Przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

Podsumowanie

Opisano metodę wysokoprzepustowego screeningu służącą do identyfikacji nowych kompetentnych sygnałowo receptorów błonowych. Metoda ta nadaje się do automatyzacji na dużą skalę i pozwala na przewidywanie wiązania białek in vivo oraz subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych w komórkach ssaków.

Streszczenie

Przekazywanie sygnałów przez receptory czynników wzrostu jest niezbędne do utrzymania proliferacji i różnicowania komórek i wymaga ścisłej kontroli. Przekazywanie sygnałów jest inicjowane przez wiązanie zewnętrznego liganda do receptora transbłonowego i aktywację kaskad sygnałowych downstream. Kluczowym regulatorem sygnalizacji mitogennej jest Grb2, białko modularne składające się z wewnętrznej domeny SH2 (Src Homology 2) flankowanej przez dwie domeny SH3, które nie wykazuje aktywności enzymatycznej. Grb2 jest konstytutywnie związany z GTPazą Son-Of-Sevenless (SOS) poprzez swoją N-terminalną domenę SH3. Domena SH2 białka Grb2 wiąże się z receptorami czynników wzrostu w miejscach fosforylowanych reszt tyrozyny, łącząc w ten sposób aktywację receptora z kaskadą sygnalizacyjną SOS-Ras-MAP kinaza. Ponadto opisano inne role Grb2 jako pozytywnego lub negatywnego regulatora sygnalizacji i endocytozy receptorów. Modularna budowa Grb2 sugeruje, że może on dokować do wielu różnych receptorów i przekazywać sygnały za pomocą licznych, odmiennych szlaków^1-3.

Opisano tutaj prosty test mikroskopowy monitorujący rekrutację białka Grb2 do błony komórkowej. Został on zaadaptowany z testu mierzącego zmiany w subkomórkowej lokalizacji Grb2 znakowanego zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w odpowiedzi na bodziec^4-6. Receptory błony komórkowej wiążące Grb2, takie jak aktywowany receptor Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), rekrutują GFP-Grb2 do błony komórkowej po ekspresji cDNA, a następnie relokalizują go do przedziałów endosomalnych w komórce. W celu identyfikacji kompleksów białkowych Grb2 in vivo, technikę tę można wykorzystać do przeprowadzenia genomowego wysokoprzepustowego przesiewu (high-content screen) opartego na zmianach w subkomórkowej lokalizacji Grb2. Przygotowanie klonów ekspresyjnych cDNA, transfekcja oraz akwizycja obrazów zostały szczegółowo opisane poniżej. W porównaniu z innymi metodami genomicznymi stosowanymi do identyfikacji partnerów interakcji białkowych, takimi jak system dwuhybrydowy w drożdżach, technika ta pozwala na wizualizację kompleksów białkowych w komórkach ssaków w subkomórkowym miejscu interakcji za pomocą prostego testu mikroskopowego. Dzięki temu można ocenić zarówno cechy jakościowe, takie jak wzorce lokalizacji, jak i ilościową siłę oddziaływania.

Protokół

1. Wybór klonów ekspresyjnych cDNA

1. Biblioteka cDNA dostarczona jest w formie pojedynczych klonów bakteryjnych w zapasach glicerolowych w formacie 96-dołkowym. Używając polecenia Rearray w menu pickera urządzenia Norgen CP7200, należy pobrać klony bakteryjne z płytki źródłowej i zaszczepić je do 1,5 ml LB/amp w 96-dołkowej płytce typu deepwell (dołki 1 ml).
2. Płytki deepwell należy zamknąć przepuszczalną dla gazów membraną uszczelniającą i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym.

2. Przygotowanie biblioteki ekspresyjnej cDNA

1. Wirować płytki głębokozwojowe zawierające bakterie przy 2,000 rpm przez 20 min, używając adapterów do płytek w wirówce stołowej.
2. Odssać pożywkę z dołków, pozostawiając nienaruszony osad bakteryjny.
3. Skonfigurować platformę stacji automatyzacji laboratoryjnej zgodnie z Rysunkiem 2. Roztwory do preparatyki plazmidów rozdzielić do koryt 1-5, a płytkę głębokozwojową umieścić na platformie. Korytko wielodołkowe z roztworem eluowania umieścić obok płytki głębokozwojowej. Załadować końcówki do stojaków na końcówki.
4. Złożyć kolektor próżniowy. Płytkę do wiązania plazmidów umieścić wewnątrz kolektora, a płytkę filtracyjną do plazmidów położyć na górze kolektora.
5. Resuspender osady w 250 μl Roztworu 1 (bufor do resuspensji) poprzez pipetowanie w górę i w dół.
6. Zlizować bakterie poprzez dodanie 250 μl Roztworu 2 (bufor do lizy). Płytkę szczelnie zamknąć i odwrócić, aby umożliwić całkowite wymieszanie.
7. Uruchomić czasomierz na 2 min.
8. Dodać 350 μl Roztworu 3 (bufor neutralizujący). Szczelnie zamknąć płytkę i odwrócić 3 razy.
9. Przenieść lizaty bakteryjne na płytki filtracyjne do plazmidów.
10. Zastosować próżnię przez 5 min.
11. Zdjąć płytkę filtracyjną i umieścić płytkę do wiązania na górze kolektora. Zastosować próżnię przez 1 min.
12. Dodać 500 μl dodatkowego buforu do płukania (AW).
13. Zastosować próżnię przez 2 min.
14. Dodać 900 μl buforu do płukania Roztwór 4. Zastosować próżnię przez 2 min.
15. Powtórzyć krok 2.14. Zastosować próżnię przez dodatkowe 15 min.
16. Umieścić płytkę do zbierania DNA wewnątrz kolektora. Dodać 100 μl buforu do eluowania na płytkę do wiązania i inkubować przez 2 min.
17. Zastosować próżnię przez 10 min.
18. Wyjąć płytkę do zbierania i zmierzyć stężenie DNA za pomocą Nanodrop 8000. Typowo przy tej metodzie można oczekiwać wydajności ~100 ng/μl.

3. Wysiew komórek

1. Komórki HEK293 poddaje się trypsynizacji i zliczeniu.
2. Do każdej studzienki płytki PerkinElmer Viewplate nanosi się 2 x 10⁴ komórek za pomocą dozownika wielokanałowego ThermoFisher 96-well multidrop.
3. Komórki inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂.

4. Transfekcja

1. W okrągłodennym płytce 96-dołkowej przygotować w każdym dołku mieszaninę 100 ng plazmidowego DNA GFP-Grb2 i 100 ng cDNA w 25 μl pożywki bezsurowiczej.
2. Do każdego dołka dodać 25 μl pożywki bezsurowiczej zawierającej 0,5 μl Transfectin.
3. Wymieszać i uruchomić stoper na 30 min.
4. Przenieść 50 μl mieszaniny cDNA/Transfectin do komórek, stosując delikatną metodę dozowania. Alternatywnie mieszaninę do transfekcji można dozować najpierw do płytek, a następnie dodać na nią komórki (transfekcja odwrócona).
5. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

5. Pozyskiwanie obrazów

1. Uruchom oprogramowanie Opera. Zrzut ekranu konfiguracji eksperymentu przedstawiono na Rysunku 3. Wybierz kartę „Configuration” i wybierz obiektyw 20x oraz odpowiedni typ płytki. Upewnij się, że wartość „collar” na obiektywie jest ustawiona prawidłowo, aby umożliwić ostrzenie przy różnych typach płytek.
2. Wybierz kartę „Microscope”. Zdefiniuj ekspozycję 1 jako FITC (laser 488) i ekspozycję 2 jako UV (laser 365). Aktywuj filtr UV dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 oraz ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy ekspozycji na 800 msec dla ekspozycji 1 i 40 msec dla ekspozycji 2.
3. Wybierz kartę „Microscope”. Zdefiniuj ekspozycję 1 jako FITC (laser 488) i ekspozycję 2 jako UV (laser 365). Aktywuj filtr UV dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 oraz ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy ekspozycji na 800 msec dla ekspozycji 1 i 40 msec dla ekspozycji 2.
4. Wybierz ekspozycję 1. Ustaw wysokość ostrzenia na 0 μm. Wybierz „Focus”. Po ustawieniu ostrości wykonaj zdjęcie kamerą 1. Dostosuj wysokość ostrzenia, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji, i kliknij „Take height”. Zmień czasy ekspozycji i moc lasera tak, aby maksymalna intensywność pikseli wynosiła ~3,000. Zapisz parametry ekspozycji. Powtórz czynność dla ekspozycji 2.
5. Wybierz kartę „Experiment Definition”. Utwórz układ (layout) i podukład (sublayout). Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik skewcrop oraz podukład. Zapisz eksperyment.
6. Wybierz kartę „Automatic Experiment” i wykonaj akwizycję obrazów.

6. Analiza obrazu (Na podstawie wersji ImageJ 1.46h).

1. Konwertuj zastrzeżone pliki .flex firmy PerkinElmer do formatu Tagged Image Format .tif za pomocą skryptu Flex2Volocity Acapella.
2. 1. Zaimportuj obrazy do programu ImageJ jako sekwencję obrazów, tworząc stos (stack).
   2. Konwertuj stos na hiperstos (hyperstack) dwukanałowy, wybierając pozycję menu Image/Hyperstack/Stack to Hyperstack. Liczbę warstw (slices) należy ustawić na połowę zaimportowanego stosu.
   3. Zduplikuj kanał GFP za pomocą polecenia Image/Duplicate: zaznacz pole Duplicate hyperstack i określ Channels: 1-1. W dalszej części procedury używaj zduplikowanego stosu.
3. Wybierz Process/Enhance Contrast z ustawieniem 0,01% nasyconych pikseli, korzystając z histogramu stosu, a następnie konwertuj do 8 bitów za pomocą Image/Type/8-bit.
4. Zdefiniuj lokalną segmentację adaptacyjną o promieniu 15 pikseli, stosując algorytm Bernsena z progiem kontrastu (Parameter 1) q = 30. W menu Image/Adjust/Auto Local Threshold zaznacz pole White objects on black background.
5. Kontrola jakości segmentacji: wygeneruj nakładkę konturów segmentowanych obiektów na oryginalnych obrazach.
6. Ekstrakcja cech poprzez analizę cząstek (analyse particles): pomiar powierzchni oraz średniej i całkowitej intensywności każdej organelli. Zapisz pliki z wynikami.
7. Otwórz plik z wynikami cech w programie R i wygeneruj histogram.

7. Reprezentatywne wyniki

W warunkach normalnych Grb2 jest zlokalizowany w całej komórce. Po stymulacji receptora czynnika wzrostu translokuje się on do błony plazmatycznej, a następnie zostaje zinternalizowany do endosomów, co przedstawiono na Rysunku 4. Ekspresja receptora powierzchniowego komórki zdolnego do wiązania Grb2 jest wystarczająca, aby wywołać tę translokację. W typowym eksperymencie przesiewowym nie obserwuje się zmian w lokalizacji GFP-Grb2. Jednakże, gdy wyeksponowane zostanie białko rekrutujące Grb2 do konkretnego miejsca wewnątrzkomórkowego, następuje zmiana lokalizacji, którą można łatwo zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład ekspresja EGFR prowadzi do relokalizacji GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy (Rysunek 4). Zatem przy zastosowaniu biblioteki obejmującej cały genom można oczekiwać zidentyfikowania nowych białek powierzchniowych komórki wiążących Grb2.

Metoda ta nie ogranicza się jedynie do detekcji białek powierzchniowych komórki. Na przykład Dynamina2 indukuje zmianę lokalizacji subkomórkowej GFP-Grb2, wykazując rekrutację przypominającą endosomy (Rysunek 5). Dynamina2 wiąże się z domeną SH3 na C-końcu białka Grb2 i bierze udział w endocytozie tego kompleksu^9,10. Zatem podejście to umożliwia identyfikację ogólnych kompleksów wiążących białka i nie ogranicza się tylko do identyfikacji partnerów interakcji dla domeny SH2.

Można spodziewać się kilku różnych typów translokacji, takich jak lokalizacja w błonie komórkowej, w endosomach, w innych pęcherzykowych strukturach cytoplazmatycznych lub w jądrze komórkowym. Dlatego zaleca się, aby wszystkie obrazy zostały również poddane ocenie wizualnej. Jednakże, podczas przesiewania dużych zbiorów cDNA, bardziej praktyczny jest zautomatyzowany algorytm analizy obrazu. W takim przypadku pożądane jest zastosowanie kombinacji algorytmów, takich jak detekcja punktowa w celu identyfikacji endosomów, detekcja cytoplazmy/jądra w celu identyfikacji transportu jądrowego oraz ogólne algorytmy morfologiczne do identyfikacji zmian w kształcie komórek. Zastosowanie tych różnych metod detekcji fenotypowej zostało omówione bardziej szczegółowo w innym opracowaniu¹¹.

Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Eksperyment przedstawia kompletny przebieg przesiewania wysokoprzepustowego (high-content screening), rozpoczynający się od amplifikacji i przygotowania biblioteki cDNA, transfekcji wektorów cDNA wraz z konstruktami raportującymi, akwizycji obrazów oraz analizy obrazów przy użyciu bezpłatnego oprogramowania open-source IMAGEJ.

Rysunek 2. Konfiguracja platformy Tecan. (1) Po lewej stronie należy napełnić pięć koryt o pojemności 100 ml buforami 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) oraz A4 (100 ml). Koryt A4 trzeba będzie uzupełnić raz w trakcie procedury. (2) Kolektor próżniowy znajduje się w tym przykładzie na pozycji 14. (3) Płytka deepwell z osadami bakteryjnymi znajduje się na pozycji 30, obok koryta z 25 ml buforu elucyjnego. (4) Jednorazowe końcówki do głowicy 8-kanałowej należy załadować do statywów z końcówkami po lewej stronie, a końcówki do głowicy wielokanałowej należy umieścić na pozycji 40. Automatyczny system dozujący Tecan FreedomEvo wykorzystany w tym doświadczeniu jest wyposażony w strzykawki 500 μl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 3. Automatyzacja akwizycji obrazów w systemie Opera LX. A) Wybierz kartę Configuration (1). Aktywuj linie laserowe wymagane do eksperymentu (2). Wybierz kamery do akwizycji obrazów (3). Wybierz typ płytki i obiektyw do eksperymentu (4). B) Wybierz kartę Microscope (1). Zdefiniuj źródło światła i czas ekspozycji dla ekspozycji 1 (2,3). Ustaw ostrość na jednej studzience i zmierz wysokość (4). C) Wybierz kartę Experiment Definition (1). Przeciągnij i upuść pliki ekspozycji, skewcrop, referencyjne, układu (layout) oraz podukładu (sublayout) (2). Przeciągnij i upuść plik eksperymentu (3). D) Wybierz Automatic Experiment (1). Przeciągnij i upuść plik eksperymentu (2). Przypisz odpowiedni kod kreskowy (3). Rozpocznij akwizycję obrazów, klikając przycisk start (4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 4. Translokacja GFP-Grb2 indukowana ekspresją cDNA. Po nadekspresji transbłonowego receptora czynnika wzrostu GFP-Grb2 przemieszcza się z przeważającej lokalizacji cytoplazmatycznej do struktur przypominających endosomy, a następnie ulega internalizacji do endosomów. Po lewej przedstawiono obrazy mikroskopowe komórek COS M6, które zostały przejściowo przetransfekowane GFP-Grb2 (góra) lub GFP-Grb2 wraz z EGFR (dół). Współekspresja EGFR skutkuje relokacją GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy.

Rysunek 5. Przykład translokacji GFP-Grb2 indukowanej przez cDNA. GTPaza Dynamina 2, uczestnicząca w endocytozie pośredniczonej przez Grb2, relokalizuje GFP-Grb2 do struktur przypominających endosomy (zakreślone kółkiem). W tym eksperymencie GFP-Grb2 został współtransfekowany z DNM2 do komórek HEK293T. Komórki barwiono Hoechst 33342 po 24 hr, a obrazy pozyskano za pomocą Opera LX. Przedstawiono jedno pole widzenia kanału zielonego (GFP) oraz UV (niebieskiego; Hoechst 33342).

Dyskusja

Klonowanie ekspresyjne jest potężnym narzędziem, które w przeszłości służyło do identyfikacji nowych komponentów komórkowych, takich jak receptory wirusowe i antygeny krwinek¹². W niniejszej pracy opisujemy metodę ułatwiającą identyfikację nowych, domniemanych receptorów transdukcji sygnału, które wiążą się z Grb2.

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków.

1. W przypadku zautomatyzowanej preparatyki plazmidów absolutnie niezbędne jest całkowite resuspensowanie osadu bakteryjnego. Czasami konieczne jest wprowadzenie etapu intensywnego wstrząsania lub dodatkowego mieszania za pomocą pipet.
2. Po dodaniu roztworów 2 i 3 niezbędne jest całkowite wymieszanie; stwierdzono, że ręczne odwracanie zamkniętej płytki jest bardziej efektywne niż użycie automatycznego wytrząsarki. Na tym etapie należy unikać pipetowania, ponieważ mogłoby to doprowadzić do fragmentacji DNA.
3. W każdym kroku z zastosowaniem próżni należy upewnić się, że ciecz została całkowicie odprowadzona z płytki. W przeciwnym razie należy spodziewać się niskich wydajności.
4. Podczas elucji często zdarza się, że na dnie płytki do wiązania plazmidów tworzą się krople eluatu. Krople te muszą zostać zebrane do płytki elucyjnej, dlatego zaleca się ostrożne podniesienie płytki do wiązania plazmidów i uważne przeniesienie wszelkich pozostałych kropel z dna do płytki z eluatem.
5. Podczas transfekcji krytyczny jest czas tworzenia kompleksów. Zazwyczaj stosujemy czas 20-30 min. Dłuższe czasy, do 1 hr, są dopuszczalne bez zmniejszenia wydajności, natomiast nie zaleca się stosowania krótszych czasów.
6. W przypadku mikroskopii ważny jest wybór powiększenia. W systemie Opera LX użytym w tej procedurze rozdzielczość przy 20x jest wystarczająca do uzyskania wysokiej jakości obrazów. Jeśli wymagane są obrazy o wyższej rozdzielczości, można zmienić obiektyw, jednak w celu uzyskania statystycznie istotnej liczby komórek wymagana jest większa liczba pól widzenia oraz dłuższy czas akwizycji. Generalnie dążymy do obrazowania co najmniej 100 komórek na studzienkę.

Test translokacji Grb2 był wykorzystywany przez inne grupy badawcze do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów aktywacji kinazy EGFR⁶. W tym przypadku EGFR jest specyficznie aktywowany ligandem, co powoduje rekrutację Grb2 do błony plazmatycznej. Następnie można badać zaburzenie tej interakcji przy użyciu związków małocząsteczkowych. Podobnie można założyć, że przesiewy siRNA mogą zostać zastosowane do identyfikacji genów endogennych zaangażowanych w sygnalizację EGFR-Grb2 lub innych receptorów czynników wzrostu wiążących Grb2, takich jak c-KIT lub receptor erytropoetyny. Zatem technika ta ma wiele potencjalnych zastosowań. Analogiczne podejście można zastosować do systemów reporterowych z GFP dla innych cząsteczek adapterowych, takich jak Shc, Gab lub IRS.

Główną zaletą zastosowania tego testu opartego na komórkach ssaczych jest możliwość identyfikacji oddziaływań istotnych fizjologicznie. Test ten służy do wykrywania tworzenia kompleksów białkowych, ale co ważniejsze, odpowiednie oddziaływania są monitorowane w prawidłowym miejscu wewnątrzkomórkowym. W tym względzie technika ta eliminuje artefakty występujące w innych metodach badania oddziaływań białko-białko, takich jak system dwuhybrydowy drożdżowy czy testy in vitro. Należy jednak zauważyć, że do rekrutacji Grb2 mogą prowadzić również oddziaływania pośrednie. Podobnie, ekspresja cDNA może indukować transkrypcyjną upregulację partnerów wiążących. Aby rozróżnić te możliwości, konieczne jest przeprowadzenie odpowiednich testów wtórnych w celu odróżnienia bezpośrednich od pośrednich efektów wiązania.

Podsumowując, test translokacji cząsteczki adaptera GFP wykazuje wysoki potencjał w zastosowaniach związanych z przesiewaniem całego genomu oraz poszukiwaniem nowych leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
biblioteka cDNA	Origene
LB+amp
Uszczelki przepuszczalne dla gazów	ThermoScientific	AB-0718
Zestaw Nucleospin 96 Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740625.4
Transfectin	BioRad	170-3351
H–chst33342	Molecular Probes	H3570
Płytka Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Freedom Evo	Tecan		Z kolektorem próżniowym
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	PerkinElmer