Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie strategii żywienia interferencyjnego za pośrednictwem RNA do badań przesiewowych genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicieni C. elegans

DOI:

10.3791/4373

⸱

13 lutego 2013

 ,  , 
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College, City Universtiy of New York (CUNY), 2Department of Biology, Queens College, The City University of New York (CUNY), 3Biochemistry Program, The Graduate Center, Queens College, The City University of New York (CUNY)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy, jak używać techniki karmienia RNAi do niszczenia docelowych genów i oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może być wykorzystana do badań przesiewowych na dużą skalę w celu identyfikacji potencjalnych składników genetycznych będących przedmiotem zainteresowania, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała za pomocą sygnalizacji DBL-1/TGF-β.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interferencja za pośrednictwem dwuniciowego RNA (RNAi) jest skuteczną strategią obniżania ekspresji docelowego genu1-3. Został zastosowany w wielu systemach modelowych, w tym w roślinach, bezkręgowcach i kręgowcach. Istnieją różne metody uzyskiwania RNAi in vivo4,5. Na przykład gen docelowy może zostać przekształcony w wektor RNAi, a następnie trwale lub przejściowo przekształcony w linie komórkowe lub komórki pierwotne w celu osiągnięcia efektu knockdown genu; alternatywnie zsyntetyzowane dwuniciowe oligonukleotydy ze specyficznych genów docelowych (oligonukleotydy RNAi) mogą być przejściowo przekształcane w linie komórkowe lub komórki pierwotne w celu wyciszenia genów docelowych; lub zsyntetyzowane dwuniciowe cząsteczki RNA mogą być mikrowstrzykiwane do organizmu. Ponieważ nicienie C. elegans wykorzystują bakterie jako źródło pożywienia, karmienie zwierząt bakteriami wyrażającymi dwuniciowe RNA przeciwko genom docelowym zapewnia realną strategię6. Tutaj przedstawiamy metodę karmienia RNAi w celu oceny fenotypu wielkości ciała. Wielkość ciała u C. elegans jest regulowana głównie przez ligand DBL-1 podobny do TGF-β, więc ten test jest odpowiedni do identyfikacji składników sygnalizacyjnych TGF-β7. Użyliśmy różnych szczepów, w tym dwóch szczepów nadwrażliwych na RNAi, aby powtórzyć eksperymenty z karmieniem RNAi. Nasze wyniki pokazały, że szczep rrf-3 dał nam najlepszy oczekiwany fenotyp RNAi. Metoda jest łatwa do wykonania, powtarzalna i łatwa do określenia ilościowego. Co więcej, nasz protokół minimalizuje użycie specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu nadaje się do mniejszych laboratoriów lub tych w głównie na studiach licencjackich.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytek do karmienia RNAi z docelową sekwencją genów

  1. W przypadku korzystania z dostępnych na rynku bibliotek RNAi (np. z Source BioScience LifeSciences) przejdź do kroku 1.4. Alternatywnie, sklonuj docelowe sekwencje genów do wektora L4440, powszechnie używanego plazmidu RNAi robaka8, za pomocą standardowego protokołu klonowania.
  2. Przekształć rekombinowany plazmid w szczep bakteryjny HT115(DE3), hoduj je na płytkach agarowych LB z 25 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny i wybierz pojedynczy klon do wykorzystania w przyszłości.
  3. W międzyczasie przekształć pusty wektor L4440 w szczep bakteryjny HT115, aby użyć go jako kontroli w eksperymentach.
  4. Hodować zarówno rekombinowane, jak i puste bakterie przenoszące L4440 w 1 ml bulionu LB ze 100 μg/ml ampicyliny przez noc w temperaturze 37 °C. Tetracykliny nie dodaje się, ponieważ zmniejsza wydajność RNAi.
  5. Dodać kolejne 5 ml bulionu LB ze 100 μg/ml ampicyliny do nocnej hodowli, inkubować przez kolejne 4-6 godzin w temperaturze 37 °C.
  6. Wysiew 0,5 ml rekombinowanej lub pustej kultury bakteryjnej L4440 przenoszącej na płytki robaków RNAi. Oznacz wszystkie tabliczki nazwą klonu.
  7. Zaznaczyć płytki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w celu wyhodowania trawnika bakteryjnego; są to płytki RNAi z docelową sekwencją genu lub bez. Dla każdego warunku należy przygotować co najmniej 2 płytki.

2. Hodowle robaków na płytkach zasilających RNAi

  1. Wysterylizuj płomieniem końcówkę platynowego kilofa drucianego. Użyj kilofa, aby wybrać 6-10 hermafrodytów w czwartym stadium larwalnym (L4) na każdą płytkę RNAi, która zawiera rekombinowany lub pusty L4440; Zwierzęta będą wykorzystywać bakterie jako źródło pożywienia.
  2. Pozwól hermafrodytom rosnąć w temperaturze 20 °C (standardowy warunek hodowli C. elegans) przez noc, następnego dnia staną się młodymi dorosłymi.
  3. Przenieś 6-10 młodych dorosłych na nową, odpowiednio oznakowaną i przygotowaną płytkę RNAi.
  4. Pozwól dorosłym osobnikom złożyć jaja przez 4-6 godzin, a następnie usuń wszystkie dorosłe osobniki z talerza; ten krok ma na celu synchronizację potomstwa. Po usunięciu matek zacznij liczyć czas. To jest czas zerowy.
  5. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C, aby zwierzęta mogły dorosnąć do określonego stadium rozwoju; w tym protokole wybieramy młodych dorosłych do analizy fenotypowej. W przypadku nokdaunów, które rozwijają się w normalnym tempie, 72-godzinna inkubacja jest wystarczająca, aby zwierzęta stały się młodymi dorosłymi. Jednak różne geny wpływają w różny sposób na rozwój zwierząt. Jeśli RNAi powoduje, że zwierzęta rosną w różnym tempie, młode dorosłe osobniki można zidentyfikować jako te, które nie upłynęły więcej niż 24 godziny od L4 z zakończonym rozwojem sromu i 2-6 zarodkami w macicy (jeśli są płodne). Aby zidentyfikować inne etapy rozwoju, badacz powinien kierować się rozwojem gonad i sromu jako wskazówką.

3. Oceniaj fenotypy wielkości ciała robaków traktowanych RNAi

  1. Umieść dwie warstwy kolorowych taśm etykietowych na szklanym szkiełku. Zrób dwa z tych szklanych szkiełek. Następnie umieść nowy szkiełko podstawowe między dwoma szkiełkami za pomocą taśmy. Rozpuść 2% agarozy w wodzie; Nałóż jedną kroplę na środek nowego szkiełka podstawowego; Następnie dociśnij drugie szkiełko na górze, aby uzyskać cienką warstwę 2% agarozy, jak opisano wcześniej9.
  2. Gdy agaroza zastygnie, zdejmij górne szkiełko podstawowe; szkiełko z podkładką agarozową jest gotowe do załadowania robaków. Etykieta slajdu z nazwą klonu.
  3. Dodać 10 μl 25 mM NaN3 do podpaski agarozowej; pobrać 30-40 zwierząt do roztworu NaN3, aby je unieruchomić; następnie położyć szkiełko nakrywkowe na wierzchu; powtórzyć zarówno dla zwierząt rekombinowanych, jak i pustych zawierających L4440 zawierających RNAi.
  4. Zobrazuj robaki pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą obiektywu 2,5x; tutaj używamy aparatu cyfrowego Leica z oprogramowaniem pomocniczym Qcapture.
  5. Aby przeprowadzić kalibrację, najpierw uchwyć obraz standardowej linijki mikrometrycznej. Następnie otwórz obraz w oprogramowaniu Image-Pro, kliknij "zmierz" i wybierz "kalibracja", a następnie wybierz "kreator kalibracji przestrzennej". Po wybraniu opcji "skalibruj aktywny obraz" kliknij "dalej". Wprowadź nazwę kalibracji i upewnij się, że przestrzenne jednostki odniesienia są ustawione na mikrometr. Następnie zaznacz przycisk "utwórz kalibrację referencyjną" i kliknij "dalej". Kliknij "narysuj linię odniesienia". Pojawi się pasek skali odniesienia. Zmień położenie podziałki tak, aby pasowała do końców mikrometru, a następnie wskaż, że odniesienie wskazuje 1,000 jednostek. Kliknij "OK", "Dalej" i "Zakończ".
  6. Po skalibrowaniu oprogramowania otwórz obraz robaka. Następnie wybierz w menu "pomiar", wybierz "kalibracja", a następnie kliknij "wybierz przestrzenny". Z menu rozwijanego wybierz file nazwa utworzony dla kalibracji mikrometru. Następnie w menu "zmierz" wybierz "pomiary". W oknie, które zostanie otwarte, wybierz narzędzie do rysowania swobodnego i narysuj linię przez środek ciała zwierzęcia od głowy do ogona za pomocą myszy komputerowej (Rysunek 1). Długość zostanie podana w oknie. Teraz masz dwie grupy danych: długość ciała zwierząt leczonych docelowym genem RNAi i zwierzęta kontrolne leczone pustym wektorem L4440.
  7. Eksportuj pomiary długości do pliku Microsoft Excel lub innego odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Następnie porównaj próbki za pomocą testu t-Studenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszych badaniach skupiamy się na regulacji wielkości ciała za pomocą szlaku DBL-1/TGF-β. Utrata funkcji szlaku DBL-1 skutkuje małymi rozmiarami ciała, w tym krótszą długością ciała w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego7,10,11. W ten sposób badania przesiewowe dla mutantów wielkości ciała C. elegans są w stanie zidentyfikować komponenty sygnalizacyjne i modyfikatory TGF-β. Sygnalizacja DBL-1 odbywa się za pośrednictwem konserwatywnego szlaku transdukcji sygnału TGF-β, który obejmuje receptory po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy naszą metodę identyfikacji mutantów C. elegans z wadami wielkości ciała poprzez karmienie RNAi. Metoda ta ma zastosowanie do identyfikacji elementów sygnalizacyjnych TGF-β. Ponieważ takie składniki są wysoce konserwatywne w procesie ewolucji15, takie badania przesiewowe są istotne dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych sygnalizacji TGF-β we wszystkich metazoanach. Ważną kwestią przy projektowaniu takiego ekranu jest szczep wyjściowy. Wykazaliśmy, że zarówno eri-1; lin-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jamesowi Clarkowi za dostarczenie figurek zwierząt w różnych punktach rozwoju. Szczepy C. elegans w tym badaniu zostały pozyskane z Centrum Genetyki Caenorhabditis, które jest wspierane przez NIH National Center for Research Resources (NCRR). Praca ta była wspierana przez CIRG 1817 od CUNY do J.L. i C.S.D.; oraz przez NIH 1R15GM073678-01 i 1R15GM097692-01 do CSD Dziękujemy dr Williamowi J. Rice'owi, dr Nathalii Holtzman i Melissie Silvestrini za komentarze do manuskryptu. Praca ta została wykonana w ramach częściowego spełnienia wymagań dotyczących uzyskania stopnia doktora w Graduate Center of the City University of New York (S. Xiong).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RNAi płytki ślimakowe
17.7 g Worm Medium Mix
60 g Agar
Dodaj H2O do 3 litrów. Autoklaw.
Dodać 3 ml 1M IPTG (sterylne) i 3 ml 25 mg/ml karbenicyliny (sterylne); następnie wlać do szalek Petriego o średnicy 60 mm.

Płytki ślimakowe
17,7 g Medium Worm Mix
0,6 g Siarczan streptomycyny
60 g Agar
Dodaj H2O do 3 litrów. Autoklaw. Wlać do szalek Petriego o średnicy 60 mm.

Worm Medium Mix
55 g Tris-Cl
24 g Tris-OH
310 g Bacto Peptone
800 mg Cholesterol
200 g NaCl
Dokładnie wymieszaj i unikaj kawałków; Ta sproszkowana mieszanina może być przechowywana przez wiele miesięcy przed użyciem.

2% agarozy
0,5 g Agaroza
Dodać 25 ml dH2O. Podgrzej w kuchence mikrofalowej aż do rozpuszczenia.

1M Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)
2 g IPTG
Rozpuścić w10 ml dH2O

1M NaN3
6,5 g NaN3
Dodać dH2O do 100 ml

25 mM NaN3
2,5 ml 1M NaN3
Dodać dH2O do 100 ml

Caenorhabditis elegans z Caenorhabditis Genetics Center
Plazmid L4440 (zawiera gen oporności na ampicylinę)
Szczep bakterii HT115 ( DE3) (zawiera indukowaną przez IPTG polimerazę T7; z niedoborem genu RNAzy III (dsRNAse), który również zawiera gen oporności na tetracykliny)16
60 mm szalki Petriego
100 mm szalki Petriego
14 ml okrągłodenne probówki hodowlane Falcon
szkiełka podstawowe
szkiełka nakrywkowe
1-20 μ l pipetor
20-200 μ l pipetor
200-1000 μ l pipetor
1-200 μ l Końcówki do pipet
200-1000 Μ l końcówki do pipet
1,5 ml Probówki Eppendorf
platynowy druciany pick ślimakowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
  2. Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
  3. Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
  4. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
  5. Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
  6. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  7. Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  8. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  9. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
  10. Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
  11. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
  12. Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
  13. Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  15. De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
  16. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA InterferenceRNAi FeedingGene KnockdownTGF beta SignalingMicroscopic ImagingLength MeasurementStudent s T testWorm Strains

Powiązane artykuły