Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Podsumowanie

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Streszczenie

Opryczkowa choroba oka, określana mianem opryczkowego zapaleniay stromo keratitis (HSK), jest potencjalnie prowadzącą do ślepoty infekcją rogówki, która skutkuje ponad 300 000 wizyt klinicznych rocznie w celu leczenia. Od 1 do 2 procent pacjentów z chorobą kliniczną doświadczy utraty wzroku w zainfekowanej rogówce. Ogromna większość tych przypadków jest wynikiem reaktywacji utajonej infekcji wywołanej przez wirus herpes simplex typu I, a nie wynika z ostrego przebiegu choroby. Co ciekawe, do badania tej choroby najczęściej wykorzystuje się model infekcji ostrej. Uznano jednak, że nawracający model HSK byłby bardziej odzwierciedlał procesy zachodzące podczas choroby klinicznej. W nawracających modelach zwierzęcych HSK wykorzystywano zarówno króliki, jak i myszy. Przewagą królików jest to, że doświadczają one reaktywacji z okresu utajenia bez żadnego znanego bodźca. Mimo to trudno jest badać rolę wielu czynników immunologicznych w nawracającym HSK, ponieważ model króliczy nie dysponuje takimi zasobami immunologicznymi i genetycznymi, jakie posiada mysz. Zdecydowaliśmy się na wykorzystanie modelu mysiego w nawracającym HSK, ponieważ daje on korzyść w postaci wielu dostępnych zasobów, a ponadto wiemy, kiedy nastąpi reaktywacja, gdyż jest ona indukowana ekspozycją na światło UV-B. Do tej pory model ten pozwolił laboratoriom go stosującym na zdefiniowanie kilku czynników immunologicznych istotnych dla tej choroby. Umożliwił nam on również przetestowanie skuteczności zarówno terapii, jak i szczepionek.

Protokół

Uwaga dotycząca opieki nad zwierzętami: W tym modelu nie stosuje się leków przeciwbólowych, ponieważ wykazują one działanie przeciwzapalne, co mogłoby unieważnić wyniki modelu.

1. Przygotowanie wirusa

1. Namnażać HSV-1 na komórkach Vero (80% konfluencji), stosując rozcieńczenie początkowe wynoszące 0,01 wielokrotności infekcji (w kolbie T-150, około 5 x 10⁵ jednostek tworzących plaque) przez 3-4 dni, aż wszystkie komórki ulegną zaokrągleniu i będą łatwo oddzielone po uderzeniu w kolbę.
2. Przenieść pożywkę do sterylnych probówek wirówkowych i wirować w wirówce Sorvall Legend RT w temperaturze 4 °C przy 3 500 rpm przez 15 min. Po usunięciu nadsączu (patrz 1.3), resuspendować duży osad z każdej probówki 50 ml w łącznie 5 ml pożywki. Sonikować przez 1 min w dwóch 30-sekundowych impulsach.
3. Usunąć nadsącz, przelać do sterylnych probówek Oak Ridge 50 ml i wirować przy 9 000 rpm przez 1 h w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman J2-21. Celem jest uzyskanie małego osadu wirusowego. Odrzucić nadsącz.
4. Połączyć materiał po sonikacji z punktu 1.2 z osadem z punktu 1.3 i ponownie sonikować przez 45 s. Wirować w wirówce Sorvall Legend RT przy 1 500 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C. Zebrać nadsącz. Stanowi on zapas wirusa, który należy rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -70 °C.
5. Oznaczyć miano wirusa na komórkach Vero. Zazwyczaj wysiewa się rozcieńczenia od 10⁰ do 10^-8 (każde będąc rozcieńczeniem 10-krotnym) dwukrotnie z dwóch oddzielnych serii rozcieńczeń. Miareczkowanie wirusa przeprowadza się na sterylnych płytkach 12-dołkowych.

2. Zakażanie myszy

1. Każdej myszy wstrzyknąć 0,1 ml koktajlu anestetycznego na 20 g masy ciała myszy (Ketamina 60 mg/kg + Ksylazyna 5 mg/kg rozpuszczone w HBSS). Koktajl ten jest stosowany, ponieważ przy zachowaniu odpowiednich dawek stanowi jeden z najbezpieczniejszych środków znieczulających, a działanie leku jest bardzo krótkotrwałe.
2. Po znieczuleniu myszy należy podrapać rogówkę prawego oka igłą o rozmiarze 30 G, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, aby upewnić się, że rogówka nie została przebita.
3. Każdej myszy podano dootrzewnowo 1 ml puli ludzkiej surowicy (Sigma, Temecula, Calif.; reaktywność przeciw-HSV z dawką efektywną dla 50% neutralizacji wirusa wynoszącą 1:800) w celu ochrony rogówek przed uszkodzeniem podczas pierwotnej infekcji.
4. Ponumerować myszy za pomocą klipsów usznych lub dziurkacza do uszu.
5. Po ponumerowaniu wszystkich myszy, za pomocą pipety 20 μl, zainfekować każde oko dawką 10⁶ PFU (5 μl). Infekcję wywołuje się tylko w jednym oku, zazwyczaj w prawym. Do drugiego oka należy nanieść 5 μl HBSS, aby utrzymać jego wilgotność podczas znieczulenia. Ilość 5 μl jest wystarczająca do nawilżenia oczu, ponieważ procedury trwają mniej niż 10 min, a zwierzęta otrzymują odpowiednią dawkę środka anestetycznego. Infekcję potwierdza się 3 dni po zakażeniu poprzez wymaz z oczu myszy za pomocą sterylnego aplikatora bawełnianego nawilżonego w 1 ml medium do komórek Vero. Następnie 100 μl wymazu dodaje się do komórek Vero hodowanych na płytkach 48-dołkowych. Płytki te są codziennie monitorowane pod kątem efektu cytopatycznego (cpe).

3. Reaktywacja myszy z fazy utajenia

1. Myszy poddaje się znieczuleniu co najmniej 5 tygodni po pierwotnym zakażeniu. Należy zaznaczyć, że przeprowadzaliśmy reaktywację u myszy nawet rok po pierwotnym zakażeniu i nie zaobserwowano istotnych różnic w odpowiedzi.
2. Po znieczuleniu myszy umieszcza się na transiluminatorze TM20 Chromato-Vu, który emituje promieniowanie UV-B o szczytowej długości fali 302 nm, w taki sposób, aby na światło UV-B wystawione było tylko jedno oko. Każda mysz jest eksponowana na dawkę 250 mJ promieniowania UV-B na cm².
3. Reaktywację określa się poprzez wymaz z oczu sterylnym aplikatorem bawełnianym, który w dniu 0 (przed ekspozycją na UV-B w celu kontroli spontanicznego wydalania wirusa) oraz następnie w dniach od 1 do 7 po napromieniowaniu UV-B jest zanurzony w 1 ml pożywki Vero. Materiał z wymazu ocenia się zgodnie z opisem w sekcji 2.5). W przypadku wymazów zawierających wirusa zakaźnego, ilość wirusa jest miareczkowana standardowym testem plackowym z użyciem płytek 12-dołkowych.

4. Ocena kliniczna

1. Myszy są oceniane pod kątem klinicznych objawów choroby oczu przez zaślepionego obserwatora przy użyciu binokularowego mikroskopu stereoskopowego.
2. Zmętnienie rogówki ocenia się w skali od 0 do 4, gdzie 0 oznacza przejrzystą stromę, 1 oznacza lekkie zmętnienie stromy, 2 oznacza umiarkowane zmętnienie z widocznymi cechami tęczówki, 3 oznacza gęste zmętnienie z utratą wyraźnych detali tęczówki z wyjątkiem brzegów źrenicy, a 4 oznacza całkowite zmętnienie bez możliwości wglądu w tylne części oka.
3. Neowaskularyzację ocenia się w skali od 1 do 8, dzieląc rogówkę na 4 równe kwadranty i określając stopień unaczynienia w każdym z tych kwadrantów.
4. Zapalenie powiek mierzy się w następujący sposób: 0 – brak zmian; 1 – minimalny obrzęk powiek; 2 – umiarkowany obrzęk i strupowa wydzielina oczna; 3 – silny obrzęk, umiarkowana utrata włókien wokół oczu i zmiany skórne; oraz 4 – silny obrzęk z całkowitym zaklejeniem oczu strupami, silna utrata włókien wokół oczu oraz zmiany skórne.
5. Objawy zapalenia mózgu obejmowały zgarbienie grzbietu, zjeżoną sierść i wyraźne nieprawidłowości neurologiczne. Myszy są uśmiercane w przypadku wystąpienia istotnych objawów zapalenia mózgu.

5. Reprezentatywne wyniki

Opisany powyżej model nawrotów został po raz pierwszy opublikowany przez Shimelda et al. ^1-3. Został on przez nich przetestowany, a nasze laboratorium stosuje jego zmodyfikowaną wersję w celu publikacji wielu prac naukowych na przestrzeni lat ^4-15. Model ten wykorzystano do zdefiniowania roli, jaką cytokina interferon-γ odgrywa w nawrotowej postaci choroby wywołanej przez HSV-1 ¹⁰. Jak pokazano na Rysunku 3, myszy z niedoborem IFNγ wykazywały cięższy przebieg choroby rogówki niż myszy typu dzikiego ¹⁴. Model ten z powodzeniem wykorzystano również do określenia wartości terapeutycznej kilku różnych konstruktów szczepionkowych ^6,10,11. Należy zauważyć, że w jednym przypadku przetestowana szczepionka działała dobrze profilaktycznie, ale nie okazała się skuteczna terapeutycznie ⁶. Jednakże, gdy przetestowano szczepionkę wirusową niezdolną do replikacji, okazała się ona skuteczna nie tylko profilaktycznie, ale również bardzo skuteczna terapeutycznie ^10,11 (patrz Rysunek 5 w referencji 10). Niedawno wykorzystaliśmy ten model, aby sprawdzić, czy w przypadku myszy z nawrotowym HSK można wykryć różnice ze względu na płeć. Jak demonstruje Rysunek 1, samce myszy C57BL/6 wykazują znacznie mniejszą mętność rogówki niż samice myszy C57BL/6. Podobnie, podczas oceny neowaskularyzacji rogówki, u samców myszy stwierdzono znacznie mniejszy wzrost nowych naczyń w rogówce niż u samic (Rysunek 2). Obecnie badamy, czy fenotyp ten jest specyficzny dla szczepu, przeprowadzając podobne analizy u innych szczepów myszy. Ustalimy również, czy różnica ta wynika z braku testosteronu, czy z obecności estrogenu.

Rycina 1. Choroba rogówki u samców i samic myszy szczepu C57BL/6 po reaktywacji wywołanej promieniowaniem UV-B. U myszy z utajoną infekcją wywołano reaktywację za pomocą naświetlania UV-B, a następnie monitorowano zmętnienie rogówki przez 35 dni. Liczba myszy wykorzystanych w tych badaniach wynosiła: samce, n = 15; samice, n = 15. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. *W dniach 14-35 u samic myszy C57BL/6 zaobserwowano znacznie silniejszy przebieg choroby wywołanej wirusem (P = 0,001 do 0,01).

Rycina 2. Choroba rogówki u samców i samic myszy szczepu C57BL/6 po reaktywacji indukowanej UV-B. U myszy z utajoną infekcją wywołano reaktywację za pomocą napromieniowania UV-B, a następnie monitorowano neowaskularyzację rogówki przez 35 dni. Liczba myszy wykorzystanych w tych badaniach wynosiła: samce, n = 15; samice, n = 15. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. *Odnotowano istotnie większy stopień choroby indukowanej wirusem u samic myszy C57BL/6 w dniach 14-28 (P = 0,001 do 0,01).

Dyskusja

Opisany tutaj nawrotny model opaliskowego zapaleniay keratostromalnego (HSK) umożliwia badaczowi analizę ludzkiego HSK w modelu, który jest bardziej spójny z przebiegiem obserwowanym podczas choroby u ludzi. Zatem zaletą tego modelu jest to, że choroba rozwija się w kontekście układu odpornościowego, który został już pobudzony podczas pierwotnego zachorowania. Ponieważ myszy te wykazują już odpowiedź immunologiczną na HSV-1, czynniki reaktywujące tę odpowiedź są prawdopodobnie inne niż te, które pierwotnie ją wywołały. W...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Sigma	D5796
Płodowa surowica bydlęca	Atlanta Biologicals	S11150
Surowica ludzka	Sigma	S7023
L-glutamina	Cellgro	25-005-C1
Pen/Strep	Sigma	P4333
Fungizone	Invitrogen	15290018
Wirówka	Sorvall	Legend RT
Wirówka	Beckman	52-21
Transiluminator	UVP	95-0452-02
Sonikator	Branson	Sonifier 450
Probówki Oak Ridge	Nalgene	Z 720410
Kolby- 7150	Corning	430823
Płytki- 12-dołkowe	Corning	CLS 3513
Płytki- 48-dołkowe	Corning	CLS 3548
Sterylne probówki stożkowe- 30 ml	Corning	CLS 430828
Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką	Fisher	23-400-125
Igły 30G	Becton-Dickinson	305106
Igły 25G	BD	305122
Strzykawka 10 ml	BD	309602
Strzykawka 10 ml	BD	309604