Artykuł metodologiczny

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania zaprogramowanej śmierci komórek w zarodkach i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/4254

⸱

11 października 2012

 ,  , 
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy prosty protokół do wizualizacji regionów programowanej śmierci komórki (PCD) w zarodkach myszy i różnicowania hodowli embrionalnych komórek macierzystych (ES) za pomocą wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Programowana śmierć komórki (PCD) występuje u dorosłych w celu utrzymania normalnej homeostazy tkanek oraz podczas rozwoju embriologicznego w celu kształtowania tkanek i organów1,2,6,7. Podczas rozwoju toksyczne substancje chemiczne lub zmiany genetyczne mogą powodować wzrost PCD lub zmieniać wzorce PCD, powodując nieprawidłowości rozwojowe i wady wrodzone3-5. Aby zrozumieć etiologię tych wad, badanie zarodków można uzupełnić testami in vitro, które wykorzystują różnicujące się embrionalne komórki macierzyste (ES).

Apoptoza to dobrze zbadana forma PCD, która obejmuje zarówno wewnętrzną, jak i zewnętrzną sygnalizację w celu aktywacji kaskady enzymów kaspazy. Charakterystyczne zmiany komórkowe obejmują pęcherzyki błonowe, kurczenie się jądra i fragmentację DNA. Inne formy PCD nie obejmują aktywacji kaspazy i mogą być końcowym wynikiem przedłużonej autofagii. Niezależnie od szlaku PCD, umierające komórki muszą zostać usunięte. U dorosłych funkcję tę pełnią komórki odpornościowe, podczas gdy w zarodkach, w których układ odpornościowy jeszcze się nie rozwinął, usunięcie następuje za pomocą alternatywnego mechanizmu. Mechanizm ten polega na tym, że sąsiednie komórki (zwane "nieprofesjonalnymi fagocytami") przejmują rolę fagocytarną - rozpoznają sygnał "zjedz mnie" na powierzchni umierającej komórki i pochłaniają ją8-10. Po pochłonięciu szczątki są przenoszone do lizosomu w celu degradacji. Tak więc, niezależnie od mechanizmu PCD, wzrost aktywności lizosomalnej może być skorelowany ze zwiększoną śmiercią komórki.

Do badania PCD przydatny może być prosty test do wizualizacji lizosomów w grubych tkankach i wielowarstwowych kulturach różnicujących. Barwnik LysoTracker jest wysoce rozpuszczalną małą cząsteczką, która jest zatrzymywana w kwaśnych przedziałach subkomórkowych, takich jak lizosom11-13. Barwnik jest pobierany przez dyfuzję i przez krążenie. Ponieważ penetracja nie jest przeszkodą, możliwa jest wizualizacja PCD w grubych tkankach i kulturach wielowarstwowych12,13. W przeciwieństwie do tego, analiza TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)14 jest ograniczona do małych próbek, skrawków histologicznych i kultur jednowarstwowych, ponieważ procedura wymaga wejścia/przepuszczalności końcowej transferazy.

W przeciwieństwie do błękitu anilinowego, który dyfunduje i rozpuszcza się w rozpuszczalnikach, LysoTracker Red DND-99 jest stabilny, jasny i stabilny. Barwienie można uwidocznić za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej w całym montażu lub przekroju przy użyciu wodnych lub rozpuszczalnikowych mediów montażowych12,13. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące ten barwnik do badania PCD w normalnych i sonicznych zarodkach myszy jeżowych zerowych. Ponadto demonstrujemy analizę PCD w różnicujących się hodowlach komórek ES i przedstawiamy prostą metodę kwantyfikacji. Podsumowując, barwienie LysoTracker może być świetnym uzupełnieniem innych metod wykrywania PCD.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Barwienie zarodków myszy za pomocą LysoTracker

  1. Generuj zarodki myszy, umieszczając młode (5-6 tygodniowe) samice w klatkach dla samców. Następnego ranka należy obserwować, czy w pobliżu nie ma czopa pochwowego wskazującego, że doszło do krycia. Jeśli samica jest w ciąży, południe tego dnia nazywa się 0,5 dpc (dni po stosunku). Przedstawiona tutaj procedura jest idealna dla zarodków 7-13 dpc.
  2. W dniu zainteresowania embrionalnym poddaj samicę eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i usuń macicę. Usuń zarodki z decidua na 10 cm szalce Petriego z Hanks BSS (bez czerwieni fenolowej). Usuń błony pozazarodkowe i wykonaj co najmniej jedno płukanie za pomocą Hanks BSS, aby usunąć obce tkanki i krew.
  3. Przygotuj roztwór do barwienia zarodków LysoTracker (5 μM LysoTracker w Hanks BSS). Wygodna objętość na 1-2 kuwety myszy to 5 ml. Delikatnie wymieszaj, aby równomiernie rozprowadzić barwnik.
  4. Dodać zarodki do roztworu do barwienia zarodków LysoTracker w probówce lub fiolce do mikrofugowania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
  5. Spłucz bardzo delikatnie w Hanks BSS cztery razy po 5 minut każde pranie.
  6. Napraw 4% paraformaldehydu na noc.
  7. Spłucz raz w Hanks BSS, 10 minut, aby usunąć poprawkę.
  8. Odwodnić za pomocą serii metanolu (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min każdy krok), aby wyeliminować plamy tła. Jest to ważne dla uzyskania dobrego stosunku sygnału do szumu podczas obrazowania.
  9. W tym momencie próbki zarodków można przechowywać przez czas nieokreślony w metanolu w temperaturze -20 °C, chroniąc je przed światłem.

Uwaga: Próbka tkanki może być pobrana na dowolnym etapie genotypowania DNA, jednak najwygodniej jest pobrać próbkę tuż przed przechowywaniem, tak aby do tego etapu wszystkie próbki mogły być przetwarzane partiami. Zbierz próbkę tkanki z ogona, kończyny lub głowy z każdego zarodka i umieść ją w oddzielnych probówkach. Ponownie uwodnić próbkę tkanki i przygotować się do genotypowania.

2. Barwienie LysoTracker różnicujących się kultur ES

  1. Przygotować ciała zarodków za pomocą metody wiszącejkropli 15 z początkową gęstością 500 komórek na 20 μl kropli.
  2. Po 3 dniach przenieść ciała zarodków do hodowli zawiesinowej na 10 cm nieprzylegających szalkach Petriego (tj. używanych do prac bakteriologicznych). Hodowla przez 5 dni, zmiana pożywki co 2 dni.
  3. W 7 dniu przenieś ciała zarodków do zżelatynizowanych szkiełek 8-dołkowych (dodaj 0,1% żelatyny do komór, odczekaj 5 minut, usuń i dodaj pożywkę). Przenieś 1-2 ciała zarodkowe na komorę.
  4. Kultura przez 10 dni, zmiana podłoża co drugi dzień. Należy uważać, aby umieścić pipetę w rogu szkiełka komory, aby nie zakłócić ciała zarodka przyczepionego do szklanej powierzchni. Również podczas dodawania świeżej pożywki umieść pipetę w rogu komory i powoli uwalniaj pożywkę.
  5. Po 10 dniach hodowli, w celu wywołania apoptozy jako kontroli pozytywnej, potraktuj niektóre studzienki 0,1 mM i 1,0 mM H2O2 (dodaj H2O2 do świeżej pożywki, wymieszaj, a następnie dodaj do komórek) przez 60 minut. Spłucz dwukrotnie D-PBS i poprowadź hodowlę przez noc w zwykłej pożywce.
  6. Delikatnie odessać istniejące podłoża i dodać roztwór do barwienia komórek LysoTracker (500 nM LysoTracker (stężenie końcowe) w pożywce, 300 μl na komorę).
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  8. Spłucz dwukrotnie D-PBS 2 razy po 5 minut.
  9. Utrwal 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Spłukać dwukrotnie preparatem D-PBS, 5 min.

3. Przeglądanie zarodków barwionych LysoTracker lub kultur ES

  1. Przygotować próbki komórek do mikroskopii poprzez zasysanie D-PBS, wyjęcie komory z szkiełka, suszenie na powietrzu przez około 5 minut, a następnie dodanie wodnego podłoża montażowego (Vectashield z DAPI lub podobnym). Podczas suszenia umieść barierę foliową, aby zmniejszyć bielenie fluoroforu. Zamontuj zarodki w szklanym naczyniu z głębokim zagłębieniem lub małej szalce Petriego w Vectashield lub podobnym.
  2. Wizualizacja za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub złożonego wyposażonego w filtr z rodaminą lub czerwienią Texas (LysoTracker RED DND-99, wzbudzenie/emisja: 577/590 nm). Barwienie jest zazwyczaj dość jasne, więc długie ekspozycje zwykle nie są konieczne.

4. Kwantyfikacja wyników za pomocą technik obrazowania

  1. Rób cyfrowe zdjęcia próbek w tych samych warunkach ekspozycji w trybie ręcznym.
  2. Otwórz obrazy w programie Adobe Photoshop lub podobnym programie do obrazowania. Aby określić stopień barwienia LysoTracker, wybierz czerwony kanał i proguj obraz (konwertuje obraz na czarno-biały) tak, aby czerwone zabarwienie było teraz reprezentowane przez białe piksele. Wybierz białe piksele i użyj funkcji histogramu, aby uzyskać całkowitą liczbę.
  3. Użyj niebieskiego kanału, aby policzyć liczbę jąder w polu. Przydatne może być prowadzenie rejestru liczby poprzez dodawanie adnotacji do obrazu.
  4. Zapisz wartości, a następnie oblicz średni poziom barwienia na komórkę. Powtórz tę analizę z tym samym ustawieniem progu dla wszystkich obrazów, które chcesz próbkować.

5. Reprezentatywne wyniki

Istnieje normalny wzorzec PCD podczas rozwoju embrionalnego, który może ulec zmianie po usunięciu genu czynnika wzrostu, takiego jak Sonic hedgehog (Shh), 16,17 . Ponieważ LysoTracker jest barwnikiem drobnocząsteczkowym, który jest wysoce dyfuzyjny, cały zarodek może być wizualizowany w celu oceny obszarów PCD nawet głęboko w mezenchymie12,13. Rysunek 1 przedstawia wzór barwienia LysoTracker dla normalnych i zmutowanych zarodków myszy z mutacją Shh-/- przy 10,5 dpc. Na tym etapie PCD jest znacznie zwiększona w zarodkach z mutacją Shh-/-, szczególnie w regionach kończyn i somitów. Fragmenty zarodka mogą być obrazowane w całości w większym powiększeniu (1B) w celu oceny ogólnego wzorca. Wypreparowane części można również podzielić za pomocą wibrującego mikrotomu (1C) lub kriostatu (D-F), aby bardziej szczegółowo ujawnić obszary PCD.

Analiza TUNEL jest najlepiej wykonywana na cienkich odcinkach, gdzie penetracja transferazy końcowej jest mniej problematyczna. Barwienie LysoTracker i test TUNEL można wykonać w tej samej tkance (ryc. 1D-G). Wyniki te pokazują, że chociaż nie ma ścisłej korelacji 1:1 między barwieniem LysoTracker a barwieniem TUNEL, ogólne regiony PCD znacznie się pokrywają. Przy większym powiększeniu można zobaczyć punkty, które zabarwiają się dodatnio w teście TUNEL, ale nie w przypadku barwnika LysoTracker, puncta, które plamią tylko za pomocą barwnika LysoTracker, oraz puncta, które mają nakładające się barwienie.

Gdy EB zostanie posiany na powierzchni pokrytej żelatyną, różnicujące się komórki będą migrować na zewnątrz. Po 10 dniach hodowli komórki zróżnicują się w różne typy komórek, w tym neurony, komórki mięśniowe i kardiomiocyty. Hodowle pokazane na rysunku 2 zawierają mieszane populacje tych typów komórek, jednak można dostosować nasz protokół do badania PCD określonego typu komórek będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład EB można leczyć kwasem retinowym w celu zwiększenia różnicowania neuronów19 , a następnie test LysoTracker można wykorzystać do oceny śmierci komórek neuronalnych w różnych warunkach. W normalnej hodowli zróżnicowanych komórek ES istnieje kilka komórek, które przechodzą PCD i można je wykryć za pomocą testów LysoTracker i / lub TUNEL (Figura 2A). PCD może być indukowany przez wiele różnych czynników cytotoksycznych, takich jak nadtlenek wodoru (H2O2), który indukuje uszkodzenie oksydacyjne i inicjuje szlak apoptotyczny20,21 . Niska dawkaH2O2 zwiększa zarówno barwienie LysoTracker, jak i TUNEL w porównaniu z brakiem leczenia, podczas gdy wysoka dawka powoduje kurczenie się komórek i powszechność dodatniego wyniku LysoTracker i TUNEL. Podobnie jak w przypadku wyników na zarodku, możliwe jest zaobserwowanie punktów o dodatnim zabarwieniu w teście TUNEL, ale nie w przypadku barwnika LysoTracker, punktów barwiących tylko barwnikiem LysoTracker oraz punktów punktowych, które mają nakładające się barwienie. Konsekwencję zastosowania czynnika cytotoksycznego, który indukuje apopotozę, porównuje się do warunków głodu surowicy, które indukują autofagię (ryc. 2D). Komórki, które przeszły okres głodu surowicy (1 godzina), wykazują inny wzór, w którym barwienie LysoTracker i TUNEL nie są ze sobą silnie skorelowane. Barwienie LysoTracker jest znacznie zwiększone w porównaniu z nieleczonymi hodowlami, jednak dodatni wynik TUNEL jest na normalnym poziomie.

Korzystając ze standardowych narzędzi dostępnych w Adobe Photoshop, barwienie LysoTracker można określić ilościowo za pomocą prostej metody progowania, która pozwala obliczyć średni poziom barwienia dla populacji komórek. Rysunek 3A-B pokazuje, jak wygląda obraz próbki podczas procesu kwantyfikacji. Zaczynając od obrazu bazowego z barwieniem LysoTracker w kanale czerwonym i jądrami wybarwionymi DAPI w kanale niebieskim (panel 3A), czerwony kanał tego obrazu został progowany w celu konwersji obrazu na czarno-biały, a następnie białe piksele zostały wybrane i policzone (Rysunek 3A'). Wybrano poziom progowy, który reprezentuje wzór barwienia LysoTracker. Podobnie jak w przypadku każdej metody kwantyfikacji, która wykorzystuje obrazy, ważne jest, aby unikać prześwietlania zdjęć, ponieważ może to potencjalnie spowodować nadmierne podkreślenie różnic. Liczba jąder w polu może być następnie policzona, patrząc tylko na niebieski kanał (rysunek 3B) i oznaczając jądra za pomocą narzędzia do rysowania, takiego jak pędzel podczas liczenia (rysunek 3B'). Następnie można wyrazić poziom barwienia, obliczając średni poziom barwienia na komórkę (liczba pikseli/jąder). Jeśli ktoś chce użyć tego algorytmu do wysokoprzepustowego przesiewania, większość pakietów przesiewowych może mierzyć jasność w określonym kanale, a także ma funkcję identyfikatora obiektu, która będzie liczyć jądra w polu, jednak dla większości typowych zastosowań metoda ręczna jest szybka i prosta. Dla przykładu, obszar próbki z rysunków 2A-C został określony ilościowo, a wyniki potwierdzają, że rosnące stężeniaH2O2skutkują wyższym poziomem barwienia LysoTracker (Rysunek 3C).

Analiza rozwoju zarodka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; Wpływ ścieżki Shh; LysoT, TUNEL, scalenie.
Rysunek 1. Barwienie LysoTracker w zarodkach normalnych i Shh-/-. A,A'. Normalne i mysie zarodki Shh-/- w temperaturze 10,5 dpc, wybarwione LysoTracker Red, zamontowane w Vectashield i sfotografowane pod mikroskopem preparacyjnym epifluorescencji. Nawiasy wskazują położenie kończyn przednich. B,B". Kończyny przednie zarodków prawidłowych i Shh-/- zobrazowane w większym powiększeniu. Zwróć uwagę na normalne domeny śmierci komórki, w tym "tylną strefę martwiczą" (oznaczoną gwiazdką) i obszar w proksymalnej mezenchymie pączka kończyny (oznaczony strzałką). Kończyny Shh null wykazują silniejsze zabarwienie w części przyśrodkowej i dystalnej. C,C'. Odcinki przyśrodkowe przez pączek kończyn przednich zarówno normalnych, jak i zerowych. Zwróć uwagę na obecność barwienia w proksymalnej mezenchymie (strzałka) i AER (grot strzałki) normalnego pąka kończyny oraz silne zabarwienie w mezenchymie grzbietowej i brzusznej oraz dystalnej w obrębie pąka kończyny zerowej. D-F. Ten sam przekrój (12 mikronów, przekrój zamrożony) został zobrazowany pod kątem barwienia LysoTracker i TUNEL (Roche 1684795). Przekrój przechodzi przez dystalną część mezenchymy zerowej Shh. Grot strzałki wskazuje AER. Zwróć uwagę, że ogólny wzór jest bardzo podobny przy użyciu obu metod, jednak barwienie nie nakłada się całkowicie. G,G'. Przy większym powiększeniu AER i mezenchymy można zobaczyć zarówno obecność puncta, które są tylko LysoTracker lub TUNEL-dodatnie, jak i puncta, które mają nakładające się barwienie.

Wyniki testu immunofluorescencyjnego; wykrywanie apoptozy za pomocą testu TUNEL; Porównanie zabiegów komórkowych.
Rysunek 2. Barwienie LysoTracker w zróżnicowanych komórkach ES. Komórki różnicujące się posiewano na szkiełkach 8-komorowych przy braku LIF. Aby pokazać, jak wypada porównanie barwienia LysoTracker i TUNEL, szlak apoptozy indukowano za pomocą 2 różnych dawekH2O2, podczas gdy szlak autofagii indukowano za pomocą 1 godziny głodu surowicy. Zdjęcia te wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM5. A-A'': Nieleczone kultury wykazują normalną apoptozę, na co wskazuje barwienie LysoTracker i TUNEL. Wzór wykorzystujący obie techniki w większości nakłada się na siebie (białe strzałki), jednak można zobaczyć kilka punktów, które są dodatnie tylko dla LysoTrackera (czerwone strzałki). B-B'', C-C": Leczenie zwiększającymi się ilościamiH2O2stymuluje apoptozę. Niższa dawka wykazuje więcej LysoTracker i TUNEL dodatnich punktów w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Wyższa dawka indukuje jeszcze więcej LysoTracker i TUNEL dodatniego puncta. Białe strzałki wskazują na nakładające się barwienie, podczas gdy czerwone strzałki wskazują na punkt, który jest dodatni tylko dla LysoTracker. Możliwe jest również zobaczenie puncta, które są dodatnie tylko dla barwienia TUNEL (zielone strzałki). D-D": Głód surowicy może indukować autofagię, która może stymulować akumulację materiału w lizosomach i autofagolizosomach. Zwróć uwagę, o ile więcej LysoTracker puncta jest widocznych w porównaniu z nieleczonymi posiewami. Obecne są punkty dodatnie TUNEL (z których większość ma nakładające się na siebie barwienia LysoTracker, białe strzałki), jednak liczba ta nie jest znacznie zwiększona w porównaniu z nieleczonymi stanami. Ponadto, w warunkach głodu surowicy, bardzo rozpowszechnione są dodatnie punkty tylko LysoTracker (czerwone strzałki).

Barwienie lizosomalne mikroskopia fluorescencyjna; wizualizacja jąder; Odpowiedź H2O2; wykres ilościowy.
Rysunek 3. Metoda kwantyfikacji służąca do oceny poziomu barwienia w populacji komórek za pomocą programu Adobe Photoshop. O: Wybrano część rysunku 2A, a na tym panelu pokazano LysoTracker (kanał czerwony) i barwienie DAPI (jądra, kanał niebieski). A': Czerwony kanał na rysunku 3A został przesunięty w celu przekształcenia go w obraz czarno-biały. Białe piksele można następnie wybrać i policzyć za pomocą funkcji histogramu. B-B': Niebieski kanał pokazuje jądra i podczas ich liczenia obraz może być opisywany za pomocą funkcji rysunkowej, takiej jak pędzel. Ład: Jest to przykładowa kwantyfikacja próbki z paneli 2A-C. Dane są reprezentowane w pikselach na jądra. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do ważnych cech charakterystycznych apoptozy należy wykrywanie uszkodzeń DNA za pomocą testu TUNEL, wraz z wykrywaniem aktywności kaspazy (wykrywanej za pomocą mAb lub cząsteczki wiążącej, takiej jak ZVAD-fmk), obserwacja zmian komórkowych oraz prezentacja fosfatydyloseryny (PS) na powierzchni błony (wykrywanej przez wiązanie aneksyny V). Każdy z tych testów ma pewne wady. Na przykład transferaza końcowa stosowana w teście TUNEL nie przenika dalej niż do kilku warstw komórek. Aneksyna V może również oznaczać komórki, któ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Mariani za pomoc w edycji protokołu. Praca ta została sfinansowana przez CIRM Postdoctoral Training Grant (JLF), staż CIRM BRIDGES (TZTT), Fundację Roberta E. i May R. Wright (FVM) oraz Uniwersytet Południowej Kalifornii (FVM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Przepisy na roztwory

4% Paraformaldehyd

Dla 100 ml:

  1. Mix 4 g paraformaldehydu, 90 ml H2O, i NaOH (kropla 2N NaOH). Paraformaldehyd nie przejdzie do roztworu, dopóki nie dodasz trochę NaOH w celu zwiększenia pH.
  2. Mieszaj i podgrzewaj w temperaturze 60 & stopni; C, aż cały proszek znajdzie się w roztworze (~10-20 min). Nie przegrzewać.
  3. Dodać ~10 ml 10x PBS, aby uzyskać końcową objętość 100 ml.
  4. Przechowywać w temperaturze -20 ° C w wygodnych (~10 ml lub ~40 ml) aliquots.

UWAGA: Paraformaldehyd w formie "falbanki" (sprasowane małe granulki) jest mniej sproszkowany i dlatego można go mierzyć poza kapturem. Jednak nadal należy nosić ochronną maskę przeciwpyłową (co najmniej N95) podczas obsługi.

EB Culture Media

Dla 500 ml EB Media:

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LysoTracker Red DND-99Invitrogen#L-7528
HanksBSS Invitrogen14025-076
ParaformaldehydEMDEM-PX0055-3
VectashieldVECTORH-1200
DMEMCellgro10-013-CV
Aminokwasy endogenneCellgro25-025-CI
Pirogronian soduCellgro25-000-CI
FBSHyclonSH30071.02
Pen-StrepInvitrogen15140-122
b-Mercapt– tanol, 50 mM Invitrogen21985-023
LabTek-II Szkiełka komorowe
(8-dołkowe)		Nalge Nunc International154534
0,1% milipore żelatynyES-006-B
Dulbecco's PBS (D-PBS) Cellgro21-031-CV
<td colspan="4">
DMEM: 404.5 ml
FBS:75.0 ml
L-glutamina:5,0 ml
Penicylina/Streptomycyna: 5,0 ml
Aminokwasy endogenne:5,0 ml
Pirogronian sodu:5,0 ml
β-Mercapt– Tanol: 500 i mu; l

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
  2. Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
  3. Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
  4. Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
  5. Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
  6. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  7. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  8. Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
  9. Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
  10. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
  11. Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
  12. Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
  13. Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
  14. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
  15. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).
  16. Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
  17. Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
  18. Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
  19. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  20. Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
  21. Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
  22. Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
  23. Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
  24. Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
  25. Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
  26. Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
  27. Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  28. Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

LysoTracker StainingProgrammed Cell DeathMouse EmbryosEmbryonic Stem CellsFluorescent MicroscopyConfocal MicroscopyLysosomal ActivityCell Death DetectionHydrogen Peroxide TreatmentSonic Hedgehog Mutant

Powiązane artykuły