Modele przerzutów do kości

Podsumowanie

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Streszczenie

Przerzuty do kości są częstym zjawiskiem w kilku typach nowotworów złośliwych, w tym w raku piersi, prostaty i płuc. Po uplasowaniu się w kościach, guzy odpowiadają za znaczną chorobowość i śmiertelność¹. Istnieje zatem ogromna potrzeba zrozumienia mechanizmów molekularnych kontrolujących powstawanie, wzrost i aktywność guzów w tkance kostnej. W celu badania tych zdarzeń opracowano kilka modeli in vivo, z których każdy posiada specyficzne zalety i ograniczenia. Najczęściej stosowany model wykorzystuje inokulację wewnątrzsercową komórek nowotworowych bezpośrednio do krwiobiegu tętniczego myszy BalbC beztymusowych (nude). Procedurę tę można zastosować do wielu różnych typów guzów (w tym raka prostaty PC-3, raka płuc oraz guzów tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy); w niniejszym opracowaniu skupimy się jednak na modelu raka piersi MDA-MB-231. W tym modelu wykorzystujemy klon o wysokiej selektywności względem kości, pierwotnie wyizolowany w grupie dr Mundy'ego w San Antonio², który został następnie przetransfekowany w celu ekspresji GFP i ponownie wyklonowany przez naszą grupę³. Klon ten jest wariantem przerzutowym do kości o wysokim stopniu osteotropizmu i bardzo niskiej częstości przerzutów do płuc, wątroby lub nadnerczy. Choć iniekcje wewnątrzsercowe są najczęściej stosowane w badaniach nad przerzutami do kości², w pewnych przypadkach bardziej odpowiednie są iniekcje wewnątrzpiszczelowe⁴ lub do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego. Iniekcje wewnątrzsercowe wykonuje się zazwyczaj przy użyciu ludzkich komórek nowotworowych w celu monitorowania późniejszych etapów przerzutowania, a konkretnie zdolności komórek rakowych do zatrzymania się w kości, przeżycia, proliferacji i tworzenia guzów, które rozwijają się w nowotworową chorobę kości. Iniekcje wewnątrzpiszczelowe wykonuje się, jeśli celem jest zbadanie relacji między komórkami rakowymi a kością po tym, jak guz przemieścił się do kości, co mniej więcej odpowiada ugruntowanej przerzutowej chorobie kości. Żaden z tych modeli nie odtwarza wczesnych etapów procesu przerzutowania poprzedzających zator i wniknięcie komórek nowotworowych do krwiobiegu. Jeśli celem jest monitorowanie wzrostu guza pierwotnego lub przerzutowania z miejsca pierwotnego do kości, zazwyczaj preferowane są inokulacje do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego; jednak bardzo niewiele linii komórek nowotworowych konsekwentnie przerzuca się do kości z miejsca pierwotnego, z wyjątkiem klonów 4T1 o preferencji kostnej, pochodzących z raka gruczołu mlekowego myszy ^5,6.

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury inokulacji oraz podkreśla kluczowe etapy analiz prowadzonych po inokulacji. W szczególności obejmuje on hodowlę komórkową, procedury inokulacji komórek nowotworowych drogą wewnątrzsercową i wewnątrzpiszczelową, a także zwięzłe informacje dotyczące cotygodniowego monitorowania za pomocą promieni rentgenowskich, fluorescencji oraz analiz histomorfometrycznych.

Protokół

1. Hodowla komórek

1. Istnieje wiele subklonów MDA-MB-231 tworzących przerzuty do kości, które wykazują różną skłonność do kolonizacji i wzrostu w tkance kostnej. W naszych eksperymentach wykorzystujemy klon pochodzący z linii MDA-MB-231 z markerem GFP opracowanej w UTHSCA ². Ten konkretny subklon tworzy widoczne osteolityczne zmiany kostne około 3 tygodnie po inokulacji, a uśmiercanie zwierząt następuje w 4. tygodniu.
2. Komórki należy hodować w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS oraz 0,1 mg/ml penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5-8% CO₂⁷.
3. Przesiewanie komórek należy przeprowadzać przy 80-90% konfluencji i ponowne wysiewać w rozcieńczeniu 1:10 (wartość ta różni się w zależności od typu komórek i rozmiaru płytki; dla komórek MDA-MB-231 w naczyniu T-75 jest to około 6x10⁵), co odbywa się mniej więcej co 72 h.
4. Komórki MDA-MB-231 zachowują zazwyczaj wygląd fibroblastyczny z licznymi pseudopodiami. Jakiekolwiek zaokrąglenie komórek świadczy o zbyt dużym zagęszczeniu lub innym niepożądanym stresie i należy go unikać, ponieważ może to wpłynąć na potencjał metastatyczny in vivo.
5. Idealnie komórki powinny być utrzymywane w kulturze tylko przez krótki czas przed inokulacją (zalecamy mniej niż 1 tydzień lub do momentu uzyskania wystarczającej liczby komórek do eksperymentu), a w przypadku zaokrąglenia komórek lub zmian w tempie ich wzrostu należy rozmrozić nową ampułkę.

2. Przygotowanie komórek

1. Przeprowadzić trypsynizację komórek przy 80-90% konfluencji, używając 0,15% Trypsyny/EDTA (rozcieńczyć 0,5% Gibco Trypsin EDTA w stosunku 1:2 w PBS). Stężenie to umożliwia szybkie odklejenie komórek (<2 min) i ogranicza ich agregację.
2. Niezwłocznie zebrać komórki z płytki, dodając 10 ml schłodzonego do temperatury lodowej DMEM zawierającego 10% FBS, przenieść pipetą do probówki stożkowej 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 min.
3. Resuspendować osad w probówce stożkowej 50 ml w 25 ml schłodzonego do temperatury lodowej PBS (bez Ca i Mg) i przeprowadzić zliczenie.
4. Wirować w celu ponownego zebrania osadu, a następnie resuspendować w schłodzonym do temperatury lodowej PBS do stężenia 10⁶ komórek na ml (do iniekcji wewnątrzsercowych) lub 250 000 komórek/10 μl (do iniekcji wewnątrzpiszczelowych). Temperatura PBS jest istotna, aby zapobiec agregacji komórek i następczej embolii po iniekcji. Zawiesina komórkowa powinna pozostawać w lodzie podczas wykonywania iniekcji; komórki pozostają żywotne i nieagregowane przez 30 min. Choć dokładna liczba potrzebnych płytek zależy od badacza, zazwyczaj jedna płytka T-75 wystarcza dla 8-10 myszy.

3. Inokulacja wewnątrzsercowa

1. Do tych eksperymentów wykorzystuje się samice myszy w wieku 4-6 tygodni (Foxn nu-/-: Harlan), choć w eksperymentach z ludzkimi komórkami nowotworowymi można stosować również inne myszy z niedoborami odporności (RAG1-/-, RAG2-/-, SCID, XID itd.).
2. Myszy nude powinny być karmione dietą Teklad 2920x na 5-10 dni przed iniekcją, aby zmniejszyć śmiertelność wynikającą z procedury wstrzykiwania oraz ograniczyć fluorescencję tła w procedurach obrazowania (ponieważ karma jest wolna od lucerny).
3. W przypadku stosowania myszy innych niż nu/nu, przed rozpoczęciem procedury należy usunąć sierść z brzusznej części jamy brzusznej poprzez golenie lub użycie preparatu Nair (według naszych doświadczeń Nair działa lepiej).
4. Mysz należy znieczulić w komorze izolacyjnej przy użyciu waporyzatora izofluranu (2,5% Iso: 2-3 L/min O₂) lub innej preferowanej metody znieczulenia (według naszych doświadczeń izofluran jest najlepiej tolerowany podczas inokulacji wewnątrzsercowych).
5. Przenosi się pojedynczo każdą mysz do maski urządzenia do znieczulania wewnątrz wentylowanego kaptura ze stali nierdzewnej.
6. Każdą mysz należy ułożyć na grzbiecie, klatką piersiową do góry.
7. Klatkę piersiową należy przemyć tamponem lub roztworem 10% powidonu z jodem, a następnie 70% etanolem, powtarzając czynność 2 razy.
8. Miejsce iniekcji na klatce piersiowej myszy należy zaznaczyć (używając sterylnego markera lub zaznaczając punkt nieco z boku, aby zachować sterylność miejsca wstrzyknięcia). Stosujemy oznaczenie w połowie odległości między wcięciem mostka a górną krawędzią wyrostka mieczowatego, lekko na lewo (anatomicznie) od mostka. Do strzykawki insulinowej 300 μl 28 g ½ należy nabrać małą pęcherzyk powietrza, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem (co jest istotne dla obserwacji tętna serca), a następnie nabrać 100 μl zawiesiny komórek.
9. Igłę należy trzymać pionowo. Napinając skórę myszy drugą ręką, należy wprowadzić igłę.
10. Prawidłowe wprowadzenie igły do lewej komory serca powinno skutkować wyraźnym, jasnoczerwonym impulsem krwi w strzykawce. Na tej głębokości należy ostrożnie docisnąć tłok strzykawki (objętość 100 μl), unikając znaczących ruchów igły, aby nie przebić serca i nie wylać komórek do jamy klatki piersiowej.
11. Po wstrzyknięciu komórek należy lekko cofnąć tłok, aby wytworzyć niewielkie podciśnienie, co ograniczy wyciekanie komórek do jamy klatki piersiowej.
12. Igłę należy wyciągnąć bezpośrednio z klatki piersiowej, dbając o to, aby nie przechylać jej podczas usuwania, co mogłoby rozerwać ścianę serca i spowodować krwawienie.
13. Należy delikatnie ucisnąć klatkę piersiową w miejscu iniekcji, aby zahamować krwawienie.
14. Mysz należy wyjąć z maski i kontynuować lekki ucisk przez około 1 min.
15. Mysz należy przenieść na matę grzewczą do czasu odzyskania pełnej świadomości.
16. Jeśli po wybudzeniu mysz zaczyna wirować lub drżeć, prawdopodobną przyczyną jest zator. Należy wstrzyknąć myszy doprzebytonowo 80-120 mg/kg ketaminy, aby zwiększyć przepływ krwi i rzut serca przy jednoczesnym zmniejszeniu oporu naczyniowego. Powinno to pomóc myszy w usunięciu skrzepu. W takiej sytuacji zaleca się wymianę preparatu komórkowego, ponieważ świadczy to o agregacji komórek. Wymieniamy preparaty komórkowe mniej więcej co 8 myszy lub co 30 min.

4. Wewnątrzpiszczelowe

1. Bezpośrednio przed zabiegiem wstrzyknąć myszy Buprenex (0.1 mg/kg) lub inny zatwierdzony lek przeciwbólowy.
2. Uśpić mysz przy użyciu izofluranu, następnie przenieść pod maskę nosową i podtrzymać znieczulenie.
3. Oczyścić obie kończyny za pomocą tamponu lub roztworu 10% powidonu z jodem, a następnie etanolu, powtarzając czynność 2 razy. Jeśli kończyny są owłosione, należy je depilować (używając preparatu Nair lub podobnego) przed oczyszczaniem.
4. Delikatnie uchwycić kostkę boczną, kostkę przyśrodkową i dolną połowę piszczeli palcem wskazującym i kciukiem, a następnie zgiąć nogę (połączenie zgięcia i rotacji bocznej w taki sposób, aby kolano było widoczne i dostępne).
5. Zwilżyć skórę 70% EtOH, aby zwiększyć widoczność leżącego pod nią więzadła rzepki, które powinno być widoczne jako wyraźna, gruba, biała linia. Trzymając mocno kostkę/nogę myszy, wprowadzić igłę 28g ½ pod rzepkę, przez środek więzadła rzepki do przedniej części obszaru międzykłykciowego w górnej części piszczeli.
6. Podczas wprowadzania igły do piszczeli ostrożnie przeprowadzić ją przez płytkę wzrostu, stosując stały, mocny nacisk z lekkim ruchem świdrującym.
7. Po przebiciu płytki wzrostu piszczeli opór podczas wprowadzania igły znacznie zmaleje.
8. Zastosować delikatny ruch boczny igły, aby upewnić się, że znajduje się ona w piszczeli i przeszła przez płytkę wzrostu. Jeśli igła znajduje się w odpowiednim miejscu w piszczeli, ruch ten będzie ograniczony.
9. Powoli nacisnąć tłok, aby wstrzyknąć 10 μl zawiesiny komórkowej. Na tym etapie opór powinien być znikomy lub żaden.
10. Powoli wyciągnąć igłę.
11. Postępując zgodnie z tą samą procedurą, przejść do następnej nogi i wstrzyknąć 10 μl PBS.
12. Wybudzić mysz z narkozy i trzymać na podgrzewaczce aż do pełnego odzyskania sprawności.
13. Monitorować myszy przez następne 24 hr i wstrzykiwać dodatkowy Buprenex co 12 hr, jeśli zwierzęta nadal będą wykazywać oznaki stresu.

5. Obrazowanie w serii czasowej

1. Obrazowanie lucyferazowe: W stosownych przypadkach obrazowanie lucyferazowe należy stosować począwszy od 7. dnia po inokulacji komórek nowotworowych (choć w większości modeli przerzutów do kości sygnał jest wykrywalny bliżej 14. dnia). Myszy podaje się dootrzewnowo 150 mg/kg lucyferyny, następnie zwierzęta są znieczulane i poddawane obrazowaniu 8 min po iniekcji przy użyciu systemu IVIS ⁸.
2. Obrazowanie GFP: Zazwyczaj guzy wykazujące ekspresję GFP stają się wykrywalne około 10–14. dnia w przypadku iniekcji do piszczeli oraz 16–21. dnia w eksperymentach z iniekcją wewnątrzsercową przy użyciu systemu obrazowania Maestro (CRi) ⁹. W skrócie, myszy są znieczulane izofluranem (3%) i utrzymywane w znieczuleniu poprzez stożek nosowy w komorze obrazowania Maestro. Dla naszych komórek wykazujących ekspresję eGFP stosujemy zestaw filtrów niebieskich (pobudzenie 498/emisja 515 dla eGFP) przy czasie ekspozycji 500 ms w krokach 10 nm.
3. Faxitron (RTG): Zdjęcia rentgenowskie wykonuje się co tydzień, zaczynając od okresu między 7. a 14. dniem. Zmiany będą widoczne w modelu wewnątrzsercowym w 21. dniu, a tydzień wcześniej w przypadku iniekcji do piszczeli³. Nasze dane radiologiczne ex vivo i in vivo zostały pozyskane przy użyciu urządzenia Faxitron LX-60 przy 35 kV i czasie ekspozycji 8 sekund.
4. Inne metody obrazowania: Metody obrazowania będą całkowicie zależne od specyfiki badania. Oprócz powyższych metod, cenne informacje może dostarczyć obrazowanie żywych zwierząt w oparciu o mikrotomografię komputerową 3D (μCT), mikrotomografię emisyjną pozytonów (μPET) oraz inne modalności ^10,11.

6. Uśmiercenie myszy

1. Każdy model charakteryzuje się nieco innym przebiegiem czasowym. W przypadku komórek MDA-MB-231 myszy zazwyczaj zapadają na kacheksję lub stają się paraplegiczne między 21. a 35. dniem, zazwyczaj około 28. dnia (myszy po wstrzyknięciu IT między 21. a 28. dniem).
2. Gdy u kilku myszy rozwiną się zmiany, które zaczynają przebijać się przez kość korową, wystąpi paraplegia lub nastąpi utrata od 10-20% masy ciała, należy uśmiercić wszystkie myszy w badaniu poprzez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny z dyslokacją szyjną (lub inną metodą zatwierdzoną przez IACUC).
3. Należy pobrać kości niezbędne do dalszych badań i przechowywać je w buforowanym 4% formalinie.
4. Myszy z guzami w klatce piersiowej są oznaką błędnego wstrzyknięcia i powinny zostać wykluczone z badania.

7. Analiza Ex Vivo

1. μCT: skanowanie w 70% EtOH umożliwia pomiar parametrów strukturalnych i histologicznych na tym samym preparacie kostnym.
2. Wykonaj konturowanie i analizę zgodnie z indywidualnym planem eksperymentalnym i dostępnym sprzętem¹⁰. Nasze dane uzyskano za pomocą Scanco μCT 40 przy rozdzielczości 12 μM.
3. Histo-morfometria: Przetwórz preparaty przy użyciu preferowanych metod histologicznych i zabarw hematoksyliną i eozyną⁷

8. Reprezentatywne wyniki

Po inokulacji komórek nowotworowych dojamionowo lub doszpikowo do kości piszczelowej (Rysunek 1), myszy są monitorowane co tydzień za pomocą radiografii oraz fluorescencji (lub luminescencji). Zmiany stają się zazwyczaj widoczne w promieniach rentgenowskich między 2. a 3. tygodniem, natomiast w fluorescencji i luminescencji mogą być widoczne już w 2. tygodniu, w zależności od modelu (Rysunek 2). Zmiany są widoczne jako ciemne ubytki w kości i z czasem stają się bardziej wyraźne (Rysunek 3). Ilość zmian określono za pomocą analizy radiogramów w programie Metamorph, a fluorescencję za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazowania Maestro (CRi). W miarę wzrostu zmian u myszy często rozwija się kacheksja. Eutanazja jest wymagana, gdy myszy utracą od 10-20% początkowej masy ciała. Stan myszy może zmieniać się gwałtownie i musi być monitorowany wielokrotnie w ciągu dnia. Między 3. a 4. tygodniem myszy zaczęły ciągnąć jedną lub obie kończyny tylne, po czym dokonano eutanazji wszystkich zwierząt w badaniu. Obrazy wykonano przed eutanazją. Po przedawkowaniu znieczulenia pobrano krew w celu pomiaru markerów przebudowy kości lub innych czynników. Po zwichnięciu stawu obręczy karkowej usunięto skórę myszy, a kości wycięto i oczyszczono do obrazowania ex vivo (Rysunek 3), co pozwala na wizualizację ognisk nowotworowych co najmniej 7 dni wcześniej niż techniki obrazowania in vivo. Po zakończeniu obrazowania kości umieszczono w oznakowanych kasetach i przechowywano w formalinie w celu utrwalenia i dalszego przetwarzania histologicznego lub analizy μCT. Na próbkach wykonano histomorfometrię w celu określenia obciążenia nowotworowego oraz BV/TV, a następnie przeprowadzono μCT kości piszczelowej, aby określić stopień destrukcji kości (Rysunek 4).

Rysunek 1. Prawidłowe rozmieszczenie miejsca iniekcji. Radiograficzny widok brzuszny (A) klatki piersiowej dorosłej myszy przedstawiający prawidłowe umieszczenie igły w 4^tej przestrzeni międzyżebrowej i w lewej komorze w celu inokulacji wewnątrzsercowej. Punkty orientacyjne anatomiczne zaznaczono poziomymi liniami przerywanymi na mostku (obrysowanym na biało). Na skórze myszy punktami orientacyjnymi są wcięcie mostka oraz wyrostek mieczowaty, a igłę wprowadza się nieco na lewo od mostka. Radiograficzny widok brzuszny (B) nogi dorosłej myszy przedstawiający prawidłowe umieszczenie igły w bliższej części kości piszczelowej, wyrównanej pomiędzy kłykciami. Z perspektywy bocznej końcówka igły jest umieszczona za guzowatością piszczeli i głęboko względem płytki nasadowej. Idealne miejsce iniekcji zaznaczono białym okręgiem.

Rysunek 2. Przebieg czasowy modeli przerzutów do kości. Progresja nowotworowej choroby kości przedstawiona na zdjęciach rentgenowskich i obrazach fluorescencyjnych GFP+ guzów in vivo po wstrzyknięciach wewnątrzpiszczelowych (A) oraz wewnątrzsercowych (B).

Rycina 3. Przebieg czasowy modelu wewnątrzsercowego MDA-MB-231. Górny rząd: Obraz ex vivo pokazujący fluorescencję GFP w dniu 0, 14, 21 i 28 po wewnątrzsercowym wstrzyknięciu MDA-MB-231. Należy zauważyć, że ogniska nowotworowe w dniu 14 są widoczne ex vivo dopiero po usunięciu tkanek miękkich. Dolny rząd: Radiograficzne obrazy ex vivo tych samych kości udowych ilustrujące osteolityczne zmiany kostne. Należy zauważyć, że destrukcja kości zazwyczaj nie jest widoczna przed upływem 3 tygodni od wstrzyknięcia do serca.

Rycina 4. Kwantyfikacja progresji przerzutów do kości. Guz GFP+ zwizualizowany za pomocą obrazowania Maestro ex vivo kości piszczelowych myszy bez guza (A) oraz myszy 4 tygodnie po wewnątrzsercowym wstrzyknięciu subklonu MDA-MB-231 wykazującego ekspresję GFP (B). Ogniska nowotworowe korelują z obszarami destrukcji kości, co pokazano za pomocą Faxitron (D) w porównaniu do kości bez guza (C). Dane strukturalne i mineralne kości z pomiarów mikro-TK przedstawiono jako obrazy 3D zdrowej kości (E) oraz kości z guzem (F), gdzie obszary destrukcji kości są widoczne jako puste przestrzenie. Dalsze szczegóły kości i guza widoczne są na odpowiadających im przekrojach histologicznych barwionych H&E (G i H).

Dyskusja

Badania nad chorobami kości indukowanymi przez nowotwory opierają się na kilku modelach zwierzęcych, z których dwoma najczęściej stosowanymi są inokulacje wewnątrzsercowe i wewnątrzpiszczelowe. W wielu przypadkach inokulacja wewnątrzsercowa jest najlepszą opcją do badania przerzutów do kości; nie odzwierciedla ona jednak pełnego procesu metastazy, dlatego w tym celu najlepiej stosować iniekcje do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego lub inne iniekcje ortotopowe. W większości badań z wykorzystaniem ludzkich komórek kom...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231	Pierwotnie ATCC – klonowane i selekcjonowane wewnętrznie
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
Trypsyna	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
Skaner μCT	Scanco
Myszy nago athymiczne	Harlan	Fox nu -/-
Strzykawki insulinowe (300 μl, 28,5 g)	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
Naświetlona dieta dla gryzoni	Teklad	2920x