Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans

DOI:

10.3791/4319

⸱

3 grudnia 2012

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of North Texas

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano tutaj technikę in vivo obrazowania struktur podkomórkowych u zwierząt poddanych anoksji, z wykorzystaniem komory mikroinkubacyjnej z przepływem gazu w połączeniu z konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem. Metoda ta jest prosta i wystarczająco elastyczna, aby dostosować ją do różnych parametrów eksperymentalnych i systemów modelowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabdits elegans był szeroko wykorzystywany w badaniach nad odpornością na stres, co jest ułatwione przez przejrzystość stadiów dorosłych i embrionalnych, a także dostępność mutantów genetycznych i szczepów transgenicznych wykazujących ekspresję licznych białek fuzyjnych1-4. Ponadto dynamiczne procesy, takie jak podziały komórkowe, można obserwować z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych białek reporterowych. Badanie mitozy można usprawnić poprzez zastosowanie eksperymentów time-lapse w różnych systemach, w tym w nienaruszonych organizmach; w związku z tym wczesny embrion C. elegans dobrze nadaje się do takich badań. Przedstawiona tutaj technika umożliwia obrazowanie in vivo struktur wewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na stres anoksyczny (99,999% N2; <2 ppm O2) z wykorzystaniem prostego układu przepływu gazu w wysokiej klasy mikroskopie. Komora mikroinkubacyjna jest stosowana w połączeniu z przepływem azotu i konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem w celu stworzenia kontrolowanego środowiska, w którym można obrazować zwierzęta in vivo. Wykorzystując gamma-tubulinę oraz histon znakowane GFP, można monitorować dynamikę i zatrzymanie podziału komórkowego przed, w trakcie i po ekspozycji na środowisko pozbawione tlenu. Wynikiem zastosowania tej techniki są wysokorozdzielcze, szczegółowe filmy i obrazy struktur komórkowych w blastomerach embrionów poddanych deprywacji tlenowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek

  1. Przygotować lub pozyskać odpowiedni transgeniczny szczep C. elegans przy użyciu metod transgenicznych, z centrum zasobów genetycznych Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) lub od współpracownika. W tym przypadku wykorzystujemy szczep TH32 (pie-1::tbg-1::GFP; pie-1::GFP::H2B)5 do wizualizacji chromosomów i centrosomów jako markerów podziału komórkowego.
  2. Uzyskać zsynchronizowaną populację, stosując jedną z trzech metod: 1) rozbić dorosłe osobniki z jajami w roztworze podchlorynu i wykorzystać pozostałe embriony6, 2) przenieść dorosłe osobniki z jajami na płytkę z pożywką i pozwolić im składać jaja przez 1-2 hr lub 3) wybrać larwy L4 z mieszanej populacji i przenieść je na nową płytkę z pożywką.
  3. Hodować nicienie w temperaturze 20 °C do stadium młodej dorosłości z jajami, co zajmie około 96 hr od wyklucia, 72 hr od stadium larwy L1 lub 24 hr po linieniu L4. Embriony (stadium 2-20 komórek) in utero zawierają duże blastomery i jądra, które są optymalne odpowiednio do obrazowania zmian podkomórkowych i podjądrowych. Metoda ta pozwala na uzyskanie populacji młodych dorosłych osobników zawierających liczne wczesne embriony.

2. Przygotowanie preparatów i konfiguracja komory anoksycznej

  1. Przygotować komorę wilgotną do przechowywania przygotowanych szkiełek, umieszczając wilgotny ręcznik papierowy w dużej szalce Petriego lub pojemniku przykrytym odpowiedniej wielkości pokrywką.
  2. Przygotować roztopioną 2% agarozę wykonaną w odsolonej wodzie H2O, podgrzewając mieszaninę w naczyniu szklanym w kuchence mikrofalowej lub kąpieli wodnej.
  3. Nanieść 1-3 krople ciepłej agarozy na czyste szkiełko przedmiotowe. Natychmiast położyć drugie szkiełko odwrócone prostopadle na kroplach agarozy, lekko dociskając, aby powstała cienka warstwa pozbawiona pęcherzyków powietrza.
  4. Odczekać do ostygnięcia i powoli rozdzielić dwa szkiełka, pozostawiając warstwę agarozy w całości na jednym z nich. Ważne jest, aby warstwa agarozy była wystarczająco cienka, by nie utrudniać późniejszego ustawienia ostrości w mikroskopie. Możliwość wizualizacji próbki zależy również od konkretnej odległości optycznej używanego obiektywu, która może się różnić w zależności od mikroskopu.
  5. Używając czystej żyletki, przyciąć warstwę agarozy do kształtu małego kwadratu. Przechowywać w przygotowanej komorze wilgotnej do momentu użycia.
  6. Ostrożnie, za pomocą tej samej czystej żyletki, uchwycić krawędź warstwy agarozy i przenieść ją ze szkiełka na okrągłe szkiełko nakrywowe o średnicy 25 mm, unikając gromadzenia się pęcherzyków powietrza pod warstwą agarozy. Wybrane okrągłe szkiełko nakrywowe jest odpowiednio dopasowane do mikroinkubatora.
  7. Nanieść kroplę środka znieczulającego (0,5% tricaine, 0,05% tetramisole w buforze M9) na warstwę agarozy. Wybrać 5-10 nicieni i umieścić je w kropli środka znieczulającego. Odczekać 1-3 min, aż nicienie przestaną się poruszać.
  8. Uzasadnieniem dla obserwacji embrionów wewnątrz macicy dorosłego osobnika, zamiast embrionów wypreparowanych, jest zminimalizowanie ryzyka wysuszenia embrionów oraz ich przemieszczania się pod wpływem przepływu azotu przez komorę.
  9. Natychmiast dodać kroplę oleju halokarbonowego na nicienie, aby zapobiec ich odwodnieniu podczas przepływu gazu przez komorę. Ponieważ olej halokarbonowy jest lepki, do pobrania go i naniosia na nicienie można użyć końcówki pipety lub igły do nicieni.
  10. Po przygotowaniu okrągłego szkiełka nakrywkowego z nicieniami, rozdzielić dwie połowy zamkniętego mikroinkubatora perfuzyjnego Leiden, a następnie ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe pionowo na dolnym pierścieniu. Następnie szczelnie zamknąć obie części komory.
  11. Komorę podłączyć do butli z azotem za pomocą elastycznej plastikowej rurki i umieścić w odpowiednim miejscu na stoliku mikroskopu (Rysunek 1C). W tym momencie należy dokładnie sprawdzić rurkę i mikroinkubator pod kątem nieszczelności, upewniając się, że rurka oraz korki portów po bokach komory są bezpiecznie zamocowane. Można również lekko rozprowadzić niewielką ilość wody z mydłem na rurce, aby sprawdzić, czy nie tworzą się pęcherzyki, co wskazywałoby na nieszczelność.

3. Mikroskopia w warunkach anoksji

  1. Zlokalizuj zwierzęta przy mniejszym powiększeniu, a następnie przełącz na odpowiednie większe powiększenie (64x dla tej aplikacji), aby obrazować wybrane tkanki lub komórki, takie jak blastomery embrionalne lub oocyty u osobników dorosłych. Włącz laser 488 nm, aby zobrazować sygnał GFP i zlokalizować białko fuzyjne GFP w wybranych komórkach.
  2. Aby zwizualizować zatrzymanie w konkretnym stadium cyklu komórkowego (np. późna profaza), zidentyfikuj blastomer znajdujący się w wcześniejszym stadium podziału komórki (np. późna interfaza lub wczesna profaza). Markery komórkowe, takie jak położenie centrioli, początek kondensacji chromosomów, lokalizacja chromosomów oraz obecność lub brak otoczki jądrowej, pomogą zidentyfikować stadium cyklu komórkowego (Rycina 2A).
  3. Następnie komorę przepłukuje się azotem (99,999% N2; <2 ppm O2). W tym przypadku zastosowano ciśnienie 6 psi, jednak ciśnienie może wymagać dostosowania i optymalizacji w zależności od wielkości każdego mikroinkubatora i średnicy stosowanych rurek. Kontynuuj monitorowanie blastomerów podczas napełniania komory azotem, dostosowując płaszczyznę ogniskowania w razie potrzeby.
  4. W tym momencie rozpoczyna się obrazowanie time-lapse. Obrazowanie jest prowadzone tak długo, jak jest to konieczne do uchwycenia interesującego zjawiska, w tym przypadku zatrzymania w profazie i dokowania chromosomów do wewnętrznej błony jądrowej. Obrazy są pobierane co 10 sec przez nie więcej niż 30 min. Częstotliwość przechwytywania obrazów oraz ustawienia, takie jak wzmocnienie (gain) i moc lasera, powinny być dostosowane w razie potrzeby.
  5. Czas, w którym embriony reagują na środowisko anoksyczne, może się różnić w zależności od stadium cyklu komórkowego w momencie ekspozycji na anoksję. Zazwyczaj anoksja indukuje zatrzymanie w profazie w ciągu 20-30 min od rozpoczęcia przepływu azotu. Zaobserwowaliśmy anoksyjne zatrzymanie cyklu komórkowego w czasie <20 min. Obrazy można uzyskać w tym przedziale czasowym lub wyizolować konkretne obrazy później z serii time-lapse. Dodatkową opcją jest zastosowanie mikroskopii wideo w celu wizualizacji struktur subkomórkowych w embrionach.
  6. Aby udokumentować powrót ze stanu zatrzymania wywołanego anoksją, wyłącza się dopływ gazu i pozwala komorze powrócić do normoksji poprzez dyfuzję, rejestrując serię time-lapse. Wznowienie progresji cyklu komórkowego i oddokowanie chromosomów następuje zazwyczaj w ciągu 5-20 min od wyłączenia przepływu azotu.
  7. Należy zauważyć, że w oddzielnych eksperymentach do przepływowej mikrokomory wprowadzono wskaźnik anoksji, rezazurynę; ustalono, że w komorze zapada stan anoksji średnio około 19 min po rozpoczęciu przepływu azotu.
  8. Obrazy i filmy są przetwarzane przy użyciu programów Imaris, Image J lub Photoshop, a następnie importowane do programu QuickTime w celu prezentacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans zarodki poddane silnemu niedotlenieniu (anoksji) są w stanie przeżyć dzięki zatrzymaniu procesów biologicznych, w tym rozwoju i podziałów komórkowych7. Indukowane anoksją zatrzymanie podziałów komórkowych można monitorować na poziomie subkomórkowym, wykorzystując komorę mikroinkubacyjną w połączeniu z przepływem azotu oraz konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem, aby stworzyć kontrolowane środowisko umożliwiające obrazowanie zwierząt in vivo (Rycina 1). Struktury ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deprywacja tlenu i animacja zawieszona

Chociaż narażenie na silny niedobór tlenu może być śmiertelne dla niektórych organizmów, niektóre z nich są w stanie przeżyć ekspozycję na anoksję. W przypadku C. elegans przeżycie anoksji zależy od stadium rozwojowego, a odpowiedzią na ten stan jest przejście w odwracalny stan animacji zawieszonej, w którym szereg obserwowalnych procesów biologicznych zostaje zatrzymanych. Podziały komórkowe, rozwój, ruch, odżywianie i procesy reprodukcyjne ustają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy wyrazić wdzięczność za wkład i uwagi członków laboratorium Padilla. Szczepy nicieni wykorzystane w tej pracy zostały udostępnione przez Caenorhabditis Genetics Center, finansowane przez NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dziękujemy dr. Lonowi Turnbullowi za pomoc techniczną w zakresie mikroskopii konfokalnej. Praca ta była wspierana przez grant z National Science Foundation (NSF-IOS, CAREER) przyznany P.A.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki/SprzętSkład
Roztwór podchlorynu0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, dopełnić do 50 ml ddH20
Bufor M93 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 na 1 L ddH2O
Szklane preparaty mikroskopoweFisher Scientific12-550-3433"x1"x1.0 mm
Okrągłe szkiełka przykrywoweElectron Microscopy Sciences72223-01średnica 25 mm
Olej Halocarbon 700SigmaH8898-100ml
Środek znieczulający0,5% trikainy, 0,05% tetramizolu
Zamknięty mikroinkubator perfuzyjny LeidenHarvard Apparatus650041
Azot UHPCalgaz (Air Liquide)>99,9990% N2 <2 ppm O2
Rurki plastikoweVWR89068-4680,062" ID x 0,125" OD
Konfokalny mikroskop z dyskiem wirującymMcBain Systemsinvertedowany mikroskop optyczny Zeiss, system oświetlenia epifluorescencyjnego, konfokalny skaner Yokogawa CSU-10, kamera CCD z mnożnikiem elektronów Hamamatsu.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
  3. Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
  4. Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
  5. Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
  6. Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  7. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
  8. Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
  9. Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. , InTech. (2012).
  10. Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
  11. Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
  12. Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
  13. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  14. Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uk ad przep ywu gazukonfokalny mikroskop z wiruj cym dyskiemkomora mikroinkubacyjnagamma tubulina z oznakowaniem GFPdynamika histon wzatrzymanie cyklu kom rkowegorodowisko z niedoborem tlenu

Powiązane artykuły