Wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Podsumowanie

Jontoforeza agonistów i antagonistów neuronalnych podczas zewnikomórkowych rejestracji in vivo jest potężnym sposobem manipulowania mikrośrodowiskiem neuronu. Manipulacje te można najłatwiej przeprowadzić za pomocą wielokanałowych elektrod typu „piggy-back”. W niniejszej pracy opisujemy sposób ich wykonania oraz zastosowania podczas rejestracji słuchowych.

Streszczenie

In vivo rejestracje z pojedynczych neuronów pozwalają badaczowi na analizę właściwości wyładowań neuronów, na przykład w odpowiedzi na bodźce sensoryczne. Neurony zazwyczaj otrzymują wiele pobudzających i hamujących sygnałów doprowadzających (aferentnych) i/lub odprowadzających (eferentnych), które integrują się ze sobą, a ostateczne, zmierzone właściwości odpowiedzi neuronu są kształtowane przez neuronalną integrację tych sygnałów. Aby badać przetwarzanie informacji w układach neuronalnych, konieczne jest zrozumienie różnych sygnałów wpływających na neuron lub układ neuronalny oraz specyficznych właściwości tych sygnałów. Potężną i technicznie stosunkowo prostą metodą oceny funkcjonalnej roli określonych sygnałów docierających do danego neuronu jest dynamiczne i odwracalne tłumienie lub eliminowanie tych sygnałów i mierzenie zmian w odpowiedzi wyjściowej neuronu wywołanych tą manipulacją. Można to osiągnąć poprzez farmakologiczne modyfikowanie bezpośredniego otoczenia neuronu za pomocą wielokanałowych elektrod typu „piggy-back”. Elektrody te składają się z pojedynczej elektrody rejestrującej oraz wielokanałowej elektrody do podawania leków, która może transportować do 4 różnych agonistów lub antagonistów synaptycznych. Substancje farmakologiczne mogą być podawane jontoforetycznie w wybranych momentach podczas eksperymentu, co pozwala na kontrolowane w czasie dostarczanie leków i odwracalną rekonfigurację sygnałów synaptycznych. W związku z tym farmakologiczna manipulacja mikrośrodowiskiem stanowi potężną i niezrównaną metodę testowania konkretnych hipotez dotyczących funkcji obwodów neuronalnych.

W niniejszym materiale opisujemy sposób wytwarzania elektrod typu piggy-back oraz ich zastosowanie w eksperymentach in vivo. System piggy-back pozwala badaczowi na połączenie jednokanałowej elektrody rejestrującej o dowolnych właściwościach (oporność, rozmiar końcówki, kształt itp.) z wielokanałową elektrodą do podawania leków. Stanowi to istotną przewagę nad standardowymi elektrodami wielokanałowymi, w których wszystkie kanały mają mniej więcej podobne kształty i właściwości. Elektrody wielokanałowe zostały wprowadzone ponad 40 lat temu ^1-3 i przeszły szereg ulepszeń konstrukcyjnych ^2,3, aż do wprowadzenia typu piggy-back w latach 80. XX wieku ^4,5. Przedstawiamy tutaj zestaw istotnych ulepszeń w laboratoryjnej produkcji elektrod piggy-back, które umożliwiają głęboką penetrację mózgu w nienaruszonych preparatach zwierzęcych in vivo dzięki stosunkowo cienkiemu trzonowi elektrody, który powoduje minimalne uszkodzenia. Ponadto elektrody te charakteryzują się niskim poziomem szumów podczas rejestracji oraz niską opornością kanałów do podawania leków, co zapewnia bardzo skuteczną jontoforezę wybranych czynników farmakologicznych.

Protokół

1. Wytciąganie elektrod szklanych

1. Wyciągnij elektrodę jednokanałową. Użyj jednokanałowej kapilary szklanej z włóknem i wyciągnij końcówkę do średnicy około 1-2 µm, długości trzonu 10-12 mm i odpowiadającej rezystancji elektrody około 12 MOhm (zakres 5-20 MOhm) mierzonej w 0,9% roztworze NaCl. Niższa rezystancja elektrod spowodowałaby większą aktywność tła, a tym samym większe trudności w izolowaniu aktywności jednostkowej z poszczególnych neuronów. Do wyciągania tej elektrody użyj wyciągacza poziomego lub pionowego z włóknami grzejnymi lub cewkami grzejnymi.
2. Wyciągnij elektrodę wielokanałową. Ze względu na znacznie większą średnicę szkła wielokanałowego i potrzebę równomiernego rozkładu ciepła wokół całego wielokanału, wymagany jest wydajny wyciągacz z cewką grzejną o większej średnicy, a nie z włóknem grzejnym. Pipetę wielokanałową należy umieścić w centrum elementu grzejnego, bez kontaktu z cewką grzejną. Należy pamiętać, że poza opisanymi tutaj pipetami 5-kanałowymi, dostępne są komercyjnie alternatywy 3-kanałowe lub 7-kanałowe. Wyciągnij szkło do końcówki pipety o całkowitej średnicy około 10 µm lub mniejszej. Końcówka zostanie przełamana do właściwej średnicy w następnym kroku, więc dokładny rozmiar końcówki jest mniej istotny podczas procesu wyciągania niż ogólny kształt końcówki elektrody, która powinna być długa i stosunkowo cienka. Pożądany kształt końcówki elektrody przedstawiono na obrazie w Rysunku 1C. Krótkie i tępe kształty elektrod (Rysunek 1B) spowodują znaczne uszkodzenie tkanki podczas wprowadzania do mózgu, natomiast bardzo długie i cienkie kształty elektrod (Rysunek 1A) będą się wyginać, co utrudni przełamanie końcówki elektrody do właściwej średnicy (patrz krok 2).

2. Modyfikacja końcówek elektrod

Zanim dwie elektrody zostaną ze sobą sklejone, muszą one zostać zmodyfikowane. Trzon pojedynczej elektrody należy wygiąć przed przymocowaniem jej do elektrody wielokanałowej, aby upewnić się, że łączny trzon gotowej elektrody typu „piggy-back” będzie tak cienki, jak to możliwe. Dodatkowo należy odłamać końcówkę elektrody wielokanałowej, aby zapewnić niską rezystancję podczas jontoforezy.

1. Zgiąć trzpień elektrody jednokanałowej o około 20 stopni. Należy użyć jak najmniejszego płomienia palnika Bunsena. Typowe „małe” palniki Bunsena z oferty standardowych dostawców sprzętu laboratoryjnego generują płomienie zbyt duże do tego zastosowania. Aby rozwiązać ten problem, należy użyć najmniejszego dostępnego komercyjnie palnika Bunsena, przymocować do jego górnej części igłę strzykawki (~ 18 G) i uszczelnić połączenie cementem dentystycznym. Podczas pracy płomień powinien być słabo widoczny, mieć średnicę około 5 mm lub mniej i wysokość około 8 mm. Każdy ruch powietrza w pomieszczeniu może zgasić taki płomień, dlatego zaleca się pracę w zamkniętym pomieszczeniu lub stosowanie osłon przeciwwietrznych. Przesunąć elektrodę jednokanałową przez płomień, aby zgiąć ją o około 20 stopni. Należy dążyć do tego, aby płomień palnika stopił szkło w obszarze przejścia, około 10 mm od końcówki elektrody. Aby uniknąć stopienia końcówki elektrody, sugerujemy trzymanie jej pod kątem około 45 stopni, z końcówką skierowaną w dół, i stosunkowo szybkie przesuwanie elektrody przez płomień.
2. Odłamać końcówkę elektrody wielokanałowej. Aby zapewnić kontrolę wizualną podczas odłamywania końcówki elektrody, należy użyć mikroskopu z obiektywem minimum 10x i okularami 10x. Do pomiaru rozmiaru końcówki niezbędna będzie również skala pomiarowa umieszczona w okularze. Do mikroskopu należy przymocować kawałek pleksi w taki sposób, aby jego krawędź była widoczna w około jednej trzeciej lub połowie pola widzenia mikroskopu. W naszym przypadku fragment pleksi ma wymiary około 25 x 70 mm, grubość 5 mm i jest przymocowany za pomocą śruby wkręconej w specjalnie wykonany gwint w stoliku mikroskopu. Ważne jest, aby konstrukcja pozwalała na niezależne przesuwanie pleksi względem preparasu. Elektrodę wielokanałową należy umieść w masie plastycznej na szkiełku przedmiotowym, a następnie włożyć szkiełko z elektrodą do uchwytu w stoliku mikroskopu. Używając manipulatorów xy stolika mikroskopu, należy delikatnie przesunąć końcówkę elektrody w stronę kawałka pleksi i obserwować odłamywanie końcówki przez okulary mikroskopu. Należy dążyć do czystego odłamania końcówki elektrody wielokanałowej tak, aby jej średnica całkowita wynosiła około 25-35 µm. Należy odrzucić pipety, których końcówki odłamały się w zbyt dużym rozmiarze lub mają nierówną krawędź przełomu. Odrzucamy około 30% naszych elektrod wielokanałowych ze względu na niepożądany kształt końcówki.

3. Montaż elektrody typu piggy-back

1. Ustawienie elektrod. Usuń element z pleksiglasu użyty w kroku 2.2 ze stołu mikroskopu. Zabeziecz gotową elektrodę wielokanałową w plastelinie na szkiełku przedmiotowym, tak aby końcówka była skierowana lekko ku górze. Skierowanie końcówki w górę będzie istotne w kroku 3.2 podczas sklejania dwóch elektrod. Dzięki temu klej spływa z końcówki, co zapobiega ich zaklejeniu. Włóż zgiętą elektrodę jednokanałową do uchwytu elektrody w wykonanym na zamówienie mikromanipulatorze (Rysunek 2). Opierając się najpierw na prowadzeniu wizualnym, a następnie mikroskopowym, opuść elektrodę jednokanałową na elektrodę wielokanałową. Elektroda jednokanałowa powinna zostać opuszczona bezpośrednio w zagłębienie utworzone przez układ 5 kanałów, tak aby jej końcówka wystawała poza końcówkę elektrody wielokanałowej o około 5-10 µm. Podczas opuszczania elektrody jednokanałowej uważnie obserwuj kąt tworzony między obiema elektrodami. Aby uzyskać najlepszy rezultat, unikaj kątów, w których końcówki są skierowane od siebie; zamiast tego staraj się opuścić elektrodę jednokanałową na wielokanałową idealnie równolegle lub nawet tak, aby jej końcówka najpierw dotknęła elektrody wielokanałowej, tworząc BARDZO niewielki układ w kształcie „klina”. Ponieważ końcówka jednokanałowa jest bardzo elastyczna, wygnie się ona, gdy elektroda zostanie opuszczona nieco niżej po tym, jak końcówka osiągnie górną powierzchnię elektrody wielokanałowej, tworząc czystą końcówkę kompozytową z niewielką wbudowaną sprężystością, która pomaga utrzymać końcówki razem. Jeśli jednak kąt między elektrodą jednokanałową a wielokanałową będzie zbyt stromy (zbyt duży klin), siła sprężystości będzie zbyt wysoka i wygnie układ elektrod w dół.
2. Sklejenie trzonów elektrod. Sklej trzony obu elektrod, używając cyjanoakrylanu (superglue). Nanieś małą kroplę kleju na wąską stronę płaskiej wykałaczki i dotknij nią zespołu elektrod. Zacznij od miejsca najbardziej oddalonego od końcówek i powoli przesuwaj wykałaczkę z kroplą kleju wzdłuż trzonów w stronę końcówek elektrod. Użycie zbyt dużej ilości kleju lub naniesienie go zbyt blisko końcówek elektrod spowoduje zaklejenie otworów elektrod, co sprawi, że elektroda stanie się przynajmniej częściowo niefunkcjonalna.
3. Stabilizacja połączenia cementem dentystycznym. Wymieszaj niewielką ilość cementu dentystycznego i akrylu dentystycznego w małym jednorazowym plastikowym naczyniu lub łódce wagażowej, używając płaskiej wykałaczki. Poczekaj, aż cement stanie się plastyczny, i nałóż niewielką ilość na połączenie między dwiema elektrodami, aby je ustabilizować (materiał różowy na Rysunku 3). Pozostaw do wyschnięcia na około 15 min.
4. Wyjęcie i przechowywanie elektrody. Ostrożnie wyjmij gotową elektrodę typu piggy-back najpierw z uchwytu mikromanipulatora, a następnie odłącz ją od szkiełka przedmiotowego i przechowuj w pojemniku pyłoszczelnym.

4. Przygotowanie roztworów wypełniających elektrody

Przygotuj roztwory do napełnienia elektrod. Ponieważ jontoforeza wymaga cząsteczek naładowanych, większość substancji musi zostać rozpuszczona albo w środowisku kwasowym, albo zasadowym (zazwyczaj odpowiednio przy pH około 3-4 lub pH około 8-10). W Tabeli 1 wymieniono szereg substancji chemicznych często stosowanych w jontoforezie. W przypadku substancji niewymienionych w tabeli, na podstawie wartości pKa określ, czy łatwiej będzie zastosować cząsteczkę w środowisku kwasowym czy zasadowym, aby utrzymać jej ładunek, i rozpuść ją odpowiednio. Dla uzyskania najlepszych rezultatów wszystkie roztwory należy przygotowywać codziennie na świeżo.

5. Napełnianie i przygotowanie elektrod

Bezpośrednio przed użyciem elektrody, należy wypełnić każdą z kanalików odpowiednim lekiem, używając igieł z włókna węglowego o rozmiarze 28 - 34 G przymocowanych do strzykawek z filtrami strzykawkowymi. Wypełnij 4 zewnętrzne kanaliki w konfiguracji 5-kanalikowej wybranymi lekami, a kanalik centralny 3M NaCl, który będzie służył jako kanalik równoważący. Pojedynczy kanalik elektrody rejestrującej należy również wypełnić 3M NaCl. Dodanie do roztworu NaCl barwnika, takiego jak fast green lub czerwień fenolowa, ułatwi widoczność końcówki elektrody podczas jej umieszczania na powierzchni mózgu. Włóż elektrodę do uchwytu elektrody w układzie rejestrującym i wprowadź wszystkie przewody do odpowiednich szklanych kanalików. Użyj izolowanego srebrnego drutu, z którego końcówki zdjęto około 1 cm izolacji. Dla elektrody wielokanałowej powinno być 5 przewodów (4 do kanalików z lekiem i jeden do kanalika równoważącego), plus przewód wzmacniacza, który należy wprowadzić do pojedynczego kanalika elektrody rejestrującej.

6. Włącz moduły pompy do jontoforezy

Włącz moduły pompy do jontoforezy i przetestuj wszystkie cylindry. Funkcja testowania elektrod w każdym module pompy pomoże określić, czy cylinder elektrody jest sprawny. Aby zapobiec wyciekowi leków z cylindrów w czasie, gdy nie są one używane, należy zastosować napięcie zatrzymujące o polaryzacji przeciwnej do ładunku cząsteczki.

Wyniki

W tym eksperymencie jontoforetycznie podano hydrochlororek strychniny, który jest antagonistą receptora glicynowego. Blokowanie inhibicji glicynergicznej zazwyczaj zwiększa częstotliwość wyładowań neuronów. Rysunek 4 przedstawia przykładowe dane z neuronu słuchowego, w którym zarejestrowano odpowiedzi na sinusoidalne bodźce dźwiękowe o rosnącym natężeniu dostarczane do uszu zwierzęcia. Ten rodzaj eksperymentu określa się mianem funkcji częstotliwości wyładowań neuronu w zależności od natężenia bodźca. Głośniejsze dźwięki skutkowały wyższą częstotliwością impulsów (krzywa czarna). Początkowy prąd jontoforezy zastosowany w tym eksperymencie wynosił 15 nA. Po włączeniu prądu i ustabilizowaniu się zmian w funkcji natężenia częstotliwości wyładowań na nowym poziomie (krzywa ciemnoniebieska), prąd wypychania był stopniowo zwiększany do 30, 45 i 60 nA (odpowiednio krzywe pomarańczowa, zielona i jasnoniebieska). W każdym przypadku rejestrowano odpowiedzi neuronu w tym samym zakresie natężeń dźwięku po tym, jak zmiany w funkcjach częstotliwości wyładowań w odpowiedzi na nowy prąd wypychania uległy stabilizacji. Najbardziej odpowiednim prądem wypychania do zastosowania w tym przykładzie był prąd od 45 nA do 60 nA, ponieważ poziomy te nie zmieniały już w różny sposób odpowiedzi neuronu. Wynik ten sugeruje, że przy prądzie 45 nA wszystkie receptory glicynowe tego neuronu zostały już zablokowane przez hydrochlororek strychniny. Każdy dalszy wzrost prądu wypychania i uwolnienie jeszcze większej ilości strychniny nie skutkowało dalszą zmianą funkcji poziomu częstotliwości wyładowań neuronu. Po zakończeniu protokołu prąd wypychania został wyłączony. Powrót odpowiedzi neuronalnych do poziomu bazowego nastąpił po około 25 min (linia czerwona). W zależności od rodzaju i ilości wypchniętego leku proces ten może trwać od kilku sekund do kilkudziesięciu minut.

Lek	Stężenie	pH roztworu	Rozpuszczalnik	Firma	Nr kat.	Typowy prąd retencyjny	Typowy prąd wyrzutu
GABA	500 mM	3.5-4.0	dH2O	Sigma	A-2129	-15 nA	+5 nA do +100 nA
Glicyna	100 mM	3.5-4.0	dH2O	Sigma	G-7126	-15 nA	+5 nA do +100 nA
Jodek bikukuliny	10 mM	3.0	0.165 M NaCl w dH2O	Sigma	B-6889	-15 nA	+5 nA do +60 nA
Chlorowodorek strychniny	10 mM	3.0	0.165 M NaCl w dH2O	Sigma	S-8753	-15 nA	+5 nA do +80 nA
Kwas L-glutaminowy	500 mM	8.0	dH2O	Sigma	G-1251	+30 nA	-10 nA do -150 nA
Kwas L-asparaginowy	500 mM	8.0	dH2O	Sigma	A-8949	+30 nA	-10 nA do -150 nA
Kwas kainowy	1 mM	9.0	dH2O	Sigma	K-0250	+30 nA	-10 nA do -100 nA

Tabela 1. Powszechnie stosowane leki wraz z pH rozpuszczalnika i stężeniem. Tabela zawiera najczęściej używane agoniści i antagoniści synaptyczni stosowani w jontoforezie. Wymienione środowisko pH wynika z konieczności polaryzacji tych substancji, a sugerowane stężenie uwzględnia zmienność skuteczności między różnymi lekami.

Rycina 1. Trzy pipety wielokanałowe o różnej długości końcówek. A: Końcówka tej elektrody 5-kanałowej została wyciągnięta zbyt długo i jest zbyt cienka. Zauważmy, że końcówka jest wygięta i bardzo wiotka. Taki typ końcówki jest bardzo trudny do złamania do pożądanej średnicy. B: Końcówka tej elektrody jest zbyt krótka i tępa. Podczas wprowadzania w głębsze obszary mózgu elektroda ta spowoduje niepotrzebne uszkodzenia tkanki mózgowej z powodu faktu, że staje się ona stosunkowo gruba zaledwie kilka milimetrów za końcówką. C: Przykład elektrody z prawidłowo wyciągniętą końcówką. Mimo że końcówka jest długa i cienka, pozostaje sztywna i można ją łatwo złamać do pożądanej średnicy końcówki.

Rysunek 2. Rysunek zestawu manipulatora elektrody.Zestaw manipulatora jest używany wraz z mikroskopem do montażu elektrod typu piggy-back. Elementy zaznaczone na szaro są produktami dostępnymi w handlu i są wymienione w Tabeli 2. Elementy zaznaczone na niebiesko zostały wykonane na zamówienie w warsztacie naszej instytucji. Są to: 1) stalowa płyta o grubości 1/4 cala o wymiarach 43x26 cm z wywierconymi otworami pod scenę Newport 423, zgodnie ze schematem otworów dostarczonym przez Newport; 2) scena pochylna, która umożliwia pochylenie zestawu pod dowolnymi kątami; 3) łącznik, który montuje uchwyt elektrody do górnej sceny translacyjnej.

Rysunek 3. Zdjęcie przykładowej elektrody typu piggy-back. Gotowa elektroda pięciokanałowa zmontowana z pojedynczą elektrodą rejestrującą. Zwróć uwagę na długi trzpień o długości około 7mm, umożliwiający głębokie rejestracje z mózgu.

Rycina 4. Miareczkowanie prądów wypychania. Wykres przedstawia funkcje częstość-natężenie zarejestrowane z pojedynczego neuronu słuchowego podczas stymulacji uszu zwierzęcia tonami o różnych natężeniach. Głośniejsze dźwięki miały tendencję do wywoływania wyższej częstotliwości wyładowań. Przed aplikacją leku funkcja częstość-natężenie neuronu wykazywała najniższe częstotliwości impulsów (krzywa czarna). Stopniowo zwiększane prądy wypychania blokowały coraz więcej receptorów glicynowych w neuronie, co skutkowało sukcesywnym wzrostem częstotliwości wyładowań. Optymalny prąd wypychania w tym neuronie wynosił 45-60 nA. Przy tych prądach wypychania osiągnięto całkowitą blokadę wszystkich receptorów glicynowych neuronu. Po zakończeniu protokołu eksperymentalnego przerwano jontoforezę i pozwolono neuronie na regenerację. Pełna regeneracja została osiągnięta, gdy funkcja częstość-natężenie w fazie regeneracji pokryła się z początkową funkcją przed podaniem leku. Powielono za zgodą American Physiological Society, z Klug et al, 1995.

Dyskusja

Opisujemy technikę umożliwiającą manipulację mikroobwodem pojedynczego neuronu in vivo, przy jednoczesnym rejestrowaniu odpowiedzi tego neuronu podczas manipulacji eksperymentalnej. Obwody neuronalne są manipulowane poprzez jontoforetyczne podawanie agonistów i antagonistów synaptycznych. Główną zaletą jontoforezy w porównaniu z wtryskiem ciśnieniowym jest to, że jontoforeza nie wymaga fizycznego przemieszczania cieczy z elektrody do tkanki nerwowej, dzięki czemu nie ma ryzyka uszkodzenia tkanki przez przyłożone ciśnienie lub objętość cieczy. Głównym ograniczeniem tej techniki jest brak informacji o bezwzględnym stężeniu leku w tkance oraz o objętości objętej działaniem. Jednakże, ponieważ ilości środków farmakologicznych podawanych za pomocą jontoforezy są znacznie mniejsze i znacznie bardziej precyzyjnie kontrolowalne niż w przypadku wtrysku ciśnieniowego, powrót do stanu wyjściowego po podaniu leku jest zazwyczaj znacznie szybszy i pełniejszy. Mikrojontoforezę z powodzeniem stosowano w wielu systemach neuronalnych, sensorycznych i innych, a najskuteczniej znajduje ona zastosowanie w obszarach mózgu z niewielkim lub brakiem wewnętrznego przetwarzania sygnałów. Wynika to z faktu, że część podanego środka farmakologicznego może dyfundować z miejsca aplikacji do sąsiedniego neuronu i w ten sposób modyfikować właściwości odpowiedzi tego neuronu.

Oddzielne wytwarzanie elektrod jednokanałowych i wielokanałowych pozwala na łączenie elektrod o dowolnych i niezależnych właściwościach. Wyciąganie wspólnie kanałów elektrod i wykorzystywanie niektórych do rejestracji, a innych do jontoforezy, skutkowałoby powstaniem końcówek o bardzo zbliżonych właściwościach, przez co byłyby one albo zbyt duże do rejestracji z pojedynczej komórki, albo zbyt małe do aplikacji leku. Ponadto wysunięcie końcówki jednokanałowej poza końcówki elektrody wielokanałowej o około 20 µm znacznie redukuje szumy w rejestracjach i eliminuje możliwe zakłócenia efektów prądowych wynikających z prądów retencyjnych lub wyrzutowych wpływających na wyładowania neuronu ³.

Elektrody wielokanałowe typu „piggy-back” zostały po raz pierwszy opisane ponad 30 lat temu ^4-6 i z dużym sukcesem wykorzystywano je do analizy obwodów neuronalnych ^{7-18 19-29}. Zatem sama metoda per se nie jest nowatorska ani unikalna. Jednakże szczegóły przygotowania i zastosowania elektrod ulegały modyfikacjom na przestrzeni lat, a zestaw instrukcji opisany w niniejszym opracowaniu okazał się szczególnie prosty i skuteczny, a nie został szczegółowo opublikowany w innym miejscu w literaturze. W szczególności zgięcie końcówki elektrody jednokanałowej pozwala na uzyskanie relatywnie cienkiej końcówki końcowej elektrody typu piggy-back (Rysunek 3), co umożliwia rejestrację z głębokich jąder przy minimalnym uszkodzeniu mózgu; wysunięcie elektrody jednokanałowej ponad elektrodę wielokanałową eliminuje niemal wszystkie efekty prądowe, które często przywoływano jako wadę tej techniki ³. Nowe szczegóły przedstawione tutaj, takie jak skierowanie końcówki elektrody do góry podczas procesu klejenia oraz osadzenie elektrody jednokanałowej w rowku elektrody wielokanałowej, zapewnią wysoką skuteczność przy tworzeniu elektrod typu piggy-back. Technika ta jest stosunkowo łatwa i zazwyczaj może zostać opanowana przez osobę początkującą w ciągu kilku dni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Palnik Bunsena		17928-027	Dostępne wVWR
Dwuskładnikowy cement dentystyczny: "Utwardzanie na zimno" materiał stomatologiczny	Co-oral-ite Dental Mfg. Co	525000	Dostępne wA-M Systems, Inc.
Dwucomponentowy cement dentystyczny: Sieciowanie materiału protetycznego Liquid Compound	Co-oral-ite Dental Mfg. Co	525000	Dostępne wA-M Systems, Inc
Klej w płynie	Henkel	01-06849	Dostępne wLoctite Super Glue
Urządzenie do mikrojonforezy: Neurophore BH-2	Harvard Apparatus	65-0200 & 65-0203	Dostępne wHarvard Apparatus
Izolowany drut srebrny	AM-Systems	785500	Dostępne wAM-Systems
Wyciąg poziomy	Uniwersalny dystraktor Zeitz DMZ-Universal Puller	ND	Dostępne wAutoMate Scientific
Elementy mikromanipulatora: uchwyt elektrody	WPI	M3301EH	Dostępne wWPI
Elementy mikromanipulatora: stół liniowy	Seria Newport 423	423	Dostępne wNewport
Elementy mikromanipulatora: stół obrotowy	Newport RSP-2	RSP-2	Dostępne wNewport
Elementy mikromanipulatora: z translacja	Seria Newport 433	433	Dostępne wNewport
Elementy mikromanipulatora: kątownik 90° ° montaż osi Z oraz XY	Newport 360-90	360-90	Dostępne wNewport
Elementy mikromanipulatora: tłumaczenie osi x / stopień liniowy	Seria Newport 423	423	Dostępne odNewport
Elementy mikromanipulatora: przesuw przesuwu osi y / stopień liniowy	Newport 423	423	Dostępne wSeria Newport
Mikroskop	Leitz Laborlux 11
Mikroskop: cel	Leitz Wetzlar 10x, NA 0,25	519760
Mikroskop: okulary**	Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18	519748
Mikroskop: etap	Leitz Wetzlar	513544
Kapilara wielokanałowa	N/D	612000	Dostępne wA-M systems, Inc
Kapilara jednokanałowa (GC 150F-10)	Harvard Apparatus	30-0057	Dostępne wHarvard Apparatus
Wyciągacz pionowy	Narishige model PE-2
Elementy mikromanipulatora wykonane na zamówienie (zaznaczone jasnoniebieskim kolorem w Rycina 1)
płyta stalowa
podstawa z funkcją przechylania
uchwyt do holderów elektrod
Tabela 2. Producenci i numery katalogowe wszystkich urządzeń i materiałów wykorzystanych w procedurze.