Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Podsumowanie

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Streszczenie

Programowana śmierć komórki (PCD) występuje u osobników dorosłych w celu utrzymania prawidłowej homeostazy tkanek oraz podczas rozwoju embrionalnego w celu formowania tkanek i narządów^1,2,6,7. W trakcie rozwoju substancje toksyczne lub zmiany genetyczne mogą spowodować zwiększenie poziomu PCD lub zmianę wzorców PCD, co prowadzi do anomalii rozwojowych i wad wrodzonych^3-5. Aby zrozumieć etiologię tych wad, badania embrionów można uzupełnić o testy in vitro z wykorzystaniem różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Apoptoza jest dobrze przebadaną formą PCD, która angażuje zarówno wewnątrzkomórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne w celu aktywacji kaskady enzymatycznej kaspaz. Charakterystyczne zmiany komórkowe obejmują pęcherzykowanie błony komórkowej, kondensację jądra komórkowego oraz fragmentację DNA. Inne formy PCD nie wiążą się z aktywacją kaspaz i mogą być końcowym wynikiem przedłużonej autofagii. Niezależnie od szlaku PCD, obumarłe komórki muszą zostać usunięte. U osobników dorosłych funkcję tę pełnią komórki odpornościowe, natomiast w embrionach, gdzie układ odpornościowy nie jest jeszcze rozwinięty, usuwanie odbywa się poprzez alternatywny mechanizm. Mechanizm ten polega na tym, że sąsiednie komórki (zwane „niefagocytarnymi fagocytami”) przejmują rolę fagocytarną – rozpoznają sygnał „zjedz mnie” na powierzchni obumierającej komórki i pochłaniają ją^8-10. Po pochłonięciu szczątki są transportowane do lizosomów w celu degradacji. Zatem niezależnie od mechanizmu PCD, wzrost aktywności lizosomalnej może być skorelowany ze zwiększoną śmiercią komórek.

Aby badać PCD, użytecznym może być prosty test do wizualizacji lizosomów w grubych tkankach i wielowarstwowych kulturach różnicujących się. Barwnik LysoTracker jest wysoce rozpuszczalną małą cząsteczką, która kumuluje się w kwaśnych przedziałach podkomórkowych, takich jak lizosomy^11-13. Barwnik jest pobierany przez dyfuzję oraz poprzez krążenie. Ponieważ penetracja nie stanowi przeszkody, możliwa jest wizualizacja PCD w grubych tkankach i kulturach wielowarstwowych^12,13. W przeciwieństwie do tego, analiza TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)¹⁴ jest ograniczona do małych próbek, skrawków histologicznych i kultur monowarstwowych, ponieważ procedura ta wymaga przenikania terminalowej transferazy.

W przeciwieństwie do błękitu anilinowego, który dyfunduje i rozpuszcza się w rozpuszczalnikach, LysoTracker Red DND-99 jest utrwalny, jasny i stabilny. Barwienie można wizualizować przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej w preparatach całych obiektów lub w przekrojach, stosując wodne lub rozpuszczalnikowe media montażowe^12,13. Opisujemy tutaj protokoły z wykorzystaniem tego barwnika do badania PCD w prawidłowych embrionach myszy oraz embrionach z mutacją null w genie sonic hedgehog. Ponadto demonstrujemy analizę PCD w różnicujących się kulturach komórek ES i przedstawiamy prostą metodę ilościową. Podsumowując, barwienie LysoTrackerem może stanowić doskonałe uzupełnienie innych metod wykrywania PCD.

Protokół

1. Barwienie zarodków myszy barwnikiem LysoTracker

1. Uzyskaj zarodki mysie, umieszczając młode samice (w wieku 5-6 tygodni) w klatkach z samcami. Monitoruj kolejnych poranków obecność czopa pochwowego, co wskazuje na zajście zapłodnienia. Jeśli samica jest w ciąży, południe tego dnia określa się jako 0,5 dpc (dni po kopulacji). Przedstawiona procedura jest optymalna dla zarodków w wieku 7-13 dpc.
2. W interesującym dniu rozwoju embrionalnego uśmierć samicę zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i usuń macicę. Wyjmij zarodki z błony decydualnej do 10 cm czystej płytki Petri z Hanks BSS (bez czerwieni fenolowej). Usuń błony pozazarodkowe i wykonaj c....

Dyskusja

Ważnymi cechami charakterystycznymi dla apoptozy są: wykrycie uszkodzeń DNA za pomocą testu TUNEL, wykazanie aktywności kaspaz (wykrywanej za pomocą przeciwciał monoklonalnych lub cząsteczki wiążącej, takiej jak ZVAD-fmk), obserwacja zmian komórkowych oraz obecność fosfatydyloseryny (PS) na powierzchni błony (wykrywana poprzez wiązanie Annexiny V). Każda z tych metod posiada pewne ograniczenia. Na przykład transferaza końcowa stosowana w teście TUNEL nie przenika głębiej niż przez kilka warstw komórek. Ponadto Annexina V.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Sól zrównoważona Hanksa (Hanks BSS)	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyd	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	WEKTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Niezbędne aminokwasy niepodstawowe	Cellgro	25-025-CI
pirowinian sodu	Cellgro	25-000-CI
płytki surowicy wołowej (FBS)	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
$\beta$-merkaptoetanol–etanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
Slajdy z komorkami LabTek-II (8-dołkowa)	Nalge Nunc International	154534
0,1% żelatyny	Millipore	ES-006-B
bufor fosforanowy Dulbecco (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
Sposoby przygotowania roztworów 4% Paraformaldehyd Dla 100 ml: Zmieszać 4 g paraformaldehydu, 90 ml H2O oraz NaOH (kropla 2N NaOH). Paraformaldehyd nie rozpuści się do momentu dodania NaOH w celu zwiększenia pH. Mieszać i podgrzewać do 60°C °Mieszać, aż cały proszek rozpuści się w roztworze (~10-20 min). Nie przegrzewać. Dodać ok. 10 ml 10x PBS, aby uzyskać objętość końcową 100 ml. Przechowywać w temperaturze -20°C °C w wygodnych alikwotach (~10 ml lub ~40 ml). OSTRZEŻENIE: Paraformaldehyd w formie „frill” (prasowane małe pellety) mniej pyli, dlatego jego odważanie może odbywać się poza dygestorium. Niemniej jednak podczas pracy z tym odczynnikiem należy nadal stosować ochronną maskę przeciwpyłową (co najmniej N95). Pożywka do hodowli ciałek zarodkowych (EB) Do przygotowania 500 ml pożywki EB:
DMEM:	404,5 ml
FBS:	75,0 ml
L-glutamina:	5,0 ml
Penicylina/Streptomycyna:	5,0 ml
Aminokwasy niezasadnicze:	5,0 ml
Pirowinian sodu:	5,0 ml
β-Mercapto–etanol:	500 μl