Modele przerzutów do kości

Podsumowanie

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Streszczenie

Przerzuty do kości są częstym zjawiskiem w kilku typach nowotworów złośliwych, w tym w raku piersi, prostaty i płuc. Po uplasowaniu się w kościach, guzy odpowiadają za znaczną chorobowość i śmiertelność¹. Istnieje zatem ogromna potrzeba zrozumienia mechanizmów molekularnych kontrolujących powstawanie, wzrost i aktywność guzów w tkance kostnej. W celu badania tych zdarzeń opracowano kilka modeli in vivo, z których każdy posiada specyficzne zalety i ograniczenia. Najczęściej stosowany model wykorzystuje inokulację wewnątrzsercową komórek nowotworowych bezpośrednio do krwiobiegu tętniczego myszy BalbC beztymusowych (nude). Procedurę tę można zastosować do wielu różnych typów guzów (w tym raka prostaty PC-3, raka płuc oraz guzów tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy); w niniejszym opracowaniu skupimy się jednak na modelu raka piersi MDA-MB-231. W tym modelu wykorzystujemy klon o wysokiej selektywności względem kości, pierwotnie wyizolowany w grupie dr Mundy'ego w San Antonio², który został następnie przetransfekowany w celu ekspresji GFP i ponownie wyklonowany przez naszą grupę³. Klon ten jest wariantem przerzutowym do kości o wysokim stopniu osteotropizmu i bardzo niskiej częstości przerzutów do płuc, wątroby lub nadnerczy. Choć iniekcje wewnątrzsercowe są najczęściej stosowane w badaniach nad przerzutami do kości², w pewnych przypadkach bardziej odpowiednie są iniekcje wewnątrzpiszczelowe⁴ lub do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego. Iniekcje wewnątrzsercowe wykonuje się zazwyczaj przy użyciu ludzkich komórek nowotworowych w celu monitorowania późniejszych etapów przerzutowania, a konkretnie zdolności komórek rakowych do zatrzymania się w kości, przeżycia, proliferacji i tworzenia guzów, które rozwijają się w nowotworową chorobę kości. Iniekcje wewnątrzpiszczelowe wykonuje się, jeśli celem jest zbadanie relacji między komórkami rakowymi a kością po tym, jak guz przemieścił się do kości, co mniej więcej odpowiada ugruntowanej przerzutowej chorobie kości. Żaden z tych modeli nie odtwarza wczesnych etapów procesu przerzutowania poprzedzających zator i wniknięcie komórek nowotworowych do krwiobiegu. Jeśli celem jest monitorowanie wzrostu guza pierwotnego lub przerzutowania z miejsca pierwotnego do kości, zazwyczaj preferowane są inokulacje do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego; jednak bardzo niewiele linii komórek nowotworowych konsekwentnie przerzuca się do kości z miejsca pierwotnego, z wyjątkiem klonów 4T1 o preferencji kostnej, pochodzących z raka gruczołu mlekowego myszy ^5,6.

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury inokulacji oraz podkreśla kluczowe etapy analiz prowadzonych po inokulacji. W szczególności obejmuje on hodowlę komórkową, procedury inokulacji komórek nowotworowych drogą wewnątrzsercową i wewnątrzpiszczelową, a także zwięzłe informacje dotyczące cotygodniowego monitorowania za pomocą promieni rentgenowskich, fluorescencji oraz analiz histomorfometrycznych.

Protokół

1. Hodowla i utrzymanie komórek

1. Istnieje wiele subklonów MDA-MB-231 tworzących przerzuty do kości, które wykazują zróżnicowaną zdolność do kolonizacji i wzrostu w tkance kostnej. W naszych eksperymentach wykorzystujemy klon pochodzący od komórek MDA-MB-231 z tagiem GFP opracowanych w UTHSCA ². Ten konkretny subklon tworzy widoczne osteolityczne zmiany kostne około 3 tygodnie po inokulacji, a uśmiercanie zwierząt następuje w 4. tygodniu.
2. Komórki należy hodować w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS i 0,1 mg/ml penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5-8% CO₂⁷.
3. Pasażowanie komórek należy przeprowadzać przy 80-90% konfluencji i wysiewać je w rozcieńczeniu 1:10 (zależy to od typu komórek i wielkości naczynia; dla komórek MDA-MB-231 w naczyniu T-75 jest to około 6x10⁵), co odbywa się mniej więcej co 72 h.
4. Komórki MDA-MB-231 zachowują ogólnie fibroblastyczny wygląd z licznymi pseudopodiami. Wszelkie zaokrąglenie komórek świadczy o przeludnieniu lub innym niepożądanym stresie i należy go unikać, ponieważ może to wpłynąć na potencjał metastatyczny in vivo.
5. W idealnym przypadku komórki powinny być utrzymywane w kulturze tylko przez krótki czas przed inokulacją (zalecamy mniej niż 1 tyg. lub do momentu uzyskania wystarczającej liczby komórek do eksperymentu), a w przypadku zaokrąglenia komórek lub zmian w tempie ich wzrostu należy rozmrozić nową ampułkę.

2. Przygotowanie komórek

1. Przeprowadź trypsynizację komórek przy 80-90% konfluencji, używając 0,15% Trypsyny/EDTA (rozcień 0,5% Trypsynę EDTA firmy Gibco w stosunku 1:2 w PBS). Stężenie to umożliwia szybkie odklejenie komórek (<2 min) i ogranicza ich agregację.
2. Natychmiast zdejmij komórki z płytki, dodając 10 ml schłodzonego do temperatury lodowej DMEM z dodatkiem 10% FBS, przenieś je pipetą do probówki stożkowej 15 ml i wiruj przy 200 x g przez 5 min.
3. Resuspenduj osad w probówce stożkowej 50 ml w 25 ml schłodzonego do temperatury lodowej PBS (bez Ca i Mg) i wykonaj pomiar liczby komórek.
4. Wiruj w celu ponownego otrzymania osadu, a następnie resuspenduj w schłodzonym do temperatury lodowej PBS do stężenia 10⁶ komórek/ml (do podania wewnątrzsercowego) lub 250 000 komórek/10 μl (do podania wewnątrzpiszczelowego). Temperatura PBS jest kluczowa dla zapobiegania agregacji komórek i późniejszej embolii po iniekcji. Zawiesina komórkowa powinna być przechowywana w lodzie podczas wykonywania iniekcji; komórki pozostaną żywe i nie będą tworzyć agregatów przez 30 min. Chociaż dokładna liczba wymaganych płytek może się różnić w zależności od badacza, zazwyczaj jedna płytka T-75 wystarcza dla 8-10 myszy.

3. Inokulacja wewnątrzsercowa

1. Do tych eksperymentów wykorzystuje się myszy żeńskie w wieku 4-6 tygodni (Foxn nu-/-: Harlan), choć w eksperymentach z ludzkimi komórkami nowotworowymi można również stosować inne myszy z niedoborem odporności (RAG1-/-, RAG2-/-, SCID, XID itp.).
2. Myszy nude powinny być karmione dietą Teklad 2920x na 5-10 dni przed iniekcją, aby zmniejszyć śmiertelność wynikającą z procedury wstrzykiwania oraz zredukować autofluorescencję w procedurach obrazowania (ponieważ pokarm ten nie zawiera lucerny).
3. W przypadku użycia myszy innych niż nu/nu, przed rozpoczęciem procedury należy usunąć sierść z brzusznej strony brzucha poprzez golenie lub użycie preparatu Nair (według naszego doświadczenia Nair działa lepiej).
4. Zanurzyć mysz w anestezji w komorze izolacyjnej przy użyciu parownika izofluranu (2,5% Iso: 2-3 L/min O₂) lub innej preferowanej metody znieczulenia (według naszego doświadczenia izofluran jest najlepiej tolerowany przy inokulacjach wewnątrzsercowych).
5. Przenosić po jednej myszy do maski aparatury anestetycznej wewnątrz wentylowanego okapu ze stali nierdzewnej.
6. Ułożyć każdą mysz na plecach, klatką piersiową skierowaną do góry.
7. Umyć klatkę piersiową za pomocą tamponu/roztworu 10% powidonu z jodem, a następnie 70% etanolu, powtarzając czynność 2 razy.
8. Zaznaczyć miejsce iniekcji na klatce piersiowej myszy (używając sterylnego markera lub zaznaczając lekko z boku, aby zachować sterylność miejsca wstrzyknięcia). Stosujemy punkt w połowie odległości między wcięciem mostka a górną krawędzią wyrostka mieczykowatego, nieco na lewo (anatomicznie) od mostka. Do strzykawki insulinowej o pojemności 300 μl i igle 28 g ½ należy nabrać małą pęcherzyk powietrza, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem (istotne dla obserwacji tętna serca), a następnie pobrać 100 μl zawiesiny komórek.
9. Trzymać igłę pionowo. Napinając skórę myszy drugą ręką, wprowadzić igłę.
10. Prawidłowe wprowadzenie igły do lewej komory serca powinno skutkować wyraźnym, jasnoczerwonym pulsem krwi w strzykawce. Na tej głębokości należy ostrożnie docisnąć tłok strzykawki (objętość 100 μl), unikając znacznego ruchu igły, aby nie przebić serca i nie rozlać komórek do jamy klatki piersiowej.
11. Po wstrzyknięciu komórek należy lekko odciągnąć tłok, aby wytworzyć niewielkie podciśnienie i ograniczyć wyciekanie komórek do jamy klatki piersiowej.
12. Wyciągnąć igłę bezpośrednio z klatki piersiowej, dbając o to, aby nie przechylać jej podczas usuwania, co mogłoby rozerwać ścianę serca i spowodować krwawienie.
13. Przyłożyć delikatny ucisk na klatkę piersiową w miejscu iniekcji, aby zredukować krwawienie.
14. Wyjąć mysz z maski i kontynuować lekki ucisk przez około 1 min.
15. Przenieść mysz na matę grzewczą do czasu pełnego odzyskania przytomności.
16. Jeśli po wybudzeniu mysz zacznie wirować lub drgać, prawdopodobną przyczyną jest zator. Wstrzyknąć myszy do jamy otrzewnej 80-120 mg/kg ketaminy, aby zwiększyć przepływ krwi i rzut serca przy jednoczesnym zmniejszeniu oporu naczyniowego. Powinno to pomóc myszy usunąć skrzep. Po wystąpieniu takiej sytuacji najlepiej zmienić preparaty komórkowe, gdyż świadczy to o agregacji komórek. Zmieniamy preparaty komórkowe po około 8 myszach lub po 30 min.

4. Wewnątrzpiszczelowe

1. Bezpośrednio przed zabiegiem wstrzyknąć myszy Buprenex (0,1 mg/kg) lub inny zatwierdzony środek przeciwbólowy.
2. Uśpić mysz za pomocą izofluranu, następnie przenieść ją pod stożek nosowy i podtrzymać znieczulenie.
3. Oczyścić obie nogi tamponem/roztworem 10% powidonu jodowego, a następnie etanolem, powtarzając czynność 2 razy. Jeśli obecna jest sierść, należy poddać nogi depilacji (za pomocą preparatu Nair lub podobnego) przed czyszczeniem.
4. Delikatnie chwycić kostkę boczną, kostkę przyśrodkową i dolną połowę kości piszczelowej palcem wskazującym i kciukiem, a następnie zgiąć nogę (połączenie zgięcia i rotacji bocznej), tak aby kolano było widoczne i dostępne.
5. Zwilżyć skórę 70% EtOH, aby zwiększyć widoczność leżącego pod nią więzadła rzepki, które powinno być widoczne jako wyraźna, gruba, biała linia. Mocno trzymając kostkę/nogę myszy, wprowadzić igłę 28g ½ pod rzepkę, przez środek więzadła rzepki i do przedniego obszaru międzykłykciowego w górnej części kości piszczelowej.
6. Podczas wprowadzania igły do kości piszczelowej prowadzić ją ostrożnie przez płytkę wzrostu, stosując stały, mocny nacisk z lekkim ruchem świdrującym.
7. Po przebiciu płytki wzrostu kości piszczelowej opór podczas wprowadzania igły wyraźnie zmaleje.
8. Zastosować delikatny, boczny ruch igły, aby upewnić się, że znajduje się ona w kości piszczelowej i przeszła przez płytkę wzrostu. Ruch będzie ograniczony, jeśli igła znajduje się w odpowiednim miejscu w obrębie kości piszczelowej.
9. Powoli nacisnąć tłok, aby wstrzyknąć 10 μl roztworu komórek. Na tym etapie opór powinien być niewielki lub nieodczuwalny.
10. Powoli wyciągnąć igłę.
11. Postępując zgodnie z tą samą procedurą, przejść do drugiej nogi, aby wstrzyknąć 10 μl PBS.
12. Wybudzić mysz z narkozy i pozostawić na podgrzewaczu do czasu pełnego dojścia do siebie.
13. Monitorować myszy przez następne 24 hr i wstrzykiwać dodatkowy Buprenex co 12 hr, jeśli zwierzęta nadal wykazują oznaki stresu.

5. Obrazowanie w czasie

1. Obrazowanie lucyferazowe: W odpowiednich przypadkach obrazowanie lucyferazowe powinno być stosowane począwszy od 7. dnia po inokulacji komórek nowotworowych (choć w większości modeli przerzutów do kości sygnał jest wykrywalny bliżej 14. dnia). Myszy wstrzykuje się domięśnio 150 mg/kg lucyferyny, poddaje znieczuleniu i obrazuje 8 min po iniekcji przy użyciu sprzętu IVIS ⁸.
2. Obrazowanie GFP: Zazwyczaj guzy wykazujące ekspresję GFP stają się wykrywalne około 10-14 dnia w przypadku iniekcji wewnątrzpiszczelowych oraz 16-21 dnia w eksperymentach wewnątrzsercowych przy użyciu sprzętu do obrazowania Maestro (CRi) ⁹. W skrócie: myszy znieczula się izofluranem (3%) i utrzymuje w znieczuleniu za pomocą stożka nosowego w komorze obrazowania Maestro. Dla komórek wykazujących ekspresję eGFP stosujemy zestaw filtrów niebieskich (podbudzenie 498/emisja 515 dla eGFP) przy czasie ekspozycji 500 ms w krokach 10 nm.
3. Faxitron (promienie rentgenowskie): Zdjęcia rentgenowskie wykonuje się co tydzień, zaczynając od 7. do 14. dnia. Zmiany będą widoczne w modelu wewnątrzsercowym w 21. dniu, a o tydzień wcześniej w przypadku iniekcji wewnątrzpiszczelowych³. Nasze dane radiograficzne ex vivo i in vivo zostały pozyskane przy użyciu urządzenia Faxitron LX-60 przy 35 kV i czasie ekspozycji 8 sekund.
4. Inne metody obrazowania: Metody obrazowania będą całkowicie zależne od specyfiki badań. Oprócz powyższych metod, cenne informacje może dostarczyć obrazowanie żywych zwierząt oparte na mikrotomografii komputerowej 3D (μCT), mikrotomografii emisyjnej pozytonów (μPET) oraz inne modalności ^10,11.

6. Uśmiercenie myszy

1. Każdy model charakteryzuje się nieco innym przebiegiem czasowym. W przypadku komórek MDA-MB-231 myszy zazwyczaj wpadają w kacheksję lub stają się paraplegiczne między 21. a 35. dniem, najczęściej około 28. dnia (myszy z iniekcją wewnątrzkostną między 21. a 28. dniem).
2. Gdy u kilku myszy rozwiną się zmiany zaczynające przebijać kość korową, wystąpi paraplegia lub utrata od 10% do 20% masy ciała, należy uśmiercić wszystkie myszy biorące udział w badaniu poprzez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny z następującym zwichnięciem szyjnym (lub inną metodą zatwierdzoną przez IACUC).
3. Wyciąć kości niezbędne do dalszych badań i przechowywać je w 4% formalinie buforowanej.
4. Wystąpienie guzów w klatce piersiowej u myszy jest oznaką błędnego wykonania iniekcji; takie osobniki należy wykluczyć z badania.

7. Analiza ex vivo

1. μCT: skanowanie w 70% EtOH umożliwia pomiar parametrów strukturalnych i histologicznych na tym samym preparacie kostnym.
2. Wykonaj obrysowanie i analizę zgodnie z indywidualnym planem eksperymentalnym i dostępnym sprzętem¹⁰. Nasze dane uzyskano przy użyciu urządzenia Scanco μCT 40 z rozdzielczością 12 μM.
3. Histo-morfometria: Przetwórz preparaty przy użyciu preferowanych metod histologicznych i zabarw hematoksyliną i eozyną⁷

8. Reprezentatywne wyniki

Po wewnątrzsercowym lub wewnątrzpiszczelowym zaszczepieniu komórek nowotworowych (Rysunek 1) myszy są monitorowane co tydzień za pomocą radiografii oraz fluorescencji (lub luminescencji). Zmiany zwykle stają się widoczne w badaniu rentgenowskim między 2. a 3. tygodniem, natomiast w badaniu fluorescencyjnym i luminescencyjnym mogą być widoczne już w 2. tygodniu, w zależności od modelu (Rysunek 2). Zmiany są widoczne jako ciemne ubytki w kości i stają się z czasem bardziej wyraźne (Rysunek 3). Zmiany ilościowo oceniono przy użyciu analizy radiogramów w programie Metamorph, a fluorescencję ilościowo oceniono za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazowania Maestro (CRi). W miarę wzrostu zmian u myszy często rozwija się kacheksja. Eutanazja jest wymagana, gdy myszy stracą od 10-20% początkowej masy ciała. Stan myszy może gwałtownie się pogorszyć, dlatego musi być monitorowany wielokrotnie w ciągu dnia. Między 3. a 4. tygodniem myszy zaczęły ciągnąć jedną lub obie kończyny tylne, po czym dokonano eutanazji wszystkich zwierząt w badaniu. Obrazy wykonano przed eutanazją. Po przedawkowaniu środka znieczulającego pobrano krew w celu pomiaru markerów przebudowy kości lub innych czynników. Po zwichnięciu stawu karkowego usunięto skórę z myszy, a kości wycięto i oczyszczono do obrazowania ex vivo (Rysunek 3), co pozwala na wizualizację ognisk nowotworowych co najmniej 7 dni wcześniej niż przy zastosowaniu technik obrazowania in vivo. Po zakończeniu obrazowania kości umieszczono w opisanych kasetach i przechowywano w formalinie w celu utrwalenia i dalszej obróbki histologicznej lub analizy μCT. Próbki poddano histomorfometrii w celu określenia obciążenia nowotworem oraz BV/TV, a następnie przeprowadzono badanie μCT piszczeli, aby ilościowo ocenić stopień destrukcji kości (Rysunek 4).

Rysunek 1. Prawidłowe miejsce wstrzyknięcia. Radiograficzny widok brzuszny (A) klatki piersiowej dorosłej myszy, pokazujący prawidłowe umieszczenie igły w 4^tej przestrzeni międzyżebrowej i w lewej komorze w celu inokulacji wewnątrzsercowej. Punkty orientacyjne są zaznaczone poziomymi przerywanymi liniami na mostku (obrysowanym na biało). Na skórze myszy punktami orientacyjnymi są wcięcie mostka i wyrostek mieczykowaty, a igłę wprowadza się nieco na lewo od mostka. Radiograficzny widok brzuszny (B) kończyny dorosłej myszy, pokazujący prawidłowe umieszczenie igły w bliższej części piszczeli, wyrównanej pomiędzy kłykciami. Z perspektywy bocznej końcówka igły znajduje się za guzowatością piszczeli i głęboko względem płytki nasiedynkowej. Idealne miejsce wstrzyknięcia zaznaczono białym okręgiem.

Rycina 2. Przebieg czasowy modeli przerzutów do kości. Progresja choroby kostnej indukowanej nowotworem przedstawiona na zdjęciach rentgenowskich oraz obrazach fluorescencyjnych GFP+ guzów in vivo po wstrzyknięciach wewnątrzpiszczelowych (A) oraz wewnątrzsercowych (B).

Rysunek 3. Przebieg czasowy w wewnątrzsercowym modelu MDA-MB-231. Górny rząd: Obrazy ex vivo przedstawiające fluorescencję GFP w dniach 0, 14, 21 i 28 po wewnątrzsercowym wstrzyknięciu komórek MDA-MB-231. Należy zauważyć, że ogniska nowotworowe w 14. dniu są widoczne ex vivo dopiero po usunięciu tkanek miękkich. Dolny rząd: Radiograficzne obrazy ex vivo tych samych kości udowych ilustrujące osteolityczne zmiany kostne. Należy zauważyć, że destrukcja kości nie jest zazwyczaj widoczna do 3 tygodni po wstrzyknięciu do serca.

Rysunek 4. Ilościowa ocena progresji przerzutów do kości. Guz GFP+ zobrazowany za pomocą obrazowania Maestro ex vivo kości piszczelowych myszy nieobciążonej nowotworem (A) oraz myszy 4 tygodnie po wewnątrzsercowym wstrzyknięciu subklonu MDA-MB-231 wykazującego ekspresję GFP (B). Ogniska nowotworowe korelują z obszarami destrukcji kości, co obrazuje Faxitron (D) w porównaniu z kością bez nowotworu (C). Dane strukturalne i mineralne kości z pomiarów mikroCT przedstawiono jako obrazy 3D zdrowej kości (E) oraz kości z nowotworem (F), gdzie obszary destrukcji kości są widoczne jako puste przestrzenie. Dalsze szczegóły dotyczące kości i guza widoczne są na odpowiadających im histologicznych przekrojach barwionych H&E (G i H).

Dyskusja

Badania nad chorobami kości indukowanymi przez nowotwory opierają się na kilku modelach zwierzęcych, z których dwoma najczęściej stosowanymi są inokulacje wewnątrzsercowe i wewnątrzpiszczelowe. W wielu przypadkach inokulacja wewnątrzsercowa jest najlepszą opcją do badania przerzutów do kości; nie odzwierciedla ona jednak pełnego procesu metastazy, dlatego w tym celu najlepiej stosować iniekcje do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego lub inne iniekcje ortotopowe. W większości badań z wykorzystaniem ludzkich komórek kom...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231	Pierwotnie ATCC – klonowane i selekcjonowane wewnętrznie
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
Trypsyna	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
Skaner μCT	Scanco
Myszy nago athymiczne	Harlan	Fox nu -/-
Strzykawki insulinowe (300 μl, 28,5 g)	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
Naświetlona dieta dla gryzoni	Teklad	2920x