Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Podsumowanie

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Streszczenie

W ciągu ostatnich lat coraz bardziej dostrzegany jest wkład pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) w różne aspekty regulacji odpornościowej w płucach. Wykazano, że AECII uczestniczą w produkcji cytokin w zapalnych drogach oddechowych, a nawet pełnią funkcję komórek prezentujących antygen zarówno w przebiegu infekcji, jak i autoimmunizacji zależnej od limfocytów T ^1-8. Dlatego są one szczególnie interesujące również w kontekstach klinicznych, takich jak nadreaktywność dróg oddechowych na antygeny obce i własne, a także w infekcjach, które bezpośrednio lub pośrednio atakują AECII. Niemniej jednak nasza wiedza na temat szczegółowych funkcji immunologicznych pełnionych przez pęcherzykowe komórki nabłonkowe typu II w zdrowych płucach, a także w stanach zapalnych, pozostaje niepełna. Wiele badań dotyczących funkcji AECII przeprowadzanych jest z wykorzystaniem linii komórkowych nabłonka pęcherzykowego myszy lub ludzi ^9-12. Praca z liniami komórkowymi bez wątpienia oferuje szereg korzyści, takich jak dostępność dużej liczby komórek do szeroko zakrojonych analiz. Uważamy jednak, że zastosowanie pierwotnych AECII myszy pozwala na lepsze zrozumienie roli tego typu komórek w złożonych procesach, takich jak infekcja czy zapalne procesy autoimmunizacyjne. Pierwotne AECII myszy mogą być izolowane bezpośrednio od zwierząt cierpiących na takie schorzenia układu oddechowego, co oznacza, że były one poddane wszystkim dodatkowym czynnikom zewnętrznym odgrywającym rolę w analizowanym środowisku. Przykładowo, żywe AECII można wyizolować z myszy zainfekowanych donosowo wirusem grypy A, który w celu replikacji atakuje głównie te komórki ¹³. Co istotne, dzięki infekcji ex vivo AECII izolowanych od zdrowych myszy, można dodatkowo rozszerzyć badania nad odpowiedziami komórkowymi wywołanymi przez infekcję.

Nasz protokół izolacji pierwotnych mysich AECII opiera się na trawieniu enzymatycznym płuc myszy, a następnie znakowaniu otrzymanej zawiesiny komórkowej przeciwciałami specyficznymi dla CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 oraz CD16/CD32. Ziarniste AECII są następnie identyfikowane jako nieznakowana populacja komórek o wysokim rozproszeniu bocznym (SSC^high) i są oddzielane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek ³.

W porównaniu z alternatywnymi metodami izolacji pierwotnych komórek nabłonkowych z płuc myszy, nasz protokół izolacji AECII metodą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem selekcji negatywnej pozwala na uzyskanie nienaruszonych, o wysokiej żywotności i czystych AECII w stosunkowo krótkim czasie. Dodatkowo, w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod izolacji poprzez panowanie (panning) i usuwanie limfocytów za pomocą wiązania magnetycznych kulek sprzężonych z przeciwciałami ^{14, 15}, sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej umożliwia rozróżnianie komórek na podstawie ich wielkości i ziarnistości. Przy dostępności aparatury do cytometrycznego sortowania komórek opisana procedura może być stosowana przy stosunkowo niskich kosztach. Poza standardowymi przeciwciałami i enzymami do dezintegracji tkanki płucnej nie są wymagane żadne dodatkowe odczynniki, takie jak kulki magnetyczne. Izolowane komórki nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych, obejmujących hodowle in vitro i testy stymulacji limfocytów T, a także analizy transkryptomu, proteomu lub sekretomu ^{3, 4}.

Protokół

Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych odczynników i materiałów znajdują się w tabeli na końcu poniższego protokołu. Przed rozpoczęciem pracy przygotować probówki 15 ml (jedna na mysz) zawierające 4 ml dispazy i podgrzać je do 37 °C w kąpieli wodnej. W bloku grzejnym krótko podgrzać niewielkie alikwoty 1 % niskotopliwego agarozy (w wodzie) do 95 °C aż do upłynnienia, a następnie schłodzić do 45 °C do momentu użycia.

1. Przygotowanie płuc myszy

1. Uśmierć mysz poprzez uduszenie CO₂. Uwaga: Nie wykonuj zwichnięcia szyi, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tchawki, co uniemożliwi poprawne wykonanie kolejnych kroków protokołu, takich jak wypełnienie płuc cieczą. Upewnij się, że odruchy nocyceptywne zanikły.
2. Spryskaj mysz etanolem i wykonaj długie cięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej ciała. Odciągnij skórę i futro z brzucha, a następnie ostrożnie przetnij i usuń otrzewną.
3. Odkrwaw mysz poprzez przecięcie lewej i prawej żyły szyjnej (Vena jugularis) oraz tętnicy nerkowej (Arteria renalis). Usuń wypływającą krew za pomocą chusteczek.
4. Ostrożnie przebij, a następnie usuń przeponę, aby odsłonić serce i płuca, odcinając żebra. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić płuc.
5. Za pomocą kaniuli 26G i strzykawki 10 ml wypełnionej zimnym roztworem soli fosforanowej (PBS), przebij prawą komorę serca i przepłucz płuca PBS, aż do całkowitego usunięcia krwi.
6. Wycinając i usuwając gruczoły ślinowe, odsłoń tchawicę. Ostrożnie przetnij również mięśnie otaczające tchawicę.
7. Wprowadź kaniulę dożylną 22G do tchawicy, wyjmij igłę i przesuń plastikowy cewnik w stronę płuc. Zabezpiecz cewnik, zawiązując wokół tchawicy i cewnika mały kawałek nici.

2. Trawienie enzymatyczne tkanki płucnej

W razie potrzeby można przygotować próbkę płynu z płukania przedsionkowo-pęcherzykowego, przepłukując płuca przez cewnik wprowadzony do tchawicy za pomocą PBS lub pożywki przed przejściem do następnego kroku.

1. Za pomocą strzykawki 2 ml ostrożnie wstrzyknij do płuc przez cewnik maksymalną objętość 2 ml dyspazy (z pobranej porcji 4 ml), tak aby wszystkie płaty były w pełni rozprężone. Zamień strzykawkę na strzykawkę 1 ml zawierającą 0,5 ml upłynnionego agarozy i również wstrzyknij ją do płuc.
2. Pozostaw strzykawkę na cewniku, aby zapobiec cofaniu się agarozy, a następnie natychmiast przykryj płuca papierem laboratoryjnym i lodem. Pozostaw agarozę do zżelowania na kilka minut.
3. Usuń papier, lód, strzykawkę oraz cewnik, przetnij tchawicę i wypreparuj z klatki piersiowej płuca, serce i grasicę. Następnie wypłucz płuca w naczyniu z PBS i usuń serce, grasicę oraz pozostałą część tchawicy.
4. Umieść płuca w pozostałych 2 ml dyspazy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 min.

3. Przygotowanie zawiesiny komórek płuc

1. Wyjąć płuco z roztworu dyspazy i przenieść je do naczynia zawierającego 7 ml przeciwciała anty-CD16/32 (stężenie końcowe 1 μg/ml) w medium DMEM oraz 100 μl DNazy.
2. Za pomocą pincety całkowicie rozdrobić tkankę płucną poprzez rozrywanie i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc na wytrząsarce ustawionej na 200 rpm. W razie potrzeby zawiesinę komórkową można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego etapu.
3. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonowe sitka, najpierw o oczkach 100 μm, a następnie o oczkach 70 μm, 48 μm i 30 μm. Należy pamiętać o dokładnym płukaniu każdego sitka, a także probówek i naczyń medium DMEM, aby zminimalizować utratę komórek i zmaksymalizować wydajność. W przypadku łączenia próbek można to osiągnąć poprzez sekwencyjne przepuszczanie zawiesin komórkowych z myszy z jednej grupy przez to samo sitko. W przypadku zapchania należy wymienić sitko.
4. W zależności od objętości przenieść filtrat do jednej lub kilku probówek 50 ml i wirować przez 15 min przy 160 x g w temperaturze 4 °C. Odmienić supernatant.
5. Resuspendować osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy erytrocytów (0,15 M NH₄Cl, 0,01 M KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) i szybko przerwać lizę poprzez dodanie 13 ml medium DMEM. Przenieść roztwór do probówki 15 ml i wirować przez 12 min przy 160 x g w temperaturze 4 °C.

4. Barwienie przeciwciałami do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej

1. Resuspenduj komórki w 3 ml koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych, przygotowanego w medium DMEM w rozcieńczeniach odpowiednich dla cytometrii przepływowej. (Przeciwciała zostały wcześniej mianowane w celu ustalenia optymalnych rozcieńczeń roboczych poprzez barwienie 1 x 10⁶ splenocytów w objętości 100 μl. Użyj 3 ml koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych zawierającego optymalne stężenia dla każdego z użytych przeciwciał dla komórek połączonych z maksymalnie pięciu myszy. Jeśli do jednej próbki zostanie połączono komórki z większej liczby myszy, dostosuj objętość).
2. W celu barwienia inkubuj komórki przez 10 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
3. Przemyj komórki, dopełniając probówkę 15 ml medium DMEM i wirując przez 12 min przy 160 x g i 4 °C.
4. W przypadku użycia przeciwciał nie sprzęgniętych lub biotynylowanych w punkcie 4.1: Usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 2 – 3 ml koktajlu przeciwciał wtórnych. Barw przez 10 min w temperaturze 4 °C w ciemności.
5. Przemyj komórki, dopełniając probówkę medium DMEM i wirując przez 12 min przy 160 x g i 4 °C.
6. Resuspenduj komórki w 1 ml DMEM i przefiltruj wstępnie przez filtr 50 μm do probówki do sortowania komórek. Opcjonalnie: Policz komórki, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek w zawiesinie komórek płuc.

5. Sortowanie komórek

1. Przed sortowaniem wymieszać komórki za pomocą wortexa. Do sortowania komórek AECII należy użyć dyszy 100 μm. Ciśnienie płynu osłonowego, a także długości fal emisji i detekcji laserowej zależą od instrumentu wykorzystywanego do cytometrycznego sortowania komórek oraz od fluorochromów użytych w procedurze barwienia przeciwciałami.
2. Zastosować bramkowanie na komórkach SSC^high, które są negatywne dla fluorochromów użytych do barwienia, i posortować je do probówki zawierającej DMEM. Wykorzystać okna rozproszenia przedniego wysokość (FSC-H) względem powierzchni (FSC-A) oraz rozproszenia bocznego wysokość (SSC-H) względem powierzchni (SSC-A), aby wykluczyć dublety lub agregaty komórkowe (szczegóły strategii bramkowania przedstawiono na Ryc. 1a).
3. W celu zebrania posortowanych komórek wirować przez 20 min przy 280 x g i 4 °C.
4. Resuspendować komórki w pożywce hodowlanej lub buforze, zgodnie z wymaganiami dla kolejnych analiz.

Wyniki

Podczas sortowania zawiesin komórek płuc izolowanych od zdrowych myszy, bramka AECII będzie zazwyczaj obejmować około 42 ± 10 % wszystkich zdarzeń. Odsetek ten może być zauważalnie niższy w przypadku użycia myszy z schorzeniami układu oddechowego, takimi jak infekcja wirusowa, ponieważ początkowa zawiesina komórkowa będzie zawierać znacznie wyższą proporcję limfocytów i innych komórek odpornościowych rekrutowanych do dróg oddechowych. W przypadku AECII izolowanych z płuc zainfekowanych IAV w 3. dobie po infekcji zaobserw...

Dyskusja

Nasz protokół izolacji mysich komórek AECII metodą cytometrii przepłyewej oferuje szybki sposób pozyskiwania pierwotnych komórek z płuc myszy do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych. Opisana procedura pozwala uzyskać wysoce żywotne i czyste populacje AECII, których liczba jest wystarczająca do bezpośrednich analiz, takich jak izolacja RNA (patrz Rycina 2b) oraz badania transkryptomiczne. W zastosowaniach funkcjonalnych możliwe jest również hodowanie wyizolowanych komórek, co pozwala

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kaniula dożylna Introcan 22G	Braun	REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 jednostek kazeinolitycznych)	BD Biosciences	354235	podzielić na alikwoty po 4 ml w probówkach 15 ml, przechowywać w -20 °C
Agaroza Biozym Plaque	Biozym	840101	1% w/v w H2O
Deoksynukleaza I z trzustki bydlęcej, 2000 jednostek Kunitza/fiolka	Sigma-Aldrich	D4263	zawartość 1 fiolki rozpuścić na świeżo w 300 μl DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	stosować zgodnie z zaleceniami producenta (niska zawartość glukozy, pirogronian, HEPES)
sitka do komórek (100 μm, 75 μm)	BD Falcon	352360, 352350
siatka nylonowa (48 μm, 30 μm)	Bückmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
filtr CellTrics 50 μm	PARTEC	04-0042-2317
anty-mysie CD16/CD32	BioLegend	101302	klon 93; oczyszczone
anty-mysie F4/80	BioLegend	123116	klon BM8; sprzężone z APC
anty-mysie CD11b	BioLegend	101208	klon M1/70; sprzężone z PE
anty-mysie CD11c	BioLegend	117310	klon N418; sprzężone z APC
anty-mysie CD45	BioLegend	103102	klon 30-F11; oczyszczone
anty-mysie CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; sprzężone z PE
poliklonalne przeciwciała kozie anty-szczurze IgG	BD Pharmingen	550767	poliklonalne, sprzężone z PE
W zależności od dostępnego cytometru przepływowego i laserów można zastosować przeciwciała sprzężone z alternatywnymi fluorochromami.