Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji trójwymiarowej struktury żyły wrotnej wątroby myszy lub wewnątrzwątrobowych przewodów żółciowych. Tę technikę odlewu żywicznego można zastosować również do innych układów przewodowych lub naczyniowych, co umożliwia wizualizację lub kwantyfikację nienaruszonej architektury komunikacyjnej układu in situ.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowe odlewanie w żywicy i obrazowanie żyły wrotnej myszy lub wewnątrzpasączniczego systemu przewodów żółciowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W organach prawidłowa architektura struktur naczyniowych i przewodowych jest niezbędna do właściwego funkcjonowania fizjologicznego, a tworzenie i utrzymywanie tych struktur jest procesem ściśle regulowanym. Analiza tych złożonych, trójwymiarowych struktur w dużej mierze opierała się albo na badaniach dwuwymiarowych w przekrojach, albo na badaniach z użyciem wstrzykiwania barwników. Techniki te nie są jednak w stanie zapewnić pełnej i mierzalnej reprezentacji struktur przewodowych lub naczyniowych, które mają one wyjaśnić. Alternatywnie, zastosowanie trójwymiarowych odlewów z żywicy plastycznej pozwala na uzyskanie trwałego obrazu systemu i stanowi nowoczesną oraz szeroko stosowaną technikę wizualizacji i kwantyfikacji struktur i sieci trójwymiarowych.
Kluczową zaletą systemu odlewów żywicznych jest możliwość określenia nienaruszonej i połączonej, lub komunikującej się, struktury naczynia krwionośnego lub przewodu. Struktura sieci naczyniowych i przewodowych ma krytyczne znaczenie dla funkcji narządów, a technika ta ma potencjał, aby wspomóc badanie tych sieci na kilka sposobów. Odlewy żywiczne mogą być wykorzystywane do analizy prawidłowej morfologii i architektury funkcjonalnej struktur światłowodowych, identyfikacji rozwojowych zmian morfogenetycznych oraz ujawniania różnic morfologicznych w architekturze tkanek między stanem prawidłowym a chorobowym. W poprzednich pracach odlewy żywiczne wykorzystano do badania na przykład wad architektonicznych i funkcjonalnych w obrębie wewnątrzwątrobowego systemu dróg żółciowych u myszy, które nie były widoczne w analizie dwuwymiarowej struktury1,2, zmian w naczyniach mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera3, nieprawidłowości żyły wrotnej u myszy z nadciśnieniem wrotnym i marskością wątroby4, etapów rozwoju w dojrzewaniu układu limfatycznego szczura między płucami niedojrzałymi a dorosłymi5 oraz bezpośrednich zmian mikro naczyniowych w wątrobie, trzustce i nerkach szczura w odpowiedzi na uszkodzenie chemiczne6.
Przedstawiamy tutaj metodę tworzenia trójwymiarowego odlewu z żywicy sieci naczyniowej lub przewodowej myszy, koncentrując się w szczególności na żyle wrotnej i wewnątrzwątrobowych drogach żółciowych. Odlewy te można zwizualizować poprzez klarowanie lub macerację tkanki, a następnie poddać analizie. Technikę tę można zastosować do praktycznie każdego układu naczyniowego lub przewodowego i byłaby ona bezpośrednio przydatna w każdym badaniu dotyczącym rozwoju, funkcji, utrzymania lub uszkodzenia trójwymiarowej struktury przewodowej lub naczyniowej.
Protokół
1. Przygotowanie kaniuli
- Ogrzej opuszkami palców odcinek rurki PE10 o długości 1 cala i rozciągnij go, aby rurka stała się cieńsza.
Uwaga: stopień wymaganego rozciągnięcia zależy od wielkości naczynia lub przewodu, do którego wprowadzana jest kaniula. W przypadku odlewów przewodów żółciowych kaniula musi być mocno rozciągnięta, natomiast w celu wprowadzenia do większej żyły wrotnej może być wymagane jedynie umiarkowane rozciągnięcie. - Otnij rozciągniętą rurkę po skosie, aby utworzyć ścięty koniec.
- Otnij drugi koniec rurki, tworząc segment o długości 5-6 cali.
- Wsuń igłę hipodermiczną o rozmiarze 32 G i długości ½ cala w nieścięty koniec rurki.
2. Przygotowanie strzykawki z PBS
- Napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml roztworem PBS.
- Przykręcić strzykawkę do igły hipodermicznej z wcześniej przygotowaną, nasuniętą rurką PE10.
- Opukać strzykawkę i nacisnąć tłok, aby upewnić się, że PBS wypełnił igłę oraz rurkę i w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
- Umieścić przygotowaną strzykawkę z PBS w uchwycie wykonanym z plasteliny. Uchwyt ten zapewni stabilność strzykawki podczas wprowadzania rurki do przewodu.
3. Pozostałe ustawienia
- Odważ 0,1 g katalizatora do małego pojemnika, np. do jednej studni płytki 24-dołkowej.
- Naciągnij 1 ml żywicy do strzykawki o pojemności 3 ml.
Uwaga: względne ilości katalizatora i żywicy można dostosować w celu zmiany czasu utwardzania. Zmniejszenie ilości katalizatora może jednak zwiększyć skurcz odlewu i doprowadzić do uzyskania mniej pożądanego efektu.
Uwaga: podczas pracy z żywicą należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z żywicą lub wdychania jej oparów. Zawsze należy nosić rękawiczki i wykonywać czynności z użyciem żywicy w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, np. pod wyciągiem chemicznym - Odetnij kawałek jedwabnej nici chirurgicznej 5.0 o długości około 5 cali, który posłuży jako podwiązka.
4. Przygotowanie myszy
- Uśmierć dorosłą mysz. Połóż mysz na plecach i otwórz jamę brzusną.
- Połóż mysz na platformie sterскопа sekcyjnego. Umieść prostopadle pod myszą probówkę stożkową o pojemności 15 ml, aby zwiększyć widoczność i dostęp do wątroby.
- Zwilż patyczek watny w PBS i użyj go do odchylenia wątroby do góry i od siebie, aby odsłonić grzbietową stronę wątroby wraz z pozawątrobną żyłą wrotną lub wspólnym przewodem żółciowym.
- W przypadku odlewów żyły wrotnej można zapobiec krzepnięciu krwi, przepłukując żyłę PBS w temperaturze pokojowej. Przymocuj igłę do strzykawki 3 ml wypełnionej PBS i wprowadź igłę do pozawątrobnej żyły wrotnej tak daleko od wątroby, jak to możliwe. Delikatnie wtłocz PBS do żyły wrotnej. Wykonaj nacięcie w wspólnej żyle głównej, aby odprowadzić krew. Użyj zwilżonego patyczka watnego do masowania wątroby, co usprawni odpływ krwi. Ten krok nie jest zalecany w przypadku przewodu żółciowego i może nie być konieczny dla wszystkich układów naczyniowych.
Uwaga: ten krok można również przeprowadzić z użyciem 4% paraformaldehydu zamiast PBS. Zastosowanie 4% paraformaldehydu może zwiększyć integralność naczyń i pozwolić na uzyskanie dokładniejszego odlewu, zwłaszcza w przypadku mniejszych struktur naczyniowych.
5. Kanulacja pozawatróbowej żyły wrotnej lub wspólnego przewodu żółciowego
- Za pomocą zakrzywionej pęsety przeprowadź szew chirurgiczny pod żyłą wrotną lub przewodem żółciowym, w odległości około ¼ cala od wątroby.
- Zwiąż szew w luźny zwykły węzeł. NIE zaciągaj węzła.
- W przypadku pracy z systemem otwartym pomocne może być zawiązanie i zaciągnięcie ligatury na drugim końcu systemu. Jeśli otwarto wspólną żyłę główną w celu odprowadzenia krwi z żyły wrotnej, należy zawiązać wokół niej ligaturę, aby zwiększyć ciśnienie w żyle wrotnej i zapobiec wyciekowi żywicy do centralnej żyły wątrobowej.
- Używając nożyczek sprężynowych, wykonaj niewielkie nacięcie w żyle wrotnej lub przewodzie żółciowym, około ¼ cala poniżej węzła szwu. Nacięcie to nie powinno przekraczać połowy średnicy żyły wrotnej lub przewodu żółciowego.
- Za pomocą pęsety nr 5 przytrzymaj żyłę wrotną lub przewód żółciowy w miejscu nacięcia i wprowadź ścięty koniec rurki do przewodu żółciowego.
- Wsuń końcówkę rurki za wcześniej zawiązaną ligaturę, w kierunku wątroby.
- Zweryfikuj poprawność kaniulacji, wstrzykując PBS przez kaniulę i obserwując, czy wnika ona do żyły wrotnej lub przewodu żółciowego.
- Zaciągnij ligaturę, aby unieruchomić kaniulę.
6. Odlew żyły wrotnej lub wewnątrzstropowych przewodów żółciowych z żywicy
- Dodaj odmierzoną ilość 1 ml żywicy do odmierzonej ilości 0,1 g katalizatora i dokładnie wymieszaj. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.
- Naciągnij mieszaninę żywicy i katalizatora do strzykawki o objętości 3 ml. Usuń pęcherzyki powietrza, delikatnie stukując w strzykawkę i wypychając pęcherzyki.
Uwaga: przy odlewaniu małych struktur pomocne może być zastosowanie komory próżniowej w celu usunięcia bardzo małych pęcherzyków powietrza z żywicy i poprawy jakości odlewu. Aby zapewnić czas na wykonanie tego kroku, konieczne będzie zmniejszenie stosunku katalizatora do żywicy w porównaniu z sugerowanym powyżej, w celu spowolnienia utwardzania żywicy. - Ostrożnie zastąp strzykawkę zawierającą PBS strzykawką z żywicą, pozostawiając igłę o rozmiarze 32 G przymocowaną do kaniuli.
- Powoli i delikatnie wprowadzaj żywicę do żyły wrotnej lub przewodu żółciowego, aż do momentu zwiększenia oporu i wypełnienia wątroby.
- Używając mokrego patyczka bawełnianego, delikatnie masuj wątrobę, aby zapewnić równomierne wypełnienie.
- Usuń kaniulę ze struktury i szybko zaciśnij ponownie podwiązkę, aby zapobiec wyciekowi żywicy.
- Pozostaw mysz w pozycji płaskiej w temperaturze pokojowej na 20 min do czasu utwardzenia żywicy, następnie wyjmij wątrobę.
- Przejdź do oczyszczania lub macerowania wątroby.
7. Prześwietlanie wątroby do wizualizacji in situ
- Utrwalone wątrobę w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C, w wytrząsarku.
- Przemyj wątrobę w PBS przez co najmniej cztery godziny, w wytrząsarku. Na tym etapie można oddzielić płaty wątroby, jeśli jest to wymagane.
- Odwodnij w 50% metanolu, a następnie w 100% metanolu przez co najmniej cztery godziny w każdym roztworze, wytrząsając w temperaturze pokojowej.
- Przejaśnij wątrobę w roztworze alkoholu benzylowego i benzoestru benzylowego (BABB) w stosunku 1:2 przez co najmniej 24 godziny, w wytrząsarku. Może być wymagany dłuższy czas przemywania. Jeśli wątroba nie stanie się całkowicie przejrzysta po 2-3 dniach, przenieś ją z powrotem do 100% metanolu na 24 godziny, a następnie powtórz przejaśnianie w BABB.
- Zanurz wątrobę w BABB w szklanej płytce Petriego do obrazowania in situ.
8. Maceracja tkanki wątroby
- Wyjąć wątrobę z myszy i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z wodą. Odczekać 1 hr do całkowitego utwardzenia żywicy. W razie potrzeby rozdzielić płaty wątroby.
- Odlać wodę i przenieść wątrobę do szklanej butelki. Zanurzyć w 15% KOH. Pozostawić na noc w temperaturze pokojowej. Nie wstrząsać.
- Ostrożnie odlać KOH i wypłukać odlew w wodzie destylowanej. Uwaga: odlew jest bardzo kruchy i należy z nim obchodzić się z najwyższą ostrożnością. Unikać naruszania odlewu podczas dolewania lub usuwania cieczy z probówki.
- Po oczyszczeniu odlewu z żywicy, delikatnie położyć go na chusteczce Kimwipe do wysuszenia, a następnie przenieść do pojemnika do przechowywania.
9. Reprezentatywne wyniki
Prawidłowy odlew żyły wrotnej lub przewodów żółciowych będzie wykazywał ciągłą sieć stopniowo mniejszych odgałęzień, rozciągających się od wnęki do obwodu wątroby.
Rysunek 1 przedstawia odlew żyły wrotnej zwizualizowany in situ po przejaśnianiu metodą BABB. Rysunek 1A przedstawia odlew całego lewego płata wątroby oraz kształt i rozmiar odlewu. Rysunek 1B przedstawia zbliżenie tego samego odlewu, wykazując penetrację żywicy do najmniejszych odgałęzień żyły wrotnej na obwodzie wątroby.
Rysunek 2 przedstawia odlew żyły wrotnej po maceracji w KOH. Rysunek 2A pokazuje cały lewy płat wątroby, a Rysunek 2B to zbliżenie na małe gałęzie obwodowe.
Technikę tę z powodzeniem zastosowano również w przypadku wewnątrzpieczniowych przewodów żółciowych, a wyniki opublikowano z wykorzystaniem zarówno metody przejaśniania BABB, jak i techniki maceracji w KOH1,2,7.
Typowe problemy obejmują niepełne wypełnienie, pęcherzyki powietrza w żywicy oraz wyciek do sąsiednich układów lub tkanek. Rycina 3 pokazuje, jak rozpoznać niepełne wypełnienie (Rycina 3A), pęcherzyki powietrza (Rycina 3A) oraz wyciek żywicy z żyły wrotnej do żyły centralnej (Rycina 3B).
Wszystkie obrazy zostały wykonane przy użyciu stereoskopu Leica MZ 16 FA i kamery QImaging RETIGA 4000R.
Rysunek 1. Odlew z żywicy żyły wrotnej lewego płata wątroby po przejaśnianiu metodą BABB. A. Odlew z żywicy wykazuje hierarchiczną strukturę rozgałęzień rozciągającą się od wnęki do obwodu wątroby. Odlew z żywicy ma kolor żółty w obrębie niebieskiego płata wątroby. B. Powiększenie pokazuje, że wypełnienie z żywicy dociera do małych gałęzi na obwodzie wątroby. Żywica jest biało-szara w przejaśnionej wątrobie. Pasek skali = 1 mm.
Rysunek 2. Odlew żywiczny z tkanek macerowanych żyły wrotnej lewego płata wątroby. A. Odlew żywiczny całego płata wątroby wykazuje wiele gałęzi o różnej wielkości. B. Powiększenie przedstawia małe gałęzie na obwodzie wątroby. Pierzasty wygląd małych gałęzi wynika z wypełnienia żywicą przestrzeni zatokowych; może on być widoczny lub niewidoczny na odlewach żywicznych i w przypadku wystąpienia zwiększa pozorną gęstość rozgałęzień. Żywica ma kolor biały. Pasek skali = 1 mm.
Rysunek 3. Typowe problemy z odlewami żywicznymi. A. Niepełne wypełnienie żyły wrotnej lewego płata jest widoczne poprzez fakt, że niektóre lub wszystkie odgałęzienia odlewu nie docierają do obwodu wątroby. Odlew ten wykazuje również pęcherzyki powietrza, widoczne jako przerwy w ciągłości odlewu (strzałka). B. Ze względu na bliskość odgałęzień żyły wrotnej i żyły głównej w niektórych miejscach, żywica z żyły wrotnej często przedostaje się i wypełnia żyłę główną. Można to rozpoznać, gdy występują dwie odrębne gałęzie wnęki (strzałki) oraz dwie struktury rozgałęziające się, które mają różne wzorce i nakładają się na siebie. Rozróżnienie między błędami technicznymi a rzeczywistymi zmianami morfologicznymi można przeprowadzić na dwa sposoby. Po pierwsze, strukturę odlewu należy porównać ze strukturą oczekiwaną na podstawie analizy dwuwymiarowej lub innych metod. Po drugie, ważne jest wykonanie kilku powtórzeń, a w razie możliwości ilościowe określenie struktury i przeprowadzenie analizy statystycznej w celu ustalenia powtarzalności oraz sprawdzenia, czy występuje statystycznie istotna zmiana morfologiczna pomiędzy różnymi grupami eksperymentalnymi i kontrolnymi oraz w ich obrębie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy konkretne przykłady odlewania systemów żyły wrotnej i wewnątrzestropatycznych dróg żółciowych wątroby, jednak technikę tę można zastosować do niemal każdego innego układu przewodowego lub naczyniowego po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Wcześniejsze prace wykazały wykonalność tej metody u wielu gatunków, w tym u myszy1,2,7-9, kacząt10,11, królików12,13, psów14 i świń15, a także w wielu narządach, w tym w gruczołach nosowych14, sercu16<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty z Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) przyznane S.S.H. (R01-DK078640), z Howard Hughes Medical Institute (HHMI) w ramach programu certyfikacyjnego HHMI/Vanderbilt University w dziedzinie medycyny molekularnej przyznanego T.J.W. (GRDOT56006779), a także przez Vanderbilt Diabetes Research and Training Center (P30-DK020593) oraz Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) zapewniające usługi w ramach jednostek Core Services.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przewód polietylenowy PE10 | Fisher Scientific | 1417012P | |
| Sznur chirurgiczny z czarnego plecionego jedwabiu 5-0 | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Igła Steriject 32 G x 13 mm | Air-tite | TSK3213 | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Pinceta nr 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Zestaw Mercox II | Ladd Research | 21247 | |
| Alkohol benzylowy | Fisher Scientific | 1816-04 | Wymagany tylko do przejaśniania BABB |
| Benzoesan benzylu | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Wymagany tylko do przejaśniania BABB |
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | |||
| Plastelina modelarska | |||
| Waga | |||
| Nożyczki laboratoryjne | |||
| Probówki polipropylenowe z nakrętką 15 ml | |||
| 4% paraformaldehyd | |||
| 15% wodorotlenek potasu (KOH) | Wymagany tylko do maceracji | ||
| Żyletka | |||
| 100% metanol | |||
| Strzykawka z systemem Luer Lock 3 ml |
Bibliografia
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
