Artykuł metodologiczny

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

DOI:

10.3791/4333

⸱

29 grudnia 2012

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki natural killer T (NKT) stanowią unikalną subpopulację limfocytów T, które wykazują markery charakterystyczne zarówno dla komórek natural killer (NK), jak i limfocytów T1. W przeciwieństwie do klasycznych limfocytów T, komórki NKT rozpoznają antygeny lipidowe w kontekście cząsteczek CD12. Komórki NKT wykazują niezmienną rearanżację łańcucha TCRα: Vα14Jα18 u myszy oraz Vα24Jα18 u ludzi, co wiąże się z łańcuchami Vβ o ograniczonej różnorodności3-6; są one określane jako kanoniczne lub niezmienne komórki NKT (iNKT). Podobnie jak konwencjonalne limfocyty T, komórki NKT rozwijają się z CD4-CD8- prekursorowych limfocytów T w grasicy po odpowiednim sygnale przekazanym przez CD1d 7. Potencjał wykorzystania komórek NKT w celach terapeutycznych znacznie wzrósł dzięki możliwości stymulacji i ekspansji ludzkich komórek NKT za pomocą α-galaktozyloceramidu (α-GalCer) i różnych cytokin8. Co istotne, komórki te zachowały swój pierwotny fenotyp, wydzielały cytokiny i wykazywały funkcję cytotoksyczną przeciwko liniom komórek nowotworowych. Zatem komórki NKT rozszerzone ex vivo pozostają funkcjonalne i mogą być stosowane w adoptywnej immunoterapii. Jednak immunoterapia oparta na komórkach NKT jest ograniczona przez konieczność stosowania autologicznych komórek prezentujących antygen, a ilość i jakość tych komórek stymulujących mogą się znacznie różnić. Wykazano, że pochodne z monocytów komórki DC u pacjentów z nowotworami wykazują obniżony poziom cząsteczek kostymulujących i produkują mniej cytokin prozapalnych9,10. W rzeczywistości do testowania funkcji komórek NKT u pacjentów z CML stosowano mysie komórki DC zamiast autologicznych APC11. System ten może być jednak wykorzystywany wyłącznie do testów in vitro, ponieważ komórki NKT nie mogą być rozszerzane przez mysie DC, a następnie wykorzystywane do adoptywnej immunoterapii. W związku z tym standaryzowany system oparty na sztucznych komórkach prezentujących antygen (aAPC) mógłby wywoływać efekty stymulujące typowe dla DC, eliminując wady związane z komórkami allogenycznymi lub ksenogenicznymi12, 13. W niniejszej pracy opisujemy metodę generowania aAPC opartych na CD1d. Ponieważ zaangażowanie receptora limfocytów T (TCR) przez kompleksy antygen-CD1d jest podstawowym wymogiem aktywacji komórek NKT, kompleksy antygen: CD1d-Ig stanowią niezawodną metodę izolacji, aktywacji i ekspansji populacji efektorowych komórek NKT.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie aAPC

  1. Przed dodaniem białek do kulek, należy przygotować wszystkie odczynniki i bufory: 0,1 M bufor boratowy; 1X D-PBS (bez Ca2+ i Mg2+); bufor do płukania kulek (1X PBS + 5% ludzkiej surowicy grupy AB + 0,02% azotku sodu); pożywka kompletna (pożywka RPMI + 100 mM pirogronianu sodu, 10 mM roztwór witamin nieessentialnych, 100 mM roztwór witamin MEM, 1% 2-merkaptoetanolu, 10 μM cyprofloksacyny, 5% ludzkiej surowicy grupy AB); bufor MACS (1 L PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+, 5 g BSA i 2 mmol EDTA).
  2. Wypłukać 1 ml kulek Dynabeads M-450 Epoxy przy użyciu 3 ml sterylnego 0,1 M buforu boratowego (kwas borowy i woda, pH 7,0-7,4) w 5 ml przezroczystej fiolce z borokrzemianowego szkła z gwintem.
  3. W oddzielnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 100 μg dimeru hCD1d-Ig oraz 20 μg cząsteczek kostymulujących (np. przeciwciało anty-CD28 mAb) do 1 ml PBS bez Ca2+ lub Mg2+.
  4. Umieścić szklaną fiolkę z kulkami na magnesie i odessać bufor boratowy z kulek. Dodać mieszaninę białek z kroku 1.2 do fiolki i zamknąć ją nakrętką. Natychmiast wymieszać poprzez odwrócenie fiolki, zabezpieczyć nakrętkę parafilmem, umieścić na rotatorze i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Następnego dnia umieścić szklaną fiolkę na magnesie i usunąć mieszaninę białek, uważając, aby nie usunąć kulek. Wypłukać kulki, dodając 3 ml buforu do płukania kulek (PBS z 5% surowicy AB + 0,02% azotku sodu) i inkubując przez 5 min w temperaturze 4 °C na rotatorze. Powtórzyć czynność dwukrotnie.
  6. Kulki można przechowywać w tej mieszaninie do płukania. Aby przygotować funkcjonalne aAPC, pobrać niewielką alikwot i policzyć kulki za pomocą hematocytometru. Sprawdzić stabilność obciążenia białek na kulkach poprzez barwienie przeciwciałami (np. przeciwciałem anty-mouse IgG1 sprzężonym z PE) i przeprowadzenie analizy cytometrii przepływowej.
  7. Aby obciążyć kulki antygenem, pobrać 5 x 107 kulek, przenieść do małej szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml i wypłukać kulki 1 ml sterylnego PBS. Resuspendować wypłukane kulki w 1 ml sterylnego PBS i dodać antygen; na przykład: obciążyć α-GalCer/KRN7000 (5 mg/ml). * Uwaga: Chociaż nie stwierdzono żadnych problemów z rozpuszczalnością lipidów lub tworzeniem się miceli, lipidy należy obchodzić zgodnie z zaleceniami producenta. W szczególności w tych badaniach KRN7000 został rozpuszczony w DMSO (1 mg/ml). KRN7000 i inne antygeny glikolipidowe można również rozpuścić w 0,2 mg/ml PBS zawierającym 0,5% Tween-20 (sonikować przez 2 h w 37 °C). WAŻNE – aAPC muszą być obciążone przez co najmniej 48-72 h przed użyciem.

2. Izolacja komórek CD161+CD3+

  1. Szeperuj monocyty i limfocyty krwi obwodowej (PBMC). W przypadku oddzielania limfocytów od warstwy leukocytowej (buffy coat) lub koncentratu z leukaferezy za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll, najpierw rozcieńcz krew z heparyną równą objętością 1X PBS w temperaturze pokojowej.
  2. Do stożkowych probówek o pojemności 50 ml dodaj 15 ml Ficollu (podgrzanego do temperatury pokojowej). Powoli nanieś 25 ml rozcieńczonej mieszaniny krwi na wierzch warstwy Ficollu. Wiruj przy 2 000 rpm przez 30 min w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.
  3. Ostrożnie pobierz interfejs limfocytowy (biały pierścień między mediami a Ficollu) za pomocą pipety Pasteura i przenieś do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  4. Przemyj komórki, dopełniając probówkę do 50 ml za pomocą PBS i wirując przy 1 500 rpm przez 5 min. Odlej supernatant, połącz zawartość probówek pochodzących od jednego osobnika do jednej probówki i ponownie przemyj monocyty i limfocyty krwi obwodowej (PBMC) za pomocą 20 ml PBS. Następnie policz PBMC i resuspenduj do stężenia 5 x 107 komórek/ml w buforze MACS (1 L PBS bez Ca2+ i Mg2+, 5 g BSA oraz 2 mmol EDTA).
  5. Aby wyizolować frakcję limfocytów T, zacznij od 2 ml PBMC (108 komórek) i dodaj 100 μl roztworu do wzbogacania Pan T z zestawu EasySep Human T Cell Enrichment Kit. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  6. Do roztworu dodaj 100 μl cząsteczek magnetycznych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 min. Doprowadź końcową objętość rozpuszczalnika do 2,5 ml i umieść probówkę w fioletowym magnesie na 5 min. Szybko przelej frakcję CD3+ do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
  7. Przemyj komórki, dodając 5 ml zimnego buforu MACS, policz liczbę żywych komórek i pobierz alikwot do barwienia FACS.
  8. Aby wyselekcjonować komórki CD161+, najpierw resuspenduj wzbogacone limfocyty T w 980 μl lodowatego buforu MACS, dodaj 10 μg przeciwciał mAb anty-CD161 i inkubuj w lodówce przez 10 min.
  9. Wiruj komórki przy 1 500 rpm w temperaturze 4 °C przez 5 min. Następnie resuspenduj osad komórkowy w 800 μl buforu MACS. Dodaj 200 μl mikro kulek anty-mouse IgG1 i inkubuj roztwór przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  10. Podczas tego etapu inkubacji przygotuj kolumnę LS, dodając 3 ml buforu MACS.
  11. Następnie przemyj komórki, wirując przy 1 500 rpm w temperaturze 4 °C przez 5 min. Resuspenduj komórki w 3 ml buforu MACS. Następnie przenieś komórki pipetą do kolumny separacyjnej LS MACS. Pamiętaj, aby pipetować powoli, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Przepłucz kolumnę, dodając 3 ml buforu MACS. Powtórz dwukrotnie.
  12. Dodaj 3 ml świeżego buforu MACS i wyjmij kolumnę z magnesu. Umieść kolumnę w probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Włóż tłok i wypchnij zawartość, aby uzyskać oczyszczone komórki CD161+CD3+. Policz frakcję wzbogaconą w komórki NKT. Powinieneś otrzymać od 2 do 4 milionów komórek.

3. Ekspansja komórek NKT za pośrednictwem aAPC

  1. Przygotować kokulturę, dodając 106 wzbogaconych limfocytów T CD161+CD3+ oraz 106 aAPC do 16 ml pożywki kompletnej (pożywka kompletna + IL-2, 100 U/ml). Wysiać tę mieszaninę, dodając objętość końcową 160 μl/dołek do 96-dołkowej płytki polistyrenowej z dnem w kształcie litery U, traktowanej do hodowli tkanek, z pokrywką ograniczającą parowanie. Wymieniać pożywkę co 7my dzień, dodając 80 μl świeżej pożywki.
  2. Zebrać komórki, policzyć je i przeprowadzić barwienie FACS w 12-14 dniu.
  3. Ekspandowane komórki NKT można wysiać ponownie zgodnie z opisem w kroku 3.1; w szczególności resuspendować 106 ekspandowanych limfocytów T i 106 aAPC w 16 ml pożywki kompletnej. Wysiać tę mieszaninę, dodając 160 μl/dołek do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Kontynuować odświeżanie pożywki kokultury co 7my dzień, dodając 80 μl świeżej pożywki.
  4. Zaleca się zamrozić nadmiar komórek NKT po drugiej rundzie ekspansji (1 x106/krioprobetka w 1 ml 5% DMSO/ 95% FBS).

4. Test funkcjonalny: stymulacja komórek NKT za pośrednictwem aAPC

  1. Przygotować 5x104 komórek NKT/do studzienki z 5x105 aAPC w końcowej objętości 200 μl (pożywka kompletna) w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U.
  2. zebrać nadsącz z hodowli komórkowej do analizy ELISA po 24–48 h.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisujemy metodę generowania sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) na podstawie CD1d-Ig, tworzonych poprzez kowalencyjne sprzęganie CD1d-Ig oraz przeciwciała mAb anty-CD28 z kuleczkami magnetycznymi w celu stymulacji komórek NKT, co stanowi zestandaryzowaną metodę propagacji komórek NKT (Rysunek 1). Najpierw należy wykazać, że białka fuzyjne CD1d-Ig są stabilnie unieruchomione na powierzchni kuleczek magnetycznych. Jak pokazano na Rysunku 2A, zarówno CD1d-Ig, jak i przeciwciała anty-CD28 były wyrażone na powierzchni kuleczek magnetycznych. Aby zbadać zdolność stymulacyjną aAPC, hodowaliśmy wspólnie hybrydomy komórek NKT z aAPC przez noc, pobrano nadsącz z hodowli i zmierzono produkcję IL-2 za pomocą testu ELISA. Stwierdzono, że aAPC oparte na CD1d-Ig były w stanie stymulować hybrydomy komórek NKT na poziomach równych lub wyższych niż ich komórkowe odpowiedniki (Rysunek 3, dane nieprzedstawione). Co ciekawe, odkryliśmy, że nasze mysie hybrydomy komórek NKT są stymulowane przez aAPC oparte na ludzkim CD1d (Rysunek 2B), co zapewnia prostą metodę testowania każdej partii aAPC.

Następnie postanowiliśmy zademonstrować potencjał propagacyjny aAPC, w związku z czym wyizolowano ludzkie limfocyty T z krwi obwodowej. Najpierw frakcję limfocytów T CD161+CD3+ wzbogacono za pomocą separacji koralikami magnetycznymi. Następnie limfocyty T stymulowano dwa razy w tygodniu aAPC obciążonymi α-GalCer. Co istotne, stwierdziliśmy, że nawet przy stosunkowo niskiej początkowej populacji komórek NKT (0,03%), byliśmy w stanie zwiększyć liczbę komórek do ~67% Vα24+Vβ11+ (Rysunek 3). Namnożyliśmy komórki NKT z PBMC wielu zdrowych ochotników oraz pacjentów onkologicznych i stwierdziliśmy, że aAPC obciążone α-GalCer były w stanie zwiększyć populację komórek NKT w obu grupach. Warto zauważyć, że tempo ekspansji było w wysokim stopniu zależne od dawcy. Zgodnie z oczekiwaniami, im wyższa była początkowa populacja komórek Vα24+, tym większy był odsetek ekspansji. Ponadto, rozpoczynając od populacji 2 milionów komórek T CD161+CD3+, można uzyskać >107 komórek po dwóch rundach ekspansji (Tabela 1). Około 80-90% namnożonych komórek NKT to komórki CD4+, ~5% to CD8+, a pozostałe to prawdopodobnie podwójnie negatywne komórki NKT CD4-CD8-. Te namnożone komórki NKT mogą być wykorzystane do badań funkcjonalnych, co pokazano na Rysunku 4A-C. Stwierdziliśmy, że nasze namnożone ex vivo komórki NKT pozostają responsywne na stymulację α-GalCer i są silnymi producentami IL-17A, TNF-α oraz IFN-γ. Należy zaznaczyć, że jeśli początkowa populacja wzbogaconych limfocytów T jest niska i nie można przeprowadzić drugiego etapu wzbogacania CD161, ekspansja pośredniczona przez aAPC może nie przynieść oczekiwanych wyników (patrz Rysunek 4D, Dawca 1). Jednakże, jeśli odsetek krążących komórek NKT jest wyższy niż 0,1%, nadal powinno być możliwe uzyskanie znaczącej ekspansji komórek iNKT. Łącznie dane te wykazują, że aAPC oparte na CD1d mogą być skutecznie wykorzystywane do namnażania i stymulowania pierwotnych ludzkich komórek NKT.

Schemat kulek magnetycznych z przeciwciałem anty-CD28 i dimerem CD1d-IgG tworzącym aAPC do badań immunologicznych.
Rysunek 1. Schemat aAPC opartych na CD1d:Ig Części zewnątrzkomórkowe cząsteczki CD1d są połączone z regionem stałym białka ciężkiego immunoglobuliny za pomocą krótkiego łącznika aminokwasowego. Cząsteczki te mogą być łatwo obciążone antygenami lipidowymi, takimi jak α-GalCer, poprzez zwykłą inkubację z nadmiarem odpowiedniego lipidu. aAPC przygotowano poprzez sprzęgnięcie CD1d-Ig oraz przeciwciał anty-CD z kulkami magnetycznymi. W tym układzie CD1d-Ig służy do przekazania specyficznego sygnału antygenowego poprzez TCR, natomiast przeciwciało monoklonalne anty-CD28 dostarcza sygnału kostymulującego.

Histogramy cytometrii przepływowej i wykres słupkowy stężenia IL-2; analiza odpowiedzi immunologicznej.
Rycina 2. Barwienie FACS białek powierzchniowych na aAPC. A) aAPC przetestowano pod kątem obecności dimeru CD1d:IgG (poprzez barwienie z użyciem przeciwciał anty-mysich IgG1 sprzężonych z PE) oraz przeciwciał anty-CD28 (z użyciem przeciwciał anty-mysich IgG2a sprzężonych z FITC). Otwarte histogramy wskazują kontrolę izotypową; wypełnione histogramy reprezentują wskazane przeciwciała. Ekspresyjne dla CD1d-Ig aAPC mogą stymulować produkcję IL-2 przez komórki NKT. B) Hybrydoma komórek NKT myszy Vα14+, DN32.D3, była współhodowana z medium, rozpuszczalnym antygenem (α-GalCer), nieobciążonymi aAPC lub aAPC obciążonymi α-GalCer. Zebrano nadsączniki hodowlane i zastosowano standardowy test ELISA typu sandwich w celu pomiaru produkcji IL-2.

Analiza cytometrii przepływowej; wykresy kropkowe i wykres lizy komórek; badanie odpowiedzi immunologicznej; aktywacja komórek.
Rysunek 3. Ekspansja komórek NKT przez sztuczne komórki prezentujące antygen powlekane CD1d-Ig. (A) Pierwotne komórki podwójnie dodatnie CD3+CD161+ zostały wyizolowane z PBMC za pomocą separacji magnetycznej. Posortowane komórki stymulowano przez 14 dni aAPC powlekanymi CD1d-Ig i obciążonymi α-GalCer. Po stymulacji aAPC komórki barwiono pod kątem Vα24 i Vβ11. (B) Liza linii chłoniaka komórek B pośredniczona przez pierwotne ludzkie komórki NKT. Komórki C1R-CD1d inkubowano z komórkami NKT w indicated ratios w obecności lub braku antygenu, α-GalCer (100 ng/ml) w płytkach 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U przez 20-24 h. Lizę komórek pośredniczoną przez komórki NKT oceniano za pomocą standardowego testu uwalniania 51Cr.)

Wyniki analizy poziomu cytokin metodą ELISA (IL-17A, TNF-α, IFN-γ) oraz cytometrii przepływowej (markery aAPC+CD).
Rysunek 4. Profile cytokinowe komórek NKT namnożonych przy użyciu aAPC. Po dwutygodniowej stymulacji za pomocą aAPC obciążonych α GalCer, namnożone komórki NKT (1×105/studzienkę) współhodowano przez 48 h z rozpuszczalnym α-GalCer, PMA/jonomycyną, mikrokuleczkami anty-CD3/28 lub aAPC obciążonymi α-GalCer (2×105/studzienkę). Produkcję (A) IL-17A, (B) TNF-α oraz (C) IFN-γ zmierzono standardowym testem ELISA dla cytokin. Przedstawione dane obrazują netto produkcję cytokin po odjęciu wartości kontroli negatywnych (pożywka i puste kuleczki). (D) Pierwotne limfocyty T wyizolowano z PBMC przy użyciu magnetycznej separacji kuleczkowej. Posortowane komórki stymulowano przez dwa tygodnie zgodnie z oznaczeniem za pomocą aAPC obciążonych a-GalCer. Komórki barwiono przeciwciałami specyficznymi dla Vα24+ oraz Vβ11+ i analizowano metodą cytometrii przepływowej.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

aAPC mogą być wykorzystywane do badania podstawowych wymagań niezbędnych do aktywacji komórek NKT i posiadają potencjalną wartość kliniczną w zakresie ekspansji komórek NK T ex vivo na potrzeby immunoterapii adopcyjnej. Mescher et al. opisali jeden z pierwszych systemów opartych na kuleczkach, w którym biotynilowane mysie konstrukty jednołańcuchowe MHC klasy I-peptydu połączono z biotynilowanymi cząsteczkami kostymulującymi B7.1 i B7.2 za pomocą streptawidyny na powierzchni mikrosfer lateksowych 14, 15. Podejście to z powodzeniem zastosowano do stymulacji antygenowo specyficznych limfocytów T pochodzących z myszy transgenicznych. Ponadto, ponieważ metoda ta wykorzystuje jednołańcuchowy kompleks MHC-peptyd w celu zapewnienia homogennego obciążenia cząsteczek MHC, każdy docelowy antygen peptydowy wymagałby nowej transfekcji w celu ekspresji pożądanego jednołańcuchowego kompleksu MHC-peptyd, co ogranicza uniwersalność tej metody. Co istotne, grupa dr. Schnecka zapoczątkowała stosowanie aAPC opartych na kuleczkach, opracowując inny niekomórkowy system aAPC, stworzony poprzez sprzęganie HLA-Ig (sygnał 1) oraz anty-CD28 (sygnał 2) z kuleczkami magnetycznymi. Przez jego grupę opracowano HLA-Ig, unikalną multimeryczną formę HLA połączoną z molekularnym rusztowaniem immunoglobulinowym 16, 17. Następnie opracowano aAPC oparte na MHC-Ig, które wykazały skuteczność w ekspansji CTL specyficznych dla CMV oraz MART-1 18. W niniejszej pracy wykazaliśmy, że aAPC oparte na CD1d-Ig mogą być wykorzystywane do ekspansji funkcjonalnych komórek NKT. W jednej z badań wykorzystano podobny system do analizy fizycznej interakcji komórek NK z CD1d 19.

Warto zauważyć, że zaprojektowaliśmy sztuczną komórkę prezentującą antygen, która jest dostosowana do wszelkich wymagań niezbędnych dla optymalnej proliferacji komórek NKT. Metoda ekspansji z użyciem aAPC stanowi prosty i niezawodny sposób namnażania i wzbogacania ludzkich komórek NKT. Nasze aAPC mogą być modyfikowane w celu systematycznej oceny roli panelu potencjalnych cząsteczek kostymulujących oraz analizy ich wpływu na proliferację i funkcję komórek NKT. Tym samym aAPC stanowią solidną i wszechstronną technologię przydatną do indukcji i ekspansji komórek NKT. Generowanie aAPC trwa mniej niż tydzień i nadaje się do produkcji dużych ilości kulecek. Jednak krytycznym krokiem podczas tworzenia aAPC jest potwierdzenie, że CD1d-Ig jest stabilnie unieruchomiony na powierzchni kulecek oraz ocena ich funkcjonalności w celu zapewnienia spójności między partiami. Potencjalnym ograniczeniem systemu jest brak mechanizmu wyłączającego stymulację, poza mechanicznym usunięciem kulecek. W szczególności, zaangażowanie receptora limfocytów T (TCR) z kompleksem antygenu: CD1d/MHC zazwyczaj prowadzi do powstania synapsy immunologicznej we współpracy z cząsteczkami akcesoryjnymi/adhezyjnymi, co może skutkować indukcją czynników hamujących lub supresyjnych zarówno w limfocycie T, jak i w komórce prezentującej antygen. W systemie aAPC czynniki te mogą być upregulowane przez limfocyt T, jednak kulecka nie będzie wykazywać ekspresji kognatywnych ligandów dla tych receptorów.

Ponadto wykazano, że komórki NKT CD4+ hamują odpowiedzi przeciwnowotworowe u myszy i ludzi, zatem możliwe jest, że nieselektywna aktywacja wszystkich komórek NKT (t.j. globalna stymulacja za pomocą α-GalCer) lub aktywacja niewłaściwego podzbioru może doprowadzić do niepożądanych skutków immunologicznych. W związku z tym należy przeprowadzić charakterystykę fenotypową i funkcjonalną populacji komórek NKT expandowanych za pomocą aAPC. Jak pokazano na Rysunku 4, stwierdziliśmy, że stymulacja za pomocą naładowanych α-GalCer aAPC wykazujących ekspresję anty-CD28 może prowadzić do produkcji cytokin typu Th1, Th2 i Th17 przez komórki NKT. W badaniach na myszach zgłoszono, że podanie IL-33, niedawno zidentyfikowanej cytokiny, spowodowało wzrost poziomu krążących cytokin zapalnych, takich jak IL-5 i IL-13. Leczenie komórek NKT za pomocą IL-33 zwiększyło ich produkcję cytokin 20. IL-33 jest specyficznym ligandem dla ST2 i wykazano, że rozpuszczalne ST2 może blokować sygnalizację IL-33. Zatem jako przykład przyszłego zastosowania można by wygenerować aAPC wykazujące ekspresję ST2 i wykorzystać je do sprawdzenia, czy można selektywnie hamować produkcję cytokin Th2 przy jednoczesnym indukowaniu sekrecji cytokin Th1 przez komórki NKT. Poinformowano również, że dożylne wstrzyknięcie aAPC wykazujących ekspresję Kb myszom C57BL/6 skutkowało zmniejszeniem przerzutów nowotworu do płuc 21. Co ważne, dane te demonstrują, że aAPC migrują do płuc i są w stanie aktywować podzbiory efektorowych limfocytów T. Zatem można by wygenerować wiele typów aAPC i zbadać interakcje między antygenowo specyficznymi podzbiorami limfocytów T. Podsumowując, badania te wykazują, że aAPC oparte na CD1d-Ig mogą być stosowane jako zamiennik normalnych komórkowych APC i mają potencjał do usprawnienia obecnych podejść klinicznych w zakresie adoptywnej immunoterapii opartej na komórkach NKT.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Priyanka Subrahmanyam za pomocne dyskusje. Autorzy nie wykazują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych. Praca ta była wspierana przez granty z American Cancer Society, NIH/NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 oraz program P30 Tumor Immunology and Immunotherapy dla T.J. Webba. Treść opracowania leży wyłącznie po stronie autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnych opinii National Cancer Institute lub National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ficoll-Paque PLUSGE Life Sciences17-1440
Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T EasySepStemCell Technologies19051
Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD161 znakowane allofikocyjaninąPharmingen550968
Magnes EasySepStemCell Technologies18002
Mikrokulki anty-IgG1 mysieMiltenyi Biotec130-047-101
Dimer XI Rekombinowane Rozpuszczalne Dymeryczne Białko Fuzyjne CD1d:IG mysieBD Biosciences557599
przeciwciało monoklonalne anty-CD28Biolegend302914
Kuleczki epoksydowe M-450Life Technologies150-11
Alfa-galaktozyloceramid (KRN7000)Axxora, LLCBML-SL232-0100
Pożywka RPMI 1640Sigma AldrichR 0883
pirogronian soduGibco11360-070
Niezbędne aminokwasy nieessentialneGibco11140-050
Roztwór witaminGibco11120-052
2-merkapto–etanolGibco
CyprofloksacynaAlexis Biochemicals380-288-G025
PE-Vα24Jα18 Biolegend342904
PE-Vα24 (Klon C15) Beckman CoulterA66907
FITC-Vβ11 (Klon C21) Beckman CoulterA66905
PE-CD1dBiolegend123510
anty-mysie IgG1 znakowane PEBD Biosciences556650
FITC przeciwciało anty-mysie IgG2aBiolegend407105
DPBS, bez wapnia, bez magnezuLife Technologies14190250
Azydek soduSigma AldrichS8032
Albumin surowicy bydlęcejAmerican BioanalyticalAB00440-00100
EDTASigma Aldrich431788
IL-2 (Proleukin)BD Biosciences354043
Ludzkie serum ABAtlanta BiologicalsS40110
Rotator do probówek LabquakeFisher Scientific13-687-10Q
probówki polistyrenowe z okrągłym dnem BD Falcon 5 mlFisher Scientific14-959-1A
Szklane fiolki na próbki Wheaton z nakrętkąFisher ScientificMały (03-343-6A) Duży (03-343-6E)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fowlkes, B. J. A novel population of T-cell receptor αβ-bearing thymocytes which predominantly expresses a single Vβ gene family. Nature. 329, 251-254 (1987).
  2. Prigozy, T. I. Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules. Science. 291, 664-667 (2001).
  3. Davodeau, F. Close phenotypic and functional similarities between human and murine αβ T cells expressing invariant TCR α-chains. J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).
  4. Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. Requirements for CD1d recognition by human invariant Vα24+ CD4-CD8- T cells. J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).
  5. Koseki, H. Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor α chain in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).
  6. Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. An invariant Vα24-JαQ/Vβ11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells. J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).
  7. Porcelli, S. A., Modlin, R. L. The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids. Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).
  8. Harada, Y., et al. Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials. J. Immunother. 28, 314-321 (2005).
  9. Bella, S. D., et al. Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer. Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).
  10. Onishi, H., et al. Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer. Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).
  11. Shimizu, K., et al. Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells. J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).
  12. Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells. Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).
  13. Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells. J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).
  14. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).
  15. Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen). J. Immunol. 170, 228-235 (2003).
  16. Dal Porto, J. A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).
  17. Greten, T. F. Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients. PNAS. 95, 7568-7573 (1998).
  18. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nat. Med. 9, 619-625 (2003).
  19. Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1. J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).
  20. Bourgeois, E. The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production. Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).
  21. Ugel, S., et al. In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer. Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspansja kom rek NKTkompleks CD1d Igfunkcjonalizacja kulek magnetycznychwzbogacanie limfocyt w Tanaliza cytometrycznaalfa galaktozylceramidcz steczki kostymuluj cemononuklearne kom rki krwi obwodowejtest uwalniania chromu

Powiązane artykuły