Analiza anatomii naczyń mózgowych gryzoni odgrywa istotną rolę w eksperymentalnych badaniach nad udarem. W tym kontekście perfuzja wewnątrz naczyniowa barwionym lateksem jest uważana za standardowe narzędzie od wielu lat. Technika ta wiąże się jednak z wyraźnymi ograniczeniami technicznymi, które obniżają jej powtarzalność. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą powtarzalną wizualizację naczyń mózgowych. Wstrzyknięcie mieszaniny dwóch dostępnych w handlu tuszy na bazie sadzy poprzez lewą komorę mięśnia sercowego skutkuje odpowiednim wypełnieniem naczyń mózgowych z wysokokontrastową wizualizacją. Z sukcesem zastosowaliśmy tę technikę do identyfikacji punktów anastomozy pomiędzy terytoriami naczyniowymi mózgu u myszy o różnym tle genetycznym. Na koniec przedstawiamy dowody na to, że ta nowa i prosta metoda barwienia naczyń może być łączona z barwieniem chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) – powszechnie stosowanym narzędziem do obserwacji i analizy objętości zawałów u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Budowa anatomiczna naczyń mózgowych jest kluczowym czynnikiem determinującym hemodynamikę mózgu, a także stopień nasilenia uszkodzeń po niedokrwiennych obrażeniach. Układ naczyniowy mózgu dynamicznie reaguje na różne stany patofizjologiczne i wykazuje znaczne różnice między szczepami oraz w warunkach manipulacji genetycznych. W związku z tym, aby badać patogenezę udaru niedokrwiennego, niezbędna jest wiarygodna technika barwienia naczyń wewnątrzczaszkowych. Do niedawna stosowano zestaw różnych technik wizualizacji naczyń mózgowych, w tym wstrzykiwanie żywicy o niskiej lepkości, araldite F, żelatyny zmieszanej z różnymi barwnikami1 (np. karmin czerwoną, tusz indyjski) lub lateksu z2 lub bez3 sadzą. Perfuzję białego związku lateksowego przez aortę wstępującą po raz pierwszy opisali Coyle i Jokelainen3. Maeda et al.2 zmodyfikowali ten protokół, dodając do związku lateksowego tusz z sadzą w celu poprawy kontrastu wizualizacji naczyń po perfuzji mózgu solą fizjologiczną. Jednak ze względu na wysoką lepkość związku lateksowego często zdarza się niewydajna perfuzja i niepełne wypełnienie naczyń4. Dlatego opisaliśmy prostą i kosztowo efektywną technikę z wykorzystaniem mieszaniny dwóch komercyjnie dostępnych tuszy z sadzą (CB1 i CB2), pozwalającą na powtarzalną wizualizację układu naczyniowego mózgu5. Wykazaliśmy, że perfuzja mieszaniną CB1+CB2 u myszy skutkuje zabarwieniem znacznie mniejszych naczyń mózgowych przy wyższej gęstości w porównaniu z perfuzją lateksem5. W niniejszym pracy opisujemy nasz protokół identyfikacji punktów anastomozy między przednią (ACA) a środkową tętnicą mózgową (MCA) w celu badania zmienności naczyń u myszy o różnych tłach genetycznych. Na koniec demonstrujemy wykonalność naszej techniki w modelu przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy, łącząc barwienie naczyń za pomocą CB1+CB2 z barwieniem TTC w różnych stopniach uszkodzeń niedokrwiennych.
Protokół
1. Zwierzęta
- Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i po uzyskaniu zgody lokalnych organów nadzorczych. We wszystkich eksperymentach wykorzystano myszy typu dzikiego C57Bl6/J, myszy ApolipoproteinE-/- (ApoE KO) oraz myszy SV129 (wiek 12-16 tygodni, masa ciała 26-30 g, 5-6 zwierząt na grupę eksperymentalną).
2. Barwienie naczyń mózgowych kolorowym lateksem
- Przygotować mieszaninę 25 μl tuszu z sadzy węglowej (Herlitz, Niemcy) i 0,5 ml związku lateksowego (Pebeo, Francja) w stosunku 1:20 w probówce EP, a następnie ogrzać mieszan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany tutaj protokół pokonuje ograniczenia techniczne konwencjonalnej wizualizacji naczyń mózgowych gryzoni z wykorzystaniem lateksu. Rysunek 1A pokazuje, że po perfuzji barwionego lateksu zabarwiają się jedynie duże naczynia na powierzchni brzusznej, podczas gdy cała powierzchnia grzbietowa pozostaje niezabarwiona. Wynik jest również wysoce zmienny. Tylko jedno z sześciu zwierząt wykazało częściowe zabarwienie ACA i MCA widocznych na powierzchni grzbietowej mózgu (dane niepoddane prezentacji). Z kolei.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Perfuzja CB1+CB2 za pomocą wstrzykiwania ręcznego może zostać przeprowadzona pomyślnie bez intensywnego szkolenia, ponieważ nie wymaga ona zastosowania żadnego specjalistycznego urządzenia do wytwarzania określonego ciśnienia2,3. Heterogeniczność wyników perfuzji w naszym protokole jest również pomijalna. Tylko 1 na 16 zwierząt nieizschemicznych oraz 3 na 20 zwierząt izschemicznych wykazało niepełną perfuzję. W tych przypadkach przyczyną niepowodzenia było najprawdopodobniej wprowadzenie pęcherzyków powietrza .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Britta Kaltwasser za doskonałą pomoc techniczną oraz Mahesh Kumar Teli za zorganizowanie przygotowań do nagrania wideo.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tusz kreślarski czarny (CB2) | Pelican, Niemcy | 221 135 | |
| Tusz do pieczątek (CB1) | Herlitz PBS AG, Niemcy | 10417202 | |
| Lateks Gedeo | Pebeo, Francja | 13042B |
Bibliografia
- Meng, H., Peng, Y., et al. Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries. Brain Research. 1261, 75-81 (2009).
- Maeda, K., Hata, R., et al. Differences in the cerebrova....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
