Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Podsumowanie

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Streszczenie

Interferencja RNA (RNAi) oparta na dwuniciowym RNA jest skuteczną strategią wyciszania ekspresji genów docelowych^1-3. Została ona zastosowana w wielu systemach modelowych, w tym u roślin, bezkręgowców i kręgowców. Istnieje wiele metod wywoływania RNAi in vivo^4,5. Na przykład gen docelowy można wprowadzić do wektora RNAi, a następnie trwale lub przejściowo przetransformować linie komórkowe lub komórki pierwotne w celu uzyskania efektu wyciszenia genu; alternatywnie, syntetyczne dwuniciowe oligonukleotydy z konkretnych genów docelowych (oligo RNAi) mogą być przejściowo wprowadzane do linii komórkowych lub komórek pierwotnych w celu wyciszenia genów docelowych; lub syntetyczne cząsteczki dwuniciowego RNA mogą być mikroiniekcyjne do organizmu. Ponieważ nicień C. elegans wykorzystuje bakterie jako źródło pożywienia, karmienie zwierząt bakteriami ekspresującymi dwuniciowe RNA przeciwko genom docelowym stanowi praktyczną strategię⁶. Przedstawiamy tutaj metodę karmienia w celu wywołania RNAi do oceny fenotypu wielkości ciała. Wielkość ciała u C. elegans jest regulowana głównie przez ligand podobny do TGF-β, DBL-1, dlatego test ten jest odpowiedni do identyfikacji komponentów sygnalizacji TGF-β⁷. Użyliśmy różnych szczepów, w tym dwóch szczepów nadwrażliwych na RNAi, aby powtórzyć eksperymenty z karmieniem RNAi. Nasze wyniki wykazały, że szczep rrf-3 zapewnił najlepszy oczekiwany fenotyp RNAi. Metoda ta jest łatwa w wykonaniu, powtarzalna i łatwo poddaje się kwantyfikacji. Co więcej, nasz protokół minimalizuje użycie specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu jest odpowiedni dla mniejszych laboratoriów lub tych w instytucjach prowadzących głównie studia licencjackie.

Protokół

1. Przygotowanie płytek do karmienia RNAi zawierających sekwencję genu docelowego

1. W przypadku korzystania z komercyjnie dostępnych bibliotek RNAi (np. od Source BioScience LifeSciences), należy przejść do kroku 1.4. Alternatywnie, sekwencje genów docelowych należy sklonować do wektora L4440, powszechnie stosowanego plazmidu do RNAi u nicieni⁸, zgodnie ze standardowym protokołem klonowania.
2. Rekombinowany plazmid należy transformować do szczepu bakteryjnego HT115(DE3), hodować na płytkach z agarem LB z dodatkiem 25 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny, a następnie wybrać pojedynczy klon do dalszego wykorzystania.
3. W tym samym czasie pusty wektor L4440 należy transformować do szczepu bakteryjnego HT115, aby służył jako kontrola w eksperymentach.
4. Zarówno bakterie niosące rekombinowany wektor L4440, jak i pusty wektor L4440, należy hodować przez noc w 1 ml bulionu LB z 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C. Nie dodaje się tetracykliny, ponieważ obniża ona wydajność RNAi.
5. Do hodowli nocnej należy dodać kolejne 5 ml bulionu LB z 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez kolejne 4-6 h w temperaturze 37 °C.
6. 0,5 ml kultury bakteryjnej niosącej rekombinowany lub pusty wektor L4440 należy wysiać na płytki RNAi dla nicieni. Wszystkie płytki należy opisać nazwą klonu.
7. Płytki należy oznaczyć i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w celu wyhodowania trawnika bakteryjnego; są to płytki RNAi z sekwencją genu docelowego lub bez niej. Dla każdego warunku należy przygotować co najmniej 2 płytki.

2. Hodowla nicieni na płytkach do karmienia w metodzie RNAi

1. Zestrylizuj w płomieniu końcówkę platynowego zgłębnika do nicieni. Za pomocą zgłębnika przenieś od 6 do 10 hermafrodyt w czwartym stadium larwalnym (L4) na każdą płytkę RNAi zawierającą rekombinowany lub pusty wektor L4440; zwierzęta będą wykorzystywać bakterie jako źródło pożywienia.
2. Pozostaw hermafrodyty do wzrostu w temperaturze 20 °C (standardowy warunek hodowli dla C. elegans) przez noc; następnego dnia staną się one młodymi osobnikami dorosłymi.
3. Przenieś od 6 do 10 młodych osobników dorosłych na nową, odpowiednio opisaną i przygotowaną płytkę RNAi.
4. Pozostaw osobniki dorosłe do składania jaj przez 4-6 hr, a następnie usuń wszystkie dorosłe zwierzęta z płytki; krok ten służy synchronizacji potomstwa. Po usunięciu matek rozpocznij odliczanie czasu. Jest to czas zero.
5. Inkubuj płytki w temperaturze 20 °C, aby zwierzęta osiągnęły określony etap rozwoju; w niniejszym protokole do analizy fenotypowej wybraliśmy młode osobniki dorosłe. W przypadku wyciszenia genów, które przebiega w normalnym tempie, inkubacja przez 72 hr jest wystarczająca, aby zwierzęta stały się młodymi osobnikami dorosłymi. Jednak różne geny w różny sposób wpływają na rozwój zwierząt. Jeśli RNAi powoduje wzrost zwierząt w innym tempie, młode osobniki dorosłe można zidentyfikować jako te, które nie przekroczyły 24 hr od stadium L4, mają w pełni rozwiniętą wulwę i 2-6 embrionów w macicy (jeśli są płodne). Aby zidentyfikować inne etapy rozwoju, badacz powinien kierować się stopniem rozwoju gonad i wulwy.

3. Ocena fenotypów wielkości ciała nicieni poddanych RNAi

1. Na szkiełku przedmiotowym umieść dwie warstwy kolorowej taśmy etykietującej. Przygotuj dwa takie szkiełka. Następnie umieść nowe szkiełko przedmiotowe pomiędzy tymi dwoma szkiełkami z taśmą. Rozpuść 2% agarozę w wodzie; nanieś jedną kroplę na środek nowego szkiełka, a następnie dociśnij od góry drugie szkiełko, aby utworzyć cienką warstwę 2% agarozy, jak opisano wcześniej⁹.
2. Po zestaleniu agarozy zdejmij górne szkiełko; szkiełko z podkładką agarową jest gotowe do naniesienia nicieni. Oznacz szkiełko nazwą klonu.
3. Do podkładki agarowej dodaj 10 μl 25 mM NaN₃; przenieś 30-40 osobników do roztworu NaN₃, aby je unieruchomić, a następnie nałóż od góry szkiełko nakrywkowe; powtórz czynność zarówno dla osobników traktowanych RNAi z rekombinantem, jak i z pustym wektorem L4440.
4. Wykonaj zdjęcia nicieni pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu obiektywu 2,5x; w tej procedurze wykorzystano cyfrową kamerę Leica z oprogramowaniem wspierającym Qcapture.
5. W celu kalibracji wykonaj najpierw zdjęcie standardowej podziałki mikrometrycznej. Następnie otwórz obraz w oprogramowaniu Image-Pro, kliknij „measure” i wybierz „calibration”, a następnie wybierz „spatial calibration wizard”. Po zaznaczeniu opcji „calibrate the active image” kliknij „next”. Wprowadź nazwę kalibracji i upewnij się, że jednostki odniesienia przestrzennego są ustawione na mikrometr. Następnie zaznacz przycisk „create a reference calibration” i kliknij „next”. Kliknij „draw reference line”. Pojawi się pasek skali odniesienia. Przesuń pasek skali tak, aby pokrywał się z końcami mikrometru, a następnie wskaż, że odniesienie to odpowiada 1 000 jednostkom. Kliknij „OK”, „Next” i „Finish”.
6. Po skalibrowaniu oprogramowania otwórz zdjęcie nicienia. Następnie w menu „measure” wybierz „calibration”, a potem kliknij „select spatial”. Z menu rozwijanego wybierz nazwę pliku utworzoną podczas kalibracji mikrometru. Następnie w menu „measure” wybierz „measurements”. W otwartym oknie wybierz narzędzie do swobodnego rysowania i za pomocą myszy komputerowej wykreśl linię przechodzącą przez środek ciała zwierzęcia od głowy do ogona (Rycina 1). Długość zostanie wyświetlona w oknie. W ten sposób uzyskasz dwie grupy danych: długość ciała osobników traktowanych RNAi przeciwko genowi docelowemu oraz zwierząt kontrolnych traktowanych pustym wektorem L4440.
7. Wyeksportuj pomiary długości do pliku Microsoft Excel lub innego odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Następnie porównaj próbki za pomocą testu t Studenta.

Wyniki

W naszych badaniach skupiamy się na regulacji wielkości ciała przez szlak DBL-1/TGF-β. Utrata funkcji szlaku DBL-1 skutkuje małą wielkością ciała, w tym krótszą długością ciała w porównaniu z osobnikami typu dzikiego^7,10,11. Zatem przesiewy mutantów wielkości ciała C. elegans pozwalają na identyfikację komponentów i modyfikatorów sygnalizacji TGF-β. Sygnalizacja DBL-1 jest przekazywana przez konserwatywny szlak transdukcji sygnału TGF-β, który obejmuje receptory powierzchniowe komórek oraz wewnątrzkom...

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy naszą metodę identyfikacji mutantów z defektem wielkości ciała u C. elegans za pomocą karmienia RNAi. Metoda ta ma zastosowanie w identyfikacji komponentów szlaku sygnałowego TGF-β. Ponieważ komponenty te są wysoce konserwatywne ewolucyjnie¹⁵, takie przesiewy są istotne dla wyjaśnienia molekularnych mechanizmów sygnalizacji TGF-β u wszystkich metazoa. Ważnym aspektem przy projektowaniu takiego przesiewu jest wybór szczepu wyjściowego. Wykazaliśmy, że zarówno eri-1;...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki RNAi dla nicieni 17,7 g mieszaniny pożywki dla nicieni (Worm Medium Mix) 60 g agaru Dodać H2Dodać do 3 litrów. Autoklawować. Dodać 3 ml 1M IPTG (sterylnego) oraz 3 ml karbenicyliny o stężeniu 25 mg/ml (sterylnej), a następnie przelać do szalek Petriego o średnicy 60 mm. Szkałeczki z nicieniami 17,7 g mieszaniny pożywki dla nicieni (Worm Medium Mix) 0,6 g siarczanu streptomycyny 60 g agaru Dodać H2Przygotować 3 litry. Autoklawować. Wylać do szalek Petriego o średnicy 60 mm. Mieszanka pożywki dla nicieni 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g peptonu Bacto 800 mg cholesterolu 200 g NaCl Wymieszać dokładnie, upewniając się, że nie powstały grudki; taką mieszaninę w proszku można przechowywać przez wiele miesięcy przed użyciem. 2% agaroza 0,5 g agarozy Dodać 25 ml dH2O2O. Podgrzewać w kuchence mikrofalowej do czasu rozpuszczenia. 1M izopropylu β1-deoksy-1-tiogalaktopiranoza (IPTG) 2 g IPTG Rozpuścić w 10 ml dH2O2O 1M NaN₃3 6,5 g NaN3 Dodać dH2O2O to 100 ml 25 mM NaN33 2,5 ml 1M NaN33 Dodać dH2O2O 100 ml Caenorhabditis elegans z Caenorhabditis Genetics Center Plazmid L4440 (zawiera gen oporności na ampicylinę) Szczep bakterii HT115 (DE3) (zawiera indukowaną przez IPTG polimerazę T7; jest deficyjny w genie RNAzy III (dsRNAzy), posiada również gen oporności na tetracyklinę)16 szalki Petriego 60 mm szalki Petriego 100 mm probówki hodowlane Falcon o dnie okrągłym o pojemności 14 ml laminki szklane szkiełka podstawowe 1-20 μpipeta automatyczna 20-200 μpipeta automatyczna 200-1000 μpipetka automatyczna 1-200 μkońcówki do pipet 200-1000 μkońcówki do pipet probówki Eppendorf 1,5 ml platynowy drut do przenoszenia nicieni