Dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych

Mohammad R. Hasan; Josephine Herz; Dirk M. Hermann; Thorsten R. Doeppner

doi:10.3791/4374

Artykuł metodologiczny

Dożylna perfuzja tuszem z sadzy pozwala na wiarygodną wizualizację naczyń mózgowych

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4374

⸱

4 stycznia 2013

Mohammad R. Hasan¹ , Josephine Herz¹ , Dirk M. Hermann¹ , Thorsten R. Doeppner¹

¹Department of Neurology, University of Duisburg-Essen Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Analiza anatomii naczyń mózgowych gryzoni odgrywa istotną rolę w eksperymentalnych badaniach nad udarem. W tym kontekście perfuzja wewnątrz naczyniowa barwionym lateksem jest uważana za standardowe narzędzie od wielu lat. Technika ta wiąże się jednak z wyraźnymi ograniczeniami technicznymi, które obniżają jej powtarzalność. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą powtarzalną wizualizację naczyń mózgowych. Wstrzyknięcie mieszaniny dwóch dostępnych w handlu tuszy na bazie sadzy poprzez lewą komorę mięśnia sercowego skutkuje odpowiednim wypełnieniem naczyń mózgowych z wysokokontrastową wizualizacją. Z sukcesem zastosowaliśmy tę technikę do identyfikacji punktów anastomozy pomiędzy terytoriami naczyniowymi mózgu u myszy o różnym tle genetycznym. Na koniec przedstawiamy dowody na to, że ta nowa i prosta metoda barwienia naczyń może być łączona z barwieniem chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) – powszechnie stosowanym narzędziem do obserwacji i analizy objętości zawałów u myszy.

Streszczenie

Budowa anatomiczna naczyń mózgowych jest kluczowym czynnikiem determinującym hemodynamikę mózgu, a także stopień nasilenia uszkodzeń po niedokrwiennych obrażeniach. Układ naczyniowy mózgu dynamicznie reaguje na różne stany patofizjologiczne i wykazuje znaczne różnice między szczepami oraz w warunkach manipulacji genetycznych. W związku z tym, aby badać patogenezę udaru niedokrwiennego, niezbędna jest wiarygodna technika barwienia naczyń wewnątrzczaszkowych. Do niedawna stosowano zestaw różnych technik wizualizacji naczyń mózgowych, w tym wstrzykiwanie żywicy o niskiej lepkości, araldite F, żelatyny zmieszanej z różnymi barwnikami¹ (np. karmin czerwoną, tusz indyjski) lub lateksu z² lub bez³ sadzą. Perfuzję białego związku lateksowego przez aortę wstępującą po raz pierwszy opisali Coyle i Jokelainen³. Maeda et al.² zmodyfikowali ten protokół, dodając do związku lateksowego tusz z sadzą w celu poprawy kontrastu wizualizacji naczyń po perfuzji mózgu solą fizjologiczną. Jednak ze względu na wysoką lepkość związku lateksowego często zdarza się niewydajna perfuzja i niepełne wypełnienie naczyń⁴. Dlatego opisaliśmy prostą i kosztowo efektywną technikę z wykorzystaniem mieszaniny dwóch komercyjnie dostępnych tuszy z sadzą (CB1 i CB2), pozwalającą na powtarzalną wizualizację układu naczyniowego mózgu⁵. Wykazaliśmy, że perfuzja mieszaniną CB1+CB2 u myszy skutkuje zabarwieniem znacznie mniejszych naczyń mózgowych przy wyższej gęstości w porównaniu z perfuzją lateksem⁵. W niniejszym pracy opisujemy nasz protokół identyfikacji punktów anastomozy między przednią (ACA) a środkową tętnicą mózgową (MCA) w celu badania zmienności naczyń u myszy o różnych tłach genetycznych. Na koniec demonstrujemy wykonalność naszej techniki w modelu przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy, łącząc barwienie naczyń za pomocą CB1+CB2 z barwieniem TTC w różnych stopniach uszkodzeń niedokrwiennych.

Protokół

1. Zwierzęta

Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i po uzyskaniu zgody lokalnych organów nadzorczych. We wszystkich eksperymentach wykorzystano myszy typu dzikiego C57Bl6/J, myszy ApolipoproteinE^-/- (ApoE KO) oraz myszy SV129 (wiek 12-16 tygodni, masa ciała 26-30 g, 5-6 zwierząt na grupę eksperymentalną).

2. Barwienie naczyń mózgowych kolorowym lateksem

Przygotować mieszaninę 25 μl tuszu z sadzy węglowej (Herlitz, Niemcy) i 0,5 ml związku lateksowego (Pebeo, Francja) w stosunku 1:20 w probówce EP, a następnie ogrzać mieszaninę do 37 °C w kąpieli wodnej. Przed znieczuleniem zwierzęcia pobrać mieszaninę do strzykawki 2 ml z igłą 28-30G.
Rozpuścić 50 mg papawaryny chlorowodoranu w proszku w 1 ml sterylnej soli fizjologicznej. Pobrać roztwór do strzykawki insulinowej. Odłamać igłę od drugiej sterylnej strzykawki insulinowej. Umieścić tę igłę na końcu rurki PE10 o długości 20 cm. Następnie przyłączyć rurkę PE10 do igły strzykawki insulinowej zawierającej roztwór papawaryny chlorowodoranu, który zostanie wstrzyknięty przez żyłę udową w celu zapewnienia wazodylatacji i prawidłowego wypełnienia naczyń.
Przygotować kolejne dwie strzykawki insulinowe, z których każda zawiera 1 ml soli fizjologicznej. Strzykawki insulinowe umożliwiają płynne podanie wstrzykiwanego płynu w precyzyjnej lokalizacji. Jednak ze względu na wysoką lepkość lateksu należy użyć alternatywnych strzykawek 1 ml z wymiennymi szerszymi igłami.
Umieścić wszystkie strzykawki i wysterylizowane narzędzia sekcyjne w pobliżu stanowiska operacyjnego. Rozłożyć sterylne pole operacyjne wokół stanowiska. Stanowisko operacyjne powinno być odpowiednio oświetlone; w razie potrzeby można zastosować mikroskop operacyjny.
Zmierzyć masę ciała myszy C57Bl6/J, a następnie wprowadzić w stan znieczulenia za pomocą 5% odparowanego izofluranu w 70% N₂O i 30% O₂. Kontynuować znieczulenie przy użyciu 1% odparowanego izofluranu. Po odpowiednim ułożeniu myszy na grzbiecie i unieruchomieniu kończyn ocenić głębokość znieczulenia. Następnie naciąć skórę nad lewą żyłą udową i zlokalizować żyłę. Wprowadzić ostry koniec igły umieszczonej na rurce PE10 i powoli wstrzyknąć roztwór papawaryny chlorowodoranu z prędkością 100 μl na minutę (50 mg/kg masy ciała).
Po wstrzyknięciu naciąć jamę brzuszną i przebić przeponę. Przeciąć żebra, aby odsłonić serce, unikając jego uszkodzenia lub stłuczenia. Zaciąć zstępującą aortę piersiową kleszczykami naczyniowymi. Wykonać precyzyjne cięcie w obrębie prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi żylnej. Wstrzyknąć 2 ml soli fizjologicznej do lewej komory, a następnie ręcznie wstrzyknąć kolorowy lateks przy lekkim nacisku w czasie 18-20 s. Używać wcześniej napełnionych strzykawek jedna po drugiej. Unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza.
Po wstrzyknięciu lateksu pozostawić zwierzę na 5 min. Dokonać dekapitacji zwierzęcia i ostrożnie usunąć cały mózg. Należy zadbać o to, aby nie uszkodzić architektury naczyń i kory podczas usuwania kości czaszki i opon mózgowych. Umieścić mózg w 60 mm naczyniu hodowlanym zawierającym 6-8 ml 4% PFA w celu wykonania zdjęcia. Pod przezroczyste naczynie podłożyć linijkę pomiarową. Wykonać zdjęcia grzbietowej i brzusznej powierzchni mózgu przy powiększeniu 25x za pomocą kamery przymocowanej do mikroskopu operacyjnego. Zdjęcia powinny być wykonane pod kątem 90° między naczyniem Petriego a obiektywem mikroskopu w celu określenia pierwotnej odległości.
Powtórzyć procedurę na kolejnych 4-5 zwierzętach.

3. Barwienie naczyń mózgowych mieszaniną tuszów z sadzą

Aby porównać wynik barwienia naczyń mózgowych z użyciem lateksu z naszym protokołem, przygotować mieszaninę 100 μl tuszu Herlitz Stempelfarbe (CB1) z 900 μl tuszu Pelican Scribtol Schwarz (CB2) w probówce EP 1,5 ml. Przygotować dwie probówki EP, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml mieszaniny CB1 i CB2 w stosunku 1:9. Pobrać mieszaninę do dwóch oddzielnych strzykawek insulinowych (po 1 ml każda). Zakręcić strzykawki i umieścić je w kąpieli wodnej w celu ogrzania do 37 °C. Pobrać 2 ml soli fizjologicznej do kolejnych dwóch strzykawek insulinowych i również umieścić je w kąpieli wodnej.
Zanestezjować zwierzę i powtórzyć procedurę opisaną powyżej, z wyjątkiem wstrzyknięcia hydrochlorku papaweryny. Po wstrzyknięciu 2 ml soli fizjologicznej do lewej komory, wstrzyknąć 2 ml mieszaniny czarnych tuszy zamiast kolorowego lateksu. Iniekcje wykonywać ręcznie, wywierając lekki nacisk przez 18-20 sec na 1 ml. Przed wstrzyknięciem zacisnąć zstępującą aortę piersiową.
Uśmiercić zwierzę, wyjąć mózg i wykonać zdjęcia.
W celu długoterminowej konserwacji mózgu, umieścić go na noc w 4% PFA, a następnie inkubować w sacharozie o stopniowo zwiększanym stężeniu, aż pływający mózg całkowicie zatonie (5%, następnie 15% i 30%). Mózgi zwierząt perfundowanych kolorowym lateksem można konserwować w ten sam sposób.
Przeprowadzić procedurę u kolejnych 4-5 zwierząt. Aby porównać różnice w anatomii naczyń mózgowych wynikające z różnego tła genetycznego lub szczepów, powtórzyć protokół odpowiednio u równej liczby myszy ApoE KO oraz SV129.
Aby zbadać anatomię naczyń w warunkach niedokrwiennych, wywołać przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu przez 45 min lub 90 min zgodnie ze standardowym protokołem wewnątrzluminalnej okluzji MCA pod głęboką narkozą (szczegółowy opis operacji wykracza poza zakres niniejszego artykułu; czytelników odsyła się do Doeppner et al., 2010). Po planowanym okresie reperfuzji (1 dzień lub 5 dni), wykonać barwienie naczyń wyłącznie tuszami CB1+CB2 i zbarwić cały mózg 2% roztworem TTC w 37 °C przez 5-10 min w celu zidentyfikowania objętości zawału. TTC jest redukowane do czerwonego formazanu przez enzymy mitochondrialne (w szczególności dehydrogenazę bursztynianową). Po barwieniu TTC tkanka metabolicznie aktywna barwi się na ciemnoczerwono, podczas gdy tkanka zawałowa pozostaje nieobarwiona i wydaje się biała z powodu dysfunkcyjnych i zdenaturowanych enzymów mitochondrialnych. Pozyskać obrazy w ten sam sposób, jak opisano powyżej.

4. Badanie obszarów unaczynienia mózgu

Aby przeanalizować anatomię makroskopową naczyń mózgowych, obrazy grzbietowej powierzchni mózgu barwione kolorowym lateksem lub tuszami CB1+CB2 można analizować za pomocą oprogramowania ImageJ (publicznego oprogramowania opartego na Javie, służącego do przetwarzania i analizy obrazów). Mózgi perfundowane kolorowym lateksem mogą wykazywać różny stopień zabarwienia naczyń znajdujących się na powierzchni grzbietowej, natomiast perfuzja CB1+CB2 zabarwi wszystkie naczynia zarówno na powierzchni brzusznej, jak i grzbietowej.
Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu ImageJ. Zidentyfikuj wszystkie punkty anastomoz między ACA a MCA. Punkt anastomozy definiuje się jako miejsce, w którym średnica naczynia jest najmniejsza lub jako połowa odległości między najbliższymi punktami rozgałęzień odpowiednio gałęzi ACA i MCA².Narysuj linię umowną (linię anastomoz), zaznaczając punkty anastomoz za pomocą narzędzia do rysowania linii segmentowych oraz wtyczki „Dotted Line”.
Ustaw skalę w mm. Za pomocą narzędzia do rysowania linii prostych oraz narzędzia „measure” zmierz odległość między linią anastomoz a linią środkową w punkcie 4 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego mózgu. Powtórz tę czynność w odległości 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego. Przeanalizuj 3-4 obrazy na zwierzę i oblicz wartość średnią. Porównaj wartości pomiędzy różnymi grupami zwierząt, aby zidentyfikować zmienność anatomii naczyniowej mózgu. U zwierząt C57Bl6/J linia anastomoz między ACA a MCA może przebiegać bliżej linii środkowej w punkcie 4 mm niż w punkcie 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego. U myszy ApoE KO nie będzie występować istotnej różnicy w tym zakresie. Przeciwnie, u myszy SV129 linia anastomoz będzie przebiegać dalej i równolegle do linii środkowej zarówno w odległości 4 mm, jak i 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego.
Aby przeanalizować anatomię naczyniową w warunkach niedokrwiennych, wykonaj te same obliczenia, o których wspomniano powyżej. Zidentyfikuj granicę zawału jako krawędź tkanek o kolorach czerwonym i białym, reprezentujących odpowiednio tkankę metabolicznie aktywną oraz niezabarwioną tkankę nekrotyczną. Zmierz odległość granicy zawału od linii środkowej w odległości 4 mm i 6 mm w kierunku ogonowym od bieguna czołowego mózgu. Wyznacz wartość średnią z 3-4 obrazów na zwierzę. Porównaj wyniki dla różnych okresów niedokrwienia i reperfuzji.