objawów GVHD. Panel 4 biomarkerów, obejmujący IL-2Rα, TNFR1, HGF oraz IL-8, pozwala na diagnozę GVHD w momencie pojawienia się objawów klinicznych i może przewidywać przeżywalność po HSCT niezależnie od stopnia nasilenia GVHD1. Elafina, biomarker GVHD skóry, pozwala odróżnić wysypkę GVHD od wysypek o innych przyczynach, takich jak osutki lekowe, i może przewidywać przeżywalność po przeszczepie2. Niedawno zidentyfikowaliśmy REG3α jako biomarker GVHD dolnego odcinka przewodu pokarmowego, który jest narządem docelowym najsilniej powiązanym z NRM. Stężenie REG3α w osoczu pozwala wiarygodnie zidentyfikować GVHD jako przyczynę biegunek po HSCT i koreluje z histologicznym stopniem nasilenia GVHD w diagnostycznych biopsjach jelita. Stężenia REG3α w momencie wystąpienia GVHD przewodu pokarmowego mogą również przewidywać odpowiedź na terapię GVHD oraz NRM3. Włączenie tych zwalidowanych biomarkerów GVHD do opieki klinicznej jest obecnie badane w ramach badań klinicznych.
Eksperymenty te przeprowadzono na niewielkich alikwotach osocza pobranych od pacjentów poddawanych HSCT między 2000 a 2010 rokiem w momencie wystąpienia GVHD, które są niedoścignione i dostępne w ograniczonej ilości. Ze względu na cenną naturę tych próbek opracowaliśmy metodę pomiaru stężeń wielu białek osocza w sposób wydajny i powtarzalny, aby wyeliminować nadmierne cykle zamrażania i rozmrażania, czas rozmrażania oraz zużycie osocza. Technikę tę można zastosować do przeprowadzenia testów ELISA dla wielu białek/cytokin zainteresowania w tej samej próbce (lub próbkach), pod warunkiem że próbki nie wymagają mieszania z innymi odczynnikami. Jeśli zestawy ELISA nie zawierają płyt pokrytych wcześniej, można zastosować płytki 96-dołkowe typu half-well lub płytki 384-dołkowe, aby dodatkowo zminimalizować zużycie próbek/odczynników. Niniejszy artykuł koncentruje się na aspektach technologicznych pomiaru biomarkerów GVHD.
Protokół
1. Dzień 0 eksperymentu: Przygotowanie próbek i pokrywanie płyt testowych ELISA przeciwciałem wychwytującym dla IL-2Rα, REG3α oraz HGF
- Alikwoty próbek osocza do analizy zostaną pobrane, rozmrożone i odwirowane przy 12 000 rpm przez 10 min, aby oddzielić skrzepy na dnie oraz lipidy na górze od osocza. Do każdej studzienki płyty 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V (płyta źródłowa) zostanie naniesiona ręcznie pipetą 150 μl nierozcieńczonego osocza z każdej próbki, zgodnie z wcześniej zdefiniowanymi mapami. Alikwoty zostaną owinięte parafilmem i przechowywane w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez cały proces, nie dłużej niż 72 hr.
- Przeciwciała wychwytujące IL-2Rα i HGF zostaną zrekonstytuowane i rozcieńczone zgodnie ze specyfikacją producenta, a następnie do każdej studzienki odpowiednich płyt 96-dołkowych o wysokiej zdolności wiązania (half-well) zostanie naniesiono 50 μl roztworu. Płyty zostaną zamknięte i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, w zależności od stabilności białka, wiele płyt można wysuszyć w temperaturze 37 °C i przechowywać w 4 °C do późniejszego użycia.
- Przeciwciało wychwytujące REG3α zostanie rozcieńczone zgodnie z protokołem producenta przy użyciu buforu do powlekania producenta, a następnie do każdej studzienki płyty 384-dołkowej Nunc Maxi-Sorp zostanie naniesiono 25 μl roztworu. Płyta zostanie zamknięta i inkubowana przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Dzień 1 eksperymentu: test ELISA dla IL-2Rα (Rysunek 1)
- Płytkę testową IL-2Rα przemywa się, blokuje za pomocą BLOTTO w TBS, a następnie zgodnie z protokołem producenta odtwarza standard i przygotowuje 8-punktową krzywą wzorcową.
- Po przemyciu płytki po etapie blokowania, 50 μl nierozcieńczonej osocza przenosi się w duplikacie z płytki źródłowej na płytkę testową ELISA, a następnie w duplikacie nanosi się 50 μl każdego standardu. Płytkę szczelnie zamyka się i inkubuje przez 2 hr w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 rpm.
- Osocze odzyskuje się z płytki testowej IL-2Rα ELISA i przenosi z powrotem do płytki źródłowej z nierozcieńczonym osoczem. Test ELISA przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta (z dostosowaniem objętości do płytek z półstudzienkami), a gęstość optyczną każdej studzienki odczytuje się za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, po czym dane są zapisywane i analizowane.
3. Dzień 1 eksperymentu: ELISA dla REG3α (Rycina 1)
- 10 μl nierozcieńczonej plazmy przenosi się do osobnej płytki źródłowej z dnem w kształcie litery V. Do każdego dołka dodaje się 90 μl buforu do rozcieńczania dostarczonego przez producenta, aby przygotować płytkę źródłową z rozcieńczeniem 1:10.
- Test REG3α ELISA wykonuje się zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek 384-dołkowych), a gęstość optyczną każdego dołka odczytuje się za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-620 nm, a następnie dane zapisuje się i analizuje.
4. Dzień eksperymentu 1: Powlekanie płytek testowych dla elafiny i TNFR1 przeciwciałem wychwytującym
- Przeciwciała wychwytujące Elafinę i TNFR1 należy zrekonstytuować i rozcieńczyć zgodnie ze specyfikacją producenta, a następnie 50 μl nanieść do każdej studzienki odpowiednich płytek 96-dołkowych o wysokim wiązaniu (typu half-well). Płytki należy szczelnie zamknąć i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w przypadku Elafiny oraz w temperaturze 4 °C w przypadku TNFR1.
5. Dzień eksperymentu 1-2: test ELISA dla HGF (Rysunek 1)
- Po zakończeniu testu ELISA dla IL-2Rα i upewnieniu się, że test nie wymaga powtórzenia, 60 μl nierozcieńczonej plazmy przenosi się na nową płytkę źródłową, a następnie do każdej studzienki dodaje 60 μl 1% BSA w 1 x PBS, aby przygotować płytkę źródłową z plazmą rozcieńczoną 1:2.
- Płytkę testową HGF przemywa się, blokuje za pomocą BLOTTO w TBS, a następnie zgodnie z protokołem producenta rekonstytuuje standard i przygotowuje 8-punktową krzywą wzorcową.
- Po przemyciu płytki po etapie blokowania, 50 μl plazmy rozcieńczonej 1:2 nanosi się w duplikacie na płytkę testową ELISA, a 50 μl każdego standardu nanosi się w duplikacie. Płytkę uszczelnia i inkubuje przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 RPM.
- Plazmę rozcieńczoną 1:2 odzyskuje się z płytki testowej ELISA HGF i przenosi z powrotem na płytkę źródłową z plazmą rozcieńczoną 1:2. Test ELISA przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta (dostosowując objętości do płytek półstudzienkowych), a gęstość optyczną każdej studzienki odczytuje się za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, po czym dane zapisuje się i analizuje.
6. Dzień 2 eksperymentu: ELISA dla elafiny
- 10 μl nierozcieńczonej plazmy należy przenieść na nową płytkę źródłową, a następnie do każdej studni dodać 190 μl 1% BSA w 1 x PBS, aby uzyskać 200 μl plazmy rozcieńczonej 1:20.
- Test Elafin ELISA należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek o połowie standardowej wielkości studni), a gęstość optyczną każdej studni odczytać za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a następnie zapisać i przeanalizować dane.
7. Dzień 2 eksperymentu: ELISA dla TNFR1
- Do płytki źródłowej z rozcieńczeniem 1:20 (zawierającej obecnie 100 μl osocza 1:20) należy dodać 25 μl 1% BSA w PBS, aby uzyskać 125 μl osocza rozcieńczonego 1:25.
- Test ELISA dla TNFR1 należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta (dostosowując objętości do płytek półdołkowych), a gęstość optyczną każdego dołka należy odczytać za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a następnie zapisać i przeanalizować dane.
8. Dzień 2 eksperymentu: test ELISA dla IL-8
- 60 μl osocza rozcieńczonego 1:2 przenosi się do nowej płytki źródłowej, a następnie do każdego dołka dodaje 180 μl rozcieńczalnika IL-8, aby przygotować płytkę źródłową z osoczem rozcieńczonym 1:6.
- Test IL-8 ELISA wykonuje się zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek półdołkowych), a gęstość optyczną każdego dołka odczytuje za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, po czym dane zapisuje się i analizuje.
Po zakończeniu wszystkich testów ELISA, niewykorzystany zapas plazmy zostanie przelany z powrotem do rozmrożonych alikwotów i zamrożony do przyszłego użycia.
Wyniki
Przebieg i harmonogram analiz biomarkerów szczegółowo opisano odpowiednio w Tabeli 1 oraz Tabeli 2. Po zakończeniu procesu stężenia 6 różnych białek zostały oznaczone w tej samej próbce osocza, wykorzystując łącznie 150 μL osocza. Naniesienie próbek w duplikacie dla każdego testu umożliwia wewnętrzne zapewnienie jakości, przy czym optymalne są wartości CV poniżej 10%. W przypadku przeprowadzania sekwencyjnego testu ELISA na wielu płytkach preferowane są spójne wartości gęstości optycznej wysokiego standardu, co pozwala na poprawę niezawodności pomiarów między płytkami; wartości OD krzywej standardowej można porównywać między płytkami w celu oceny niespójności w działaniu testu ELISA (Rysunek 2). Czasy utleniania z użyciem kolorymetrycznego substratu tetrametylobenzydyny oraz zaobserwowane wartości OD dla wysokich stężeń każdego biomarkera w naszym laboratorium wymieniono w Tabeli 3.
Rycina 1. Schemat postępowania dla testów ELISA dla IL-2Rα, REG3α i HGF. Po naniesieniu próbek osocza na płytki testowe ELISA IL-2Rα, są one odzyskiwane w celu przygotowania płytek źródłowych do rozcieńczeń dla pozostałych testów ELISA. W przypadku testu ELISA HGF, osocze jest odzyskiwane w celu przygotowania płytki z rozcieńczeniem 1:6 dla IL-8. Kliknij tutaj, aby powiększyć rycinę.
Rysunek 2. Gęstości optyczne dla krzywej standardowej 7 różnych płytek ELISA służących do pomiaru stężeń REG3α odpowiadających 1084 pacjentom przebadanym w początkowym raporcie dotyczącym biomarkera REG3α dla GI GVHD3. Spójne wartości OD między płytkami zapewniają powtarzalne pomiary stężeń białek między poszczególnymi płytkami. Stężenia białek w próbkach osocza są obliczane poprzez porównanie gęstości optycznej próbek z gęstościami optycznymi krzywej standardowej.
| Dzień 0 eksperymentu | 1. Przygotowanie próbek |
| 2. Przeciwciała wychwytujące IL-2Rα, HGF i REG3α | |
| Dzień 1 eksperymentu | 1. ELISA dla IL-2Rα |
| 2. ELISA dla REG3α | |
| 3. ELISA dla HGF (do etapu nakładania próbek) | |
| 4. Przeciwciała wychwytujące dla elafiny i TNFR | |
| Dzień 2 eksperymentu | 1. Zakończenie testu ELISA dla HGF |
| 2. ELISA dla elafiny | |
| 3. ELISA dla TNFR1 | |
| 4. ELISA dla IL-8 | |
| 5. Ponowne zamrożenie niewykorzystanej plazmy |
Tabela 1. Przegląd schematu analizy biomarkerów GVHD
| Dzień 0 | Przygotowanie próbek i inkubacja z ciałem wychwytującym przez noc | ||||||
| ELISA | IL-2Rα | REG3α | HGF | Elafina | TNFR1 | IL-8 | |
| Czas (godz.) | 0.0 | Blokowanie | |||||
| 1.0 | Próbki wysiane | ||||||
| 3.0 | Odzyskanie próbek osocza; przeciwciało detekcyjne | Blokowanie; Przygotowanie próbek (rozcieńczenie 1:10) | |||||
| 4.0 | Próbki wysiane (1:10) | ||||||
| 5.0 | Streptawidyna-HRP | Detekcja Ab | |||||
| 5.5 | TMB | Streptawidyna-HRP | |||||
| 6.0 | Odczyt płytki | TMB | Blokowanie; Przygotowanie próbek (rozcieńczenie 1:2) | ||||
| 6.5 | Odczyt płytki | ||||||
| 7.0 | Próbki wysiane (1:2) | Przeciwciało wychwytujące (inkubacja przez noc) | Przeciwciało wychwytujące (inkubacja nocna) | ||||
| Dzień 2 | |||||||
| Czas (godz.) | 0.0 | Odzyskać plazmę, przeciwciało detekcyjne | Blokowanie; Przygotowanie próbek (1:20) | ||||
| 1.0 | Wysiew próbki (1:2) | Blokowanie; Dalsze rozcieńczenie próbek z 1:20 do rozcieńczenia 1:25 | |||||
| 2.0 | HRP | Wysiew próbek (1:25) | |||||
| 2.5 | TMB | ||||||
| 3.0 | Odczyt płytki | Detekcja Ab | |||||
| 3.5 | Przygotować próbki (rozcieńczenie 1:6) | ||||||
| 4.0 | Detekcja Ab | Wysiew próbki (1:6) | |||||
| 5.0 | HRP | ||||||
| 5.5 | TMB | ||||||
| 6.0 | Odczyt płytki | HRP | Detekcja Ab | ||||
| TMB | |||||||
| 7.0 | Odczyt płytki | TMB | |||||
| 7.5 | Odczyt płytek | ||||||
| Po zakończeniu | Rozdzielić plazmę źródłową na alikwoty i zamrozić do późniejszego użycia | ||||||
Tabela 2. Harmonogram przeprowadzania testów ELISA.
| Współczynnik rozcieńczenia osocza | Stężenie wysokiego standardu | Czas rozwoju substratu (min) | Wysoka OD | Krzywa | |
| IL-2Rα | 1:1 | 2,000 pg/ml | 5 | 1 | Liniowa |
| HGF | 1:2 | 4,000 pg/ml | 22 | 2.1 | 4-parametrowa |
| IL-8 | 1:6 | 200 pg/ml | 12 | 2.7 | 4-parametrowa |
| REG3α | 1:10 | 100 ng/ml | 12 | 1.7 | 4-parametrowa |
| Elafin | 1:20 | 2,000 pg/ml | 20 | 1.9 | 4-parametrowa |
| TNFR1 | 1:25 | 800 pg/ml | 8 | 2.7 | Liniowa |
Tabela 3. Szczegóły testów ELISA dla 6 biomarkerów GVHD.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda sekwencyjnego badania ELISA umożliwia pomiar wielu białek osocza z niewielkich objętości osocza, które mogą być trudne do pozyskania i/lub niezastąpione, takich jak próbki od ludzi z rzadkimi chorobami lub próbki osocza pobrane od myszy9,10. Badania sekwencyjne ELISA są zazwyczaj przeprowadzane w kolejności rosnącego czynnika rozcieńczenia osocza, przy czym w przypadku testów ELISA wymagających osocza rozcieńczonego ≥ 1:10 odzyskiwanie próbki zazwyczaj nie jest konieczne, choć można to zrobić w razie potrzeby. Możliwość wykonania sekwencyjnego badania ELISA jest ograniczona przez zestawy/protokoły ELISA, w których osocze jest mieszane z innymi odczynnikami lub dla których wymagane są różne bufory rozcieńczające osocze; uniemożliwia to ponowne wykorzystanie próbki ze względu na obawy, że niekompatybilny bufor/odczynnik będzie zakłócał działanie konkretnego testu. Dzięki starannemu planowaniu, na tej samej próbce osocza można przeprowadzić 10 lub więcej testów ELISA.
Poszczególne laboratoria mogą potrzebować dostosowania rozcieńczeń osocza w celu uzyskania interpretowalnych wyników, w zależności od oczekiwanych stężeń analizowanego białka w próbkach pobranych od badanych osób. Różnice w wyposażeniu laboratoryjnym mogą skutkować koniecznością optymalizacji czasów inkubacji i rozwoju kolorymetrycznego, liczby cykli płukania i/lub czasu moczenia podczas płukania w celu zoptymalizowania konkretnego testu ELISA.
Aby zwiększyć przepustowość oraz dokładność i przeprowadzać analizy w sposób kosztowo efektywny, zaleca się zastosowanie robotycznej platformy do pipetowania, umożliwiającej analizę na płytkach 384-dołkowych, oraz automatycznej myjki do płytek z modułem do sztaplowania. Sprzęt ten pozwala zwiększyć dokładność i precyzję analiz wykonywanych przez wielu użytkowników oraz pomaga zapewnić spójność analiz w celu zmniejszenia zmienności między- i wewnątrztestowej.
Zdecydowaliśmy się na sekwencyjne przeprowadzanie testów ELISA zamiast dostępnych platform multipleksowych z dwóch powodów: 1) większość par przeciwciał dla nowych białek nie może być łatwo sprzęgnięta z kuleczkami lub innym materiałem, a proces ten jest czasochłonny i kosztowny; 2) poszczególne testy ELISA są bardziej precyzyjne niż multipleksowe macierze mikroprzestrzenne lub kuleczki, co wynika z braku reakcji krzyżowych11. Jeśli zostanie opracowana niezawodna metoda przeprowadzania multipleksowych macierzy mikroprzestrzennych opartych na kuleczkach, może ona zastąpić proces sekwencyjnego badania ELISA, jednak może być ograniczona możliwością sprzęgania przeciwciał z kuleczkami i/lub liczbą białek, których analiza jest wymagana.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Wspierane przez granty NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, fundację Hartwell Foundation oraz fundację Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny jest badaczem funduszu Eric Hartwell oraz programu badawczego Amy Strelzer Manasevit Research Program.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw Duoset dla ludzkiego IL-2 R alpha | R&D Systems | DY223 | |
| Zestaw Human HGF Duoset | R&R&D Systems | DY294 | |
| Zestaw Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
| MONTAŻ Ab-Match ludzkiego PAP1 (REG3)αZestaw | MBL International | 5323 | |
| Zestaw Ab-Match UNIVERSAL | MBL International | 5310 | |
| Zestaw Duoset dla ludzkiego sTNFRI/TNFRSF1A | R&D Systems | DY225 | |
| Zestaw Duoset dla ludzkiej trappin-2/elafiny | R&D Systems | DY1747 | |
| 96-dołkowe polistyrenowe płytki z dnem stożkowym | Thermo Scientific | 249570 | Stosowane do płytek źródła plazmy |
| płytki 96-dołkowe Costar half-well o wysokim powinowactwie wiązania (high-binding) | Corning | 3690 | Dla IL-2Rα, testy ELISA dla HGF, TNFR1 i elafiny |
| płytki Nunc MaxiSorp z 384 dołkami | Nunc | 464718 | Dla REG3α ELISA |
| HyClone roztwór soli fosforanowo-buforowany, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
| Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, poddana szokowi termicznemu | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Blokujący BLOTTO w TBS | Thermo Scientific | 37530 | Agent blokujący dla IL-2Rα Testy ELISA dla HGF i TNFR1 |
| Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco | Gibco | 21600-069 | Bufor płukący dla IL-2Rαtesty ELISA dla HGF, elafiny i TNFR1 |
| Podłoże nadtlenkowe TMB | Laboratoria Kirkegaard i Perry | 50-76-00 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Bufor płuczący dla IL-2Rα, testy ELISA dla HGF, elafiny i TNFR1 |
| Kwas siarkowy | Sigma-Aldrich | 84720 | (Rozcieńczony do 2N) jako roztwór zatrzymujący |
Bibliografia
- Paczesny, S. A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood. 113, 273-278 (2009).
- Paczesny, S. Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin. Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).
- Ferrara, J. L. Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease. Blood. , (2011).
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. Graft-versus-host disease. Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Miyamoto, T. Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).
- Holler, E. Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation. Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).
- Okamoto, T. Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).
- Uguccioni, M. Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease. Blood. 81, 2252-2256 (1993).
- Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes. J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).
- Osuchowski, M. F., Remick, D. G. The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA. Methods. 38, 304-311 (2006).
- Schweitzer, B. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie