Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie funkcji rodziny BCL-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4291

⸱

5 października 2012

 ,  , 
1Department of Oncological Sciences, Department of Dermatology, The Tisch Cancer Institute, The Graduate School of Biological Sciences, Mount Sinai School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Biochemicznie zdefiniowane duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) stanowią wygodny system modelowy do analizy oddziaływań białek z rodziny BCL-2, co ma bezpośrednie znaczenie dla lepszego zrozumienia mitochondrialnej ścieżki apoptozy. Przedstawiono metodę otrzymywania LUVs, wraz ze standardowymi kombinacjami białek z rodziny BCL-2 oraz kontrolami służącymi do badania permeabilizacji LUVs.

Streszczenie

Rodzina BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) składa się z około dwudziestu białek, które współpracują w celu utrzymania przeżywalności komórek lub inicjacji apoptozy1. W następstwie stresu komórkowego (np. uszkodzeń DNA), proapoptotyczne efektory z rodziny BCL-2, BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) i/lub BAX (BCL-2 associated X protein), ulegają aktywacji i naruszają integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej (OMM) poprzez proces nazywany permeabilizacją zewnętrznej błony mitochondrialnej (MOMP)1. Po zajściu MOMP, białka proapoptotyczne (np. cytochrom c) przedostają się do cytoplazmy, promując aktywację kaspaz, co prowadzi do szybkiego wystąpienia apoptozy2.

Aby BAK/BAX mogły wywołać MOMP, wymagają one przejściowych oddziaływań z członkami innej proapoptotycznej podgrupy rodziny BCL-2, białkami zawierającymi wyłącznie domenę homologii BCL-2 nr 3 (BH3-only), takimi jak BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Antyapoptotyczne białka rodziny BCL-2 (np. BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulują przeżywalność komórkową poprzez ścisłą kontrolę oddziaływań między BAK/BAX a białkami BH3-only zdolnymi do bezpośredniego indukowania aktywacji BAK/BAX7,8. Ponadto dostępność antyapoptotycznych białek BCL-2 jest regulowana przez białka BH3-only pełniące rolę sensytyzatorów/derepresorów, takie jak BAD (BCL-2 antagonist of cell death) lub PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), które wiążą i hamują członków antyapoptotycznych7,9. Ponieważ większość repertuaru antyapoptotycznego BCL-2 jest zlokalizowana w OMM, decyzja komórki o utrzymaniu przeżywalności lub wywołaniu MOMP jest determinowana przez liczne oddziaływania rodziny BCL-2 w tej membranie.

Duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) stanowią model biochemiczny służący do badania zależności pomiędzy interakcjami rodziny BCL-2 a permeabilizacją błony10. LUVs składają się z określonych lipidów, które są dobierane w proporcjach wyznaczonych w badaniach składu lipidowego mitochondriów Xenopus ekstrahowanych rozpuszczalnikiem (46,5% fosfatydylocholiny, 28,5% fosfatydyloetanoloaminy, 9% fosfatydyloinozytolu, 9% fosfatydyloseryny oraz 7% kardiolipiny)10. Jest to wygodny system modelowy do bezpośredniego badania funkcji rodziny BCL-2, ponieważ komponenty białkowe i lipidowe są całkowicie określone i możliwe do kontrolowania, co nie zawsze ma miejsce w przypadku mitochondriów pierwotnych. Choć zawartość kardiolipiny nie jest zazwyczaj tak wysoka w całej zewnętrznej błonie mitochondrialnej (OMM), model ten wiernie naśladuje OMM, aby promować funkcje rodziny BCL-2. Ponadto nowsza modyfikacja powyższego protokołu umożliwia analizy kinetyczne interakcji białek oraz pomiary permeabilizacji błony w czasie rzeczywistym, co opiera się na LUVs zawierających barwnik polianionowy (ANTS: kwas 8-aminonaftalenu-1,3,6-trisulfonowy) i kationowy wygaszacz (DPX: bromek p-ksylenu-bis-pirydyniowy)11. W miarę permeabilizacji LUVs, ANTS i DPX dyfundują od siebie, co skutkuje wykryciem wzrostu fluorescencji. W niniejszej pracy opisano powszechnie stosowane kombinacje rekombinowanych białek rodziny BCL-2 oraz kontrole z wykorzystaniem LUVs zawierających ANTS/DPX.

Protokół

1. Połącz lipidy i wytwórz film lipidowy

  1. Pracując w dygestorium przy minimalnym oświetleniu, lipidy rozpuszczone w chloroformie przenosi się do 1,5 ml bursztynowej fiolki szklanej, używając do tego szczelnej szklanej strzykawki Hamiltona przepłukanej chloroformem. Taka kombinacja pozwoli uzyskać około 4 mg lipidów (Rysunek 1A).
    • Kardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl
    • Fosfatydylocholina 10 mg/ml (PC) - 84 μl
    • Fosfatydyloetanoloamina 10 mg/ml (PE) - 125 μl
    • Fosfatydyloinozytol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl
    • Fosfatydyloseryna 10 mg/ml (PS) - 65 μl
  2. Aby usunąć chloroform, skieruj delikatny strumień gazu obojętnego (np. azot lub argon) do wnętrza fiolki. Po wyschnięciu, co zazwyczaj zajmuje od 2 do 3 godzin, na dnie i ściankach fiolki pojawi się widoczna warstwa lipidowa (Rysunek 1A).

2. Przygotowanie roztworu liposomów

  1. W probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml przygotować 500 μl 12,5 mM ANTS w buforze LUV (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) oraz 500 μl 45 mM DPX w buforze LUV (Rysunek 1B).
  2. Połączyć roztwory ANTS i DPX, wymieszać w wirówce vortex przez 1 min i poddać sonikacji przez 1 min w temperaturze pokojowej. Sonikację przeprowadza się w ultradźwiękowej kąpieli wodnej (np. Branson 3510MTH, bez konkretnych ustawień, po prostu „włączony”). Zapewnia to całkowite rozpuszczenie i homogeniczność roztworów.
  3. Dodać roztwór ANTS/DPX do filmu lipidowego i szczelnie zamknąć fiolkę parafilmem (Rysunek 1B).
  4. Poddać film lipidowy sonikacji w wyżej wspomnianej kąpieli wodnej przez 5 min. Po sonikacji roztwór będzie miał mleczny wygląd. Należy upewnić się, że film lipidowy został całkowicie rozpuszczony, ponieważ małe agregaty lipidowe negatywnie wpłyną na kolejne etapy. Należy również sprawdzić ścianki i dno fiolki, aby upewnić się, że nie pozostały żadne fragmenty filmu lipidowego (Rysunek 1B).

3. Ekstruzja i oczyszczanie liposomów

  1. Złożyć ekstruder zgodnie z wytycznymi producenta, używając buforu LUV do nawilżenia podpórek filtra i membrany poliwęglanowej. Dokręcić obudowę urządzenia tak, aby nie doszło do ubytku objętości podczas ekstruzji, ale nie zbyt mocno, aby nie przerwać membrany. Wskazane jest również przetestowanie ekstrudera za pomocą buforu LUV w celu upewnienia się, że nie ma wycieków ani innych problemów.
  2. Zacząć od umieszczenia roztworu lipidów w prawym strzykawce, przeprowadzić ekstruzję roztworu lipidów 31 razy; LUV zostaną zgromadzone w lewej strzykawce, co zapewni, że wszystkie lipidy przeszły przez membranę przynajmniej raz. Pierwsze kilka przejść może wymagać nieco większego nacisku, aby przejść przez membranę. Jeśli roztwór nagle zacznie szybko przepływać przez membranę, należy sprawdzić, czy membrana nie uległa przerwaniu i w razie potrzeby ją wymienić (Ryc. 1C).
  3. Przygotować kolumnę do przepływu grawitacyjnego Sepharose S-500 o pojemności 10 ml (1,0 cm x 20 cm, objętość złoża 10 ml). Przemyć kolumnę 3 objętościami buforu LUV, poczekać do zatrzymania przepływu i założyć zatyczkę. Ponieważ ten krok zajmuje trochę czasu, zaleca się rozpocząć płukanie w momencie, gdy lipidy są łączone w celu wysuszenia. Kolumnę należy trzymać z zamkniętą zatyczką do momentu użycia.
  4. Dodać wyekstrudowane LUV do kolumny w jednym kroku, unikając zaburzenia powierzchni złoża. Pozostawić bufor do wypłynięcia z kolumny, aż przepływ się zatrzyma, a następnie założyć zatyczkę. Ostrożnie napełnić kolumnę buforem LUV. Ponownie, należy zachować ostrożność podczas dodawania buforu, aby nie naruszyć złoża (Ryc. 1C).
  5. Zdjąć zatyczkę i zebrać 6 frakcji po 1 ml. LUV zazwyczaj eluiują w frakcjach 3 i 4 i można je rozpoznać po mętnej postaci. Po zebraniu frakcji przemyć kolumnę 5 objętościami wody oraz 2 objętościami 20% etanolu. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C (Ryc. 1C).
  6. Przechowywać frakcje w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu analizy.

4. Testowanie frakcji kolumnowych

  1. Następnie frakcje kolumnowe testuje się pod kątem fluorescencji, porównując bufor LUV oraz bufor LUV uzupełniony o 0,5% CHAPS. Frakcje, w których fluorescencja wzrasta pod wpływem obecności CHAPS, zawierają LUV. Do sześciu dołków pipetuje się po 100 μl buforu LUV lub buforu LUV + 0,5% CHAPS, a następnie dodaje 5 μl odpowiedniej frakcji i miesza. We wszystkich badaniach LUV należy stosować nieprzezroczyste, czarne, niepowlekane płytki 96-dołkowe (Ryc. 1D).
  2. Płytkę odczytuje się w temperaturze 37 °C przy następujących parametrach: długość fali wzbudzenia: 355 nm; długość fali emisji: 520 nm; wzmocnienie (napięcie): 125; pozycja optyki: góra (Top); wysokość odczytu: 5,5 mm. Taka konfiguracja dotyczy urządzenia BioTek H1 Synergy z oprogramowaniem Gen 5 2.0 (Ryc. 1D).
  3. Frakcje 3 i 4 zazwyczaj wykazują 5–10-krotny wzrost fluorescencji. Po analizie frakcje zawierające LUV należy połączyć i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności; zostanie oczyszczone około 2 ml lipidów o stężeniu ~ 2 mM (Ryc. 1D).

5. Badania nad rodziną białek BCL-2 z wykorzystaniem LUV

  1. Białka BCL-2 są testowane pod kątem ich zdolności do bezpośredniego indukowania permeabilizacji LUV oraz regulacji aktywności permeabilizującej. Testy LUV są zazwyczaj przeprowadzane w objętościach 100 μl, w temperaturze 37 °C i mogą być analizowane albo w jednym punkcie czasowym po 30 - 60 min (Rysunki 2A-C, 3A-B), albo poprzez badania kinetyczne co 1 - 2 min przez maksymalnie 1 h (Rysunek 2D). Przedstawiono reprezentatywny schemat testu opisujący składniki, stężenia początkowe/końcowe oraz kolejność dodawania (Tabela 1). Zaleca się również, aby czytnik mikropłytek delikatnie wstrząsał płytką przed każdym odczytem. Pierwsze kilka minut często daje sporadyczne odczyty (prawdopodobnie z powodu zmian temperatury, mieszania itp.), dlatego w badaniach kinetycznych zazwyczaj analizujemy punkty danych po 2 - 3 odczytach. Często zdarza się również uzyskanie dużych słupków błędów dla niektórych warunków ze względu na zmienność partii LUV oraz wydajność oddziaływań białkowych przy granicznych stężeniach aktywacji lub inhibicji.
  2. Zapasy białek z rodziny BCL-2 należy rozcieńczyć w buforze LUV do stężenia 100x; konieczne miareczkowania BAX, BID oraz wszystkich pozostałych białek przeprowadza się w celu znalezienia najniższych stężeń niezbędnych do wykrycia minimalnej, zależnej od BAX permeabilizacji LUV wobec braku BID, a także znaczącej synergii między BAX a BID. Ponadto wszystkie pozostałe białka wymagają miareczkowania w celu ograniczenia strat białka i zminimalizowania stężeń kolejno dodawanych białek.

6. Reprezentatywne wyniki

Istnieje wiele możliwości obserwacji i badania regulacji permeabilizacji LUV zależnej od rodziny BCL-2. W celu przygotowania pozytywnej kontroli permeabilizacji LUV stosujemy BAX12 aktywowany detergentem. Detergent, n-octyl-β-D-glukozyd (OG), sztucznie wywołuje aktywację BAX (dla 100 μl OG-BAX o stężeniu 2,3 μM: 5 μg BAX + 0,7% OG w buforze LUV, inkubować przez 60 min w 4 °C, podzielić na alykwoaty i przechowywać w -80 °C), w związku z czym OG-BAX (10 - 100 nM) może być użyty jako wiarygodna kontrola pozytywna. Należy zauważyć, że stężenia OG poniżej 0,025% nie wpływają bezpośrednio na permeabilizację LUV. Obróbka 0,5% CHAPS jest stosowana do wyznaczenia maksymalnej fluorescencji LUV na jeden test, a wartość ta przyjmuje poziom 100%. Wszystkie próby należy przygotować w trzech powtórzeniach. Przykład organizacji testu kontrolnego LUV przedstawiono w Table 1, a odpowiadające mu dane zaprezentowano na Figure 2A.

Koniecznym punktem wyjścia w badaniu permeabilizacji LUV przez białka z rodziny BCL-2 jest ustalenie stężeń BAX i BID, które zapewnią optymalne uwalnianie. Ponieważ poszczególne preparaty białek wykazują różną aktywność permeabilizacji w tle, zaleca się przeprowadzenie miareczkowania przed rozpoczęciem bardziej zaawansowanych analiz. Należy miareczkować BAX (50 - 200 nM) oraz BID (0 - 10 nM) w celu uzyskania minimalnego uwalniania w tle oraz optymalnej synergii, odpowiednio zgodnie z rysunkami 2B-C. Różne formy białka BID można nabyć od R&D Systems; alternatywnie, peptyd domeny BH3 białka BID jest dostępny w firmie Anaspec. Nie istnieje komercyjna forma BAX odpowiednia do testów z LUV, w związku z czym musi on zostać wyekspresowany i oczyszczony zgodnie z opublikowanymi metodami3,13.

Po ustaleniu stężeń BAX i BID oraz ich synergii, powszechnie stosowanym testem jest określenie wpływu białek antyapoptotycznych na zależną od BAX i BID permeabilizację LUV. BCL-xL jest komercyjnie dostępnym członkiem rodziny BCL-2 o działaniu antyapoptotycznym, który w sposób zależny od dawki hamuje aktywność BAX i BID, zazwyczaj w zakresie 5-10-krotnego nadmiaru molowego względem BAX lub BID (Rycina 3A). Efekt hamujący ten można odwrócić poprzez dodanie kolejnych białek typu BH3-only (2-5-krotny nadmiar molowy względem BCL-xL) lub peptydów domeny BH3 (5-10-krotny nadmiar molowy względem BCL-xL), które wiążą się z BCL-xL, umożliwiając tym samym BAX i BID wykazanie synergii i permeabilizację LUV (Rycina 3B). Na Rycynie 3B przedstawiamy efekt pełnowymiarowego rekombinowanego ludzkiego białka PUMAβ; peptyd domeny BH3 białka PUMA wykazuje podobne działanie funkcjonalne (dane nie pokazano)8. Eksperyment ten jest powszechnie nazywany „testem zniesienia represji” (de-repression assay), ponieważ białko PUMA znosi hamujący wpływ BCL-xL na BAX i BID. W warunkach idealnych dodanie znoszącego represję białka/peptydu BH3-only powinno mieć minimalny wpływ na aktywację BAX14.

Schemat procesu syntezy i oczyszczania lipidów; szczegółowe etapy chromatografii i analizy frakcji.
Rycina 1. (A) Lipidy rozpuszczone w chloroformie są łączone, suszone w celu utworzenia filmu lipidowego i zamykane. (B) Przygotowuje się roztwory ANTS i DPX, łączy je i poddaje sonikacji, aby zapewnić pełne rozpuszczenie i homogenizację. Roztwór dodaje się do filmu lipidowego, fiolkę uszczelnia parafilmem i sonikuje przez 5 min w łaźni wodnej. Roztwór przybierze teraz mleczny wygląd. (C) Sonikowany roztwór lipidowy jest wprowadzany do mini-ekstrudera, przetwarzany 31 razy i nanoszony na przygotowaną kolumnę Sepharose S-500 w celu późniejszego oczyszczania. (D) Frakcje uzyskane po chromatografii wykluczania cząsteczkowego są analizowane poprzez porównanie względnych jednostek fluorescencji (RFUs) w buforze LUV oraz w buforze LUV + 0.5% CHAPS. Odczyt dla „buforu LUV” wskazuje fluorescencję tła z nienaruszonymi LUV; warunek „bufor LUV + 0.5% CHAPS” wykaże wzrost fluorescencji wywołany lizą, co świadczy o obecności LUV. Frakcje 3 i 4 zazwyczaj zawierają LUV i są łączone po analizie. Frakcje 5 i 6 zawierają nieinkorporowany ANTS (tzn. znajdujący się poza LUV po ekstruzji), który wykazuje wysoką fluorescencję niezależną od obecności CHAPS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Wykresy słupkowe permeabilizacji LUV przedstawiające efekty miareczkowania BAX i BID; wykres intensywności fluorescencji w czasie.
Rysunek 2. Eksperymenty kontrolne z rodziną BCL-2 oraz miareczkowania BAX/BID z użyciem LUV. (A) Eksperymenty kontrolne. LUV traktowano samym buforem do LUV, 0,025% oktyloglukozydem „OG”, 50 nM BAX lub 50 nM OG-BAX. LUV inkubowano przez 60 min w 37 °C. Procent (%) permeabilizacji wyznaczono poprzez odjęcie fluorescencji w próbce traktowanej buforem od wszystkich pozostałych próbek; 100% permeabilizacji wyznaczono na podstawie próbki solubilizowanej w 0,5% CHAPS; wartości eksperymentalne podzielono przez wartość dla CHAPS, aby uzyskać % permeabilizacji LUV. OG-BAX to BAX aktywowany detergentem, który stanowi wiarygodną kontrolę pozytywną permeabilizacji LUV. (B) Wyznaczenie optymalnego stężenia BAX. LUV traktowano rosnącymi stężeniami BAX (50 – 200 nM) w obecności 10 nM C8-BID „BID” lub samym buforem. (C) Wyznaczenie optymalnego stężenia BID. LUV traktowano rosnącymi stężeniami BID (0 – 10 nM) w obecności 100 nM BAX. (D) Przykład zbioru danych kinetycznych permeabilizacji LUV. LUV traktowano BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Odczyty wykonywano co dwie minuty przez 30 min, poprzedzając każdy odczyt dwusekundowym łagodnym wstrząsaniem płytki. Pierwsze trzy odczyty (0, 2 i 4 min) nie zostały uwzględnione na wykresie. Minimalne i maksymalne względne jednostki fluorescencji (RFU) wyznaczono zgodnie z opisem w sekcji 4.3. Słupki błędów na Rysunkach 2A-C reprezentują odchylenie standardowe z danych z trzech powtórzeń. Dane na rysunku 2D reprezentują test wykonany w dwóch powtórzeniach.

Wykresy słupkowe permeabilizacji LUV; wpływ BID/BAX/BCL-xL i PUMA; analiza eksperymentalna.
Rysunek 3. Przykłady typowych oddziaływań białek rodziny BCL-2 badanych z użyciem LUV. (A) Permeabilizacja LUV indukowana przez BAX i BID jest hamowana przez BCL-xL. LUV inkubowano z 100 nM BAX, 10 nM BID oraz rosnącymi stężeniami BCL-xL (0 - 500 nM). Inkubację LUV prowadzono przez 60 min w 37 °C. (B) PUMA znosi represyjny wpływ BCL-xL, promując funkcję BAX i BID. LUV inkubowano przez 60 min w 37 °C z kombinacjami 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL oraz (0 - 2,5 μM) PUMA. PUMA w stężeniu 2,5 μM zastosowano w przypadku BAX samego. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach.

Kolejność dodawania:123456 
WARUNKILUV
Bufor		OG
(0.7%)		BAX
(2.3 μM)		OG-BAX
(2.3 μM)		CHAPS
(10%)		LUV (duże jednowarstwowe pęcherzyki)
(2 mM)		ŁĄCZNIE
Bufor95 μl    5 μl100 μl
OG (0,015%)92.83 μl2.17 μl   5 μl100 μl
BAX (50 nM)92.83 μl-2.17 μl  5 μl100 μl
OG-BAX (50 nM)92.83 μl  2.17 μl 5 μl100 μl
CHAPS (0,5%)90 μl   5 μl5 μl100 μl

Tabela 1. Przykład testu kontrolnego w celu określenia wpływu OG-BAX na permeabilizację LUV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana metoda generowania LUV umożliwia szybki i wydajny sposób testowania funkcji różnych białek rodziny BCL-2, peptydów oraz powiązanych odczynników w biochemicznie zdefiniowanym środowisku błonowym, podobnym do OMM. W przypadku stosowania wartości końcowych do określenia permeabilizacji LUV, można przygotować wiele płytek, aby przeanalizować setki warunków w ciągu jednego dnia. Ustaliliśmy, że odczynnikami ograniczającymi w tych testach są zazwyczaj jakość i ilość białek rekombinowanych, dlatego poświęcenie odpowiedn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować wszystkim członkom Laboratorium Chipuka za współpracę i wsparcie. Ponadto chcielibyśmy wyrazić wdzięczność Tomomi Kuwanie i Donaldowi Newmeyerowi za opracowanie podstaw eksperymentalnych dla niniejszej pracy. Praca ta była finansowana przez: NIH CA157740 (dla J.E.C.) oraz projekt pilotażowy z NIH P20AA017067 (dla J.E.C.). Praca ta była również częściowo wspierana przez grant badawczy 5-FY11-74 z Fundacji March of Dimes (dla J.E.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-Dioleoil-sn-glycero-3-fosfo–etanolamina "PE"Avanti850725C
L-α-fosfatydylocholina (jajo, kura) "PC"Avanti840051C
L-α-fosfatydyloinozytol (wątroba, bydlęca) "PI"Avanti840042C
L-α-fosfatydyloseryna (mózg, świńska) "PS"Avanti8400320
Kardiolipina (serce, bydlęca - sól sodowa) "CL"Avanti840012C
Zestaw do mini-ekstruzjiAvanti610023
Membrana PC 0,2 µmAvanti610006
Czarna płytka 96-dołkowa CostarFisher Scientific07-200-590
Ludzkie BID cięte przez kaspazę-8R&D Systems882-B8-050
Ludzkie BCL-xL (bez końca C)R&D Systems894-BX-050
Peptydy domeny BH3 BID/PUMAAnaspec61711/62404
Hybrydowy wielomodułowy czytnik mikropłytek Synergy H1BioTekNone

Bibliografia

  1. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
  2. Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
  3. Gavathiotis, E. BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature. 455, 1076-1081 (2008).
  4. Dewson, G. To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).
  5. Dewson, G. Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).
  6. Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX. Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).
  7. Kuwana, T. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).
  8. Chipuk, J. E. Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).
  9. Letai, A. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).
  10. Kuwana, T. lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell. 111, 331-342 (2002).
  11. Lovell, J. F. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  12. Hsu, Y. T., Youle, R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family. J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).
  13. Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization. Cell. 103, 645-654 (2000).
  14. Du, H. BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak. J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Permeabilizacja b onyekstruzja lipid wfiltracja elowatest ANTS DPXpomiar fluorescencjimiareczkowanie bia kakontrola detergentemb ona mitochondrialna
Badanie funkcji rodziny BCL-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.