Proces obrazowania o wysokiej zawartości do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 poprzez klonowanie ekspresji

Summary

Opisano metodę przesiewową o wysokiej zawartości w celu identyfikacji nowych sygnałowych kompetentnych receptorów transbłonowych. Metoda ta jest podatna na automatyzację na dużą skalę i umożliwia przewidywania dotyczące wiązania białek in vivo i subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych w komórkach ssaków.

Abstract

Przekazywanie sygnałów przez receptory czynnika wzrostu jest niezbędne do utrzymania proliferacji i różnicowania komórek i wymaga ścisłej kontroli. Transdukcja sygnału jest inicjowana przez wiązanie zewnętrznego liganda z receptorem transbłonowym i aktywację dalszych kaskad sygnałowych. Kluczowym regulatorem sygnalizacji mitogennej jest Grb2, modułowe białko złożone z wewnętrznej domeny SH2 (Src Homology 2) otoczonej dwiema domenami SH3, która nie ma aktywności enzymatycznej. Grb2 jest konstytutywnie związany z GTPazą Son-Of-Sevenless (SOS) poprzez swoją N-końcową domenę SH3. Domena SH2 Grb2 wiąże się z receptorami czynnika wzrostu na fosforylowanych resztach tyrozyny, sprzęgając w ten sposób aktywację receptora z kaskadą sygnalizacyjną kinazy SOS-Ras-MAP. Ponadto opisano inne role Grb2 jako pozytywnego lub negatywnego regulatora sygnalizacji i endocytozy receptora. Modułowy skład Grb2 sugeruje, że może on dokować do różnych receptorów i przekazywać sygnały wzdłuż wielu różnych ścieżek^1-3.

Opisane tutaj jest proste badanie mikroskopowe, które monitoruje rekrutację Grb2 do błony plazmatycznej. Jest on adaptowany z testu, który mierzy zmiany w subkomórkowej lokalizacji Grb2 znakowanego białkiem zielonej fluorescencji (GFP) w odpowiedzi na bodziec^4-6. Receptory błony plazmatycznej, które wiążą Grb2, takie jak aktywowany receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), rekrutują GFP-Grb2 do błony plazmatycznej po ekspresji cDNA, a następnie przemieszczają się do przedziałów endosomalnych w komórce. W celu identyfikacji in vivo kompleksów białkowych Grb2, technika ta może być wykorzystana do przeprowadzenia badania przesiewowego o wysokiej zawartości całego genomu w oparciu o zmiany w lokalizacji subkomórkowej Grb2. Przygotowanie klonów ekspresji cDNA, transfekcja i akwizycja obrazu zostały szczegółowo opisane poniżej. W porównaniu z innymi metodami genomicznymi stosowanymi do identyfikacji partnerów interakcji białkowych, takich jak drożdże i dwie hybrydy, technika ta umożliwia wizualizację kompleksów białkowych w komórkach ssaków w subkomórkowym miejscu interakcji za pomocą prostego testu opartego na mikroskopii. W związku z tym można ocenić zarówno cechy jakościowe, takie jak wzorce lokalizacji, jak i ilościową siłę interakcji.

Protocol

1. Wybieranie klonów ekspresji cDNA

1. Biblioteka cDNA jest dostarczana jako pojedyncze klony bakteryjne w zapasach glicerolu w formacie 96-dołkowym. Korzystając z polecenia Rearray w menu selektora Norgen CP7200, wybierz klony bakterii z płytki źródłowej i zaszczepij je w 1,5 ml LB/amp w płytce z 96 głębokościami (1 ml dołka).
2. Uszczelnić płytki studzienki głębinowej uszczelką przepuszczającą gaz i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce.

2. Przygotowanie biblioteki ekspresji cDNA

1. Obracaj płytki głębinowe zawierające bakterie z prędkością 2,000 obr./min przez 20 minut za pomocą adapterów płytek w wirówce stołowej.
2. Odessać pożywkę ze studzienek, pozostawiając nienaruszony osad bakteryjny.
3. Skonfiguruj pokład stacji roboczej automatyzacji laboratorium, jak pokazano na rysunku 2. Roztwory do przygotowania plazmidu rozprowadza się w korytach 1-5, a płytkę studni głębinowej umieszcza się na pokładzie. Koryto wielodołkowe z roztworem elucyjnym umieszcza się w sąsiedztwie płytki studni głębinowej. Napiwki są ładowane do stojaków na końcówki.
4. Zamontuj kolektor próżniowy. Płytkę wiążącą plazmid umieszcza się wewnątrz kolektora, a płytkę filtra plazmidowego umieszcza się na górze kolektora.
5. Zawiesić granulki za pomocą 250 μl roztworu 1 (bufor do ponownego zawieszenia), pipetując w górę i w dół.
6. Poddać bakterie lizie przez dodanie 250 μl roztworu 2 (bufor do lizy). Płytka jest uszczelniona i odwrócona, aby umożliwić całkowite wymieszanie.
7. Uruchom 2-minutowy timer.
8. Dodać 350 μl roztworu 3 (bufor neutralizacyjny). Uszczelnij płytkę i odwróć 3 razy.
9. Przenieść lizaty bakteryjne na płytki filtracyjne plazmidu.
10. Stosować próżnię przez 5 minut.
11. Zdejmij płytkę filtracyjną i umieść płytkę wiążącą na górze kolektora. Zastosuj podciśnienie przez 1 minutę.
12. Dodać 500 μl dodatkowego buforu do płukania (AW).
13. Zastosuj próżnię przez 2 minuty.
14. Dodać 900 μl buforu do płukania Roztwór 4. Zastosuj próżnię przez 2 minuty.
15. Powtórz krok 2.14. Zastosuj podciśnienie przez dodatkowe 15 minut.
16. Umieścić płytkę do pobierania DNA wewnątrz kolektora. Dodać 100 μl buforu elucyjnego do płytki wiążącej i inkubować przez 2 minuty.
17. Odkurzaj przez 10 min.
18. Wyjmij płytkę zbiorczą i zmierz stężenie DNA za pomocą Nanodrop 8000. Zazwyczaj przy tej metodzie można oczekiwać wydajności ~100 ng/μl.

3. Sadzenie komórek

1. Komórki HEK293 są trypsynizowane i zliczane.
2. 2 x 10⁴ komórki są dozowane do każdej studzienki płytki PerkinElmer Viewplate za pomocą 96-dołkowego multidropu ThermoFisher.
3. Komórki inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

4. Transfekcja

1. Przygotować mieszaninę 100 ng plazmidowego DNA GFP-Grb2 ze 100 ng cDNA w 25 μl pożywki wolnej od surowicy na dołek na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem.
2. Dodać 25 μl pożywki bez surowicy zawierającej 0,5 μl transfektyny na studzienkę.
3. Mieszaj i uruchom minutnik na 30 minut.
4. Przenieś 50 μl mieszaniny cDNA/transfektyny do komórek za pomocą delikatnej metody dozowania. Alternatywnie, mieszanka do transfekcji może być najpierw dozowana do płytek, a następnie dodawana do komórek na wierzchu (transfekcja odwrotna).
5. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

5. Akwizycja obrazu

1. Uruchom oprogramowanie Opera. Zrzut ekranu przedstawiający konfigurację eksperymentu pokazano na rysunku 3. Wybierz zakładkę "Konfiguracja" i wybierz obiektyw 20x oraz odpowiedni typ płytki. Upewnij się, że "kołnierz" jest ustawiony na odpowiednią wartość na obiektywie, aby umożliwić ustawienie ostrości na różnych typach płytek.
2. Wybierz zakładkę "Mikroskop". Zdefiniuj ekspozycję 1 jako FITC (laser 488) i ekspozycję 2 jako UV (laser 365). Aktywuj filtr UV na obu ekspozycjach i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 i ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy ekspozycji na 800 ms dla ekspozycji 1 i 40 ms dla ekspozycji 2.
3. Wybierz zakładkę "Mikroskop". Zdefiniuj ekspozycję 1 jako FITC (laser 488) i ekspozycję 2 jako UV (laser 365). Aktywuj filtr UV na obu ekspozycjach i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 i ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy ekspozycji na 800 ms dla ekspozycji 1 i 40 ms dla ekspozycji 2.
4. Wybierz ekspozycję 1. Ustaw wysokość ostrości na 0 μm. Wybierz "Ostrość". Po ustawieniu ostrości naświetl aparat 1. Dostosuj wysokość ostrości, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji i kliknij "Weź wysokość". Zmień czasy naświetlania i moc lasera, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli ~3,000. Zapisz parametry ekspozycji. Powtórz te czynności dla ekspozycji 2.
5. Wybierz zakładkę "Definicja eksperymentu". Utwórz układ i podukład. Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik pochylenia i podukład. Zapisz eksperyment.
6. Wybierz zakładkę "Automatyczny eksperyment" i uzyskaj obrazy.

6. Analiza obrazu (na podstawie wersji ImageJ 1.46h.)

1. Konwertuj zastrzeżone pliki PerkinElmer .flex na plik .tif Tagged Image Format za pomocą skryptu Flex2Volocity Acapella.
2. 1. Importuj obrazy do ImageJ jako sekwencję obrazów, co daje w wyniku stos.
   2. Przekonwertuj stos na 2-kanałowy hiperstos, wybierając element menu Obraz/Hyperstack/Stos do Hyperstack. Liczba wycinków musi być ustawiona na połowę zaimportowanego stosu.
   3. Zduplikuj kanał GFP za pomocą polecenia Image/Duplicate: zaznacz pole wyboru Duplicate hyperstack i określ Channels: 1-1. W dalszej części należy użyć zduplikowanego stosu.
3. Wybierz opcję Procesuj/Zwiększ kontrast z 0,01% nasyconymi pikselami, używając histogramu stosu i przekonwertuj na 8 bitów za pomocą Obraz/Typ/8-bitowy.
4. Zdefiniuj lokalną segmentację adaptacyjną o promieniu 15 pikseli za pomocą algorytmu Bernsena z progiem kontrastu (parametr 1) q = 30. Zaznacz pole wyboru Białe obiekty na czarnym tle w menu Obraz/Dostosuj/Automatyczny próg lokalny.
5. Kontrola jakości segmentacji: generowanie segmentowanej nakładki konturu obiektu na oryginalnych obrazach.
6. Ekstrakcja cech poprzez analizę cząstek: obszar pomiarowy, średnia i całkowita intensywność każdej organelli. Zapisz pliki wyników.
7. Otwórz plik wyników funkcji w języku R i wygeneruj histogram.

7. Reprezentatywne wyniki

W normalnych warunkach Grb2 jest zlokalizowany w całej komórce. Po stymulacji receptora czynnika wzrostu przemieszcza się on do błony plazmatycznej, a następnie jest internalizowany do endosomów, jak pokazano na rycinie 4. Ekspresja receptora powierzchniowego komórki zdolnego do wiązania Grb2 jest wystarczająca do wywołania tej translokacji. W typowym eksperymencie przesiewowym nie obserwuje się zmian w lokalizacji GFP-Grb2. Jednakże, gdy dochodzi do ekspresji białka, które rekrutuje Grb2 do miejsca subkomórkowego, następuje zmiana lokalizacji, którą można łatwo uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład ekspresja EGFR powoduje relokalizację GFP-Grb2 do struktur podobnych do endosomów (ryc. 4). W związku z tym, stosując bibliotekę obejmującą cały genom, można oczekiwać, że można zidentyfikować nowe białka powierzchniowe komórek wiążące Grb2.

Ta metoda nie ogranicza się do wykrywania białek na powierzchni komórki. Na przykład Dynamin2 indukuje zmianę w subkomórkowej lokalizacji GFP-Grb2 wykazując rekrutację podobną do endosomu (Figura 5). Dynamin2 wiąże się z C-końcową domeną SH3 Grb2 i bierze udział w endocytozie tego kompleksu^9,10. W związku z tym podejście to umożliwia identyfikację ogólnych kompleksów wiążących białka i nie ogranicza się do identyfikacji partnerów interakcji dla domeny SH2.

Można spodziewać się kilku różnych typów translokacji, takich jak lokalizacja do błony plazmatycznej, endosomów, innych cytoplazmatycznych struktur pęcherzykowych lub do jądra. Dlatego zaleca się, aby wszystkie obrazy były również sprawdzane wzrokowo. Jednak w przypadku badań przesiewowych dużych zestawów cDNA bardziej praktyczny jest algorytm automatycznej analizy obrazu. W takim przypadku pożądana jest kombinacja algorytmów, takich jak wykrywanie punktowe w celu identyfikacji endosomów, wykrywanie cytoplazmy/jądra w celu identyfikacji transportu jądrowego i ogólne algorytmy morfologiczne w celu identyfikacji zmian kształtu komórki. Zastosowanie tych różnych metod wykrywania fenotypowego zostało omówione bardziej szczegółowo w innym miejscu¹¹.

Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Eksperyment szczegółowo opisuje kompletny proces badań przesiewowych o wysokiej zawartości, począwszy od amplifikacji i przygotowania biblioteki cDNA, transfekcji wektorów cDNA oraz konstruktów reporterowych, akwizycji obrazu i analizy obrazu przy użyciu bezpłatnego otwartego oprogramowania IMAGEJ.

Rysunek 2. Konfiguracja pokładu Tecan. (1) Po lewej stronie pięć koryt o pojemności 100 ml należy napełnić 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) i A4 (100 ml). Koryto A4 będzie wymagało jednokrotnego napełnienia podczas zabiegu. (2) Kolektor podciśnieniowy znajduje się w tym przykładzie na pozycji 14. (3) Płytka głębinowa z osadkami bakteryjnymi znajduje się w pozycji 30, obok koryta buforu elucyjnego z 25 ml buforu elucyjnego. (4) Jednorazowe końcówki do głowicy 8-kanałowej należy załadować do stojaków na końcówki po lewej stronie, a końcówki do głowicy wielokanałowej należy napełnić w pozycji 40. Płyn do obsługi Tecan FreedomEvo, który jest używany w tym eksperymencie, jest wyposażony w strzykawki o pojemności 500 μl. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Automatyzacja akwizycji obrazu na Operze LX. A) Wybierz zakładkę Konfiguracja (1). Aktywuj linie laserowe wymagane do eksperymentu (2). Wybierz kamery do akwizycji obrazu (3). Wybierz typ płytki i soczewkę obiektywu do eksperymentu (4). B) Wybierz zakładkę mikroskopu (1). Określ źródło światła i czas naświetlania dla ekspozycji 1 (2,3). Skoncentruj się na jednej studni i wybierz wysokość (4). C) Wybierz zakładkę Experiment Definition (Definicja eksperymentu) (1). Przeciągnij i upuść pliki ekspozycji, pochylenia, odniesienia, układu i podukładu (2). Przeciągnij i upuść plik eksperymentu (3). d) Wybierz opcję Automatic Experiment (Eksperyment automatyczny) (1). Przeciągnij i upuść plik eksperymentu (2). Przydziel odpowiedni kod kreskowy (3). Rozpocznij pobieranie obrazu, klikając przycisk start (4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Translokacja GFP-Grb2 przez ekspresję cDNA. GFP-Grb2 przemieszcza się z dominującej lokalizacji cytoplazmatycznej do struktur podobnych do endosomów po nadekspresji receptora transbłonowego czynnika wzrostu, a następnie internalizuje się do endosomów. Po lewej stronie pokazane są obrazy mikroskopowe komórek COS M6, które zostały przejściowo transfekowane GFP-Grb2 (na górze) lub GFP-Grb2 plus EGFR (na dole). Jednoczesna ekspresja EGFR powoduje przemieszczenie GFP-Grb2 do struktur podobnych do endosomów.

Rysunek 5. Przykład translokacji GFP-Grb2 indukowanej przez cDNA. GTPaza Dynamin2, która bierze udział w endocytozie, w której pośredniczy Grb2, przemieszcza GFP-Grb2 do struktur podobnych do endosomów (zakreślonych). W tym eksperymencie GFP-Grb2 był współtransfekowany z DNM2 do komórek HEK293T. Komórki wybarwiono Hoechst 33342 po 24 godzinach, a obrazy uzyskano na Opera LX. Jedno pole widzenia kanału zielonego (GFP) i kanału UV (niebieskiego; Hoechst 33342).

Discussion

Klonowanie ekspresji jest potężnym narzędziem, które było używane w przeszłości do identyfikacji nowych składników komórkowych, takich jak receptory wirusa i antygeny komórek krwi¹². W tym miejscu opisujemy metodę ułatwiającą identyfikację nowych przypuszczalnych receptorów transdukcji sygnału, które wiążą się z Grb2.

W protokole jest kilka krytycznych kroków.

1. Do automatycznego przygotowania plazmidu absolutnie konieczne jest całkowite ponowne zawieszenie osadu bakteryjnego. Czasami konieczne jest włączenie rygorystycznego etapu wytrząsania lub dalszego mieszania za pomocą pipet.
2. Po dodaniu roztworu 2 i 3 niezbędne jest pełne wymieszanie i stwierdziliśmy, że ręczne odwrócenie zamkniętej płytki jest bardziej wydajne niż użycie automatycznej wytrząsarki. Na tym etapie należy unikać pipetowania, ponieważ doprowadziłoby to do ścinania DNA.
3. Na wszystkich etapach podciśnienia należy upewnić się, że płyn został całkowicie spuszczony z płytki. W przeciwnym razie należy spodziewać się niskich plonów.
4. Po elucji dość często krople eluatu tworzą się na dnie płytki wiążącej plazmid. Krople te należy zebrać na płytce elucyjnej, dlatego zaleca się, aby płytka wiążąca plazmid została ostrożnie podniesiona, a wszelkie pozostałe krople na dnie zostały ostrożnie przeniesione na płytkę eluacyjną.
5. Podczas transfekcji czas tworzenia się kompleksu jest krytyczny. Zazwyczaj trzymamy się 20-30 min. Dłuższe czasy do 1 godziny są w porządku bez zmniejszania wydajności, podczas gdy krótsze czasy nie są zalecane.
6. W przypadku mikroskopii ważny jest wybór powiększenia. W zastosowanym tutaj systemie Opera LX rozdzielczość 20x jest wystarczająca do uzyskania wysokiej jakości obrazu. Jeśli wymagane są obrazy o wyższej rozdzielczości, cel można zmienić, ale aby uzyskać statystycznie istotną liczbę komórek, wymagana jest większa liczba pól i dłuższe czasy akwizycji. Ogólnie rzecz biorąc, dążymy do tego, aby zobrazować co najmniej 100 komórek na dołek.

Test translokacji Grb2 został wykorzystany przez inne grupy do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów aktywacji kinazy^{EGFR 6}. W takim przypadku EGFR jest specyficznie aktywowany ligandem, powodując rekrutację Grb2 do błony plazmatycznej. Zakłócenie tej interakcji można następnie zbadać za pomocą związków małocząsteczkowych. Podobnie można przewidzieć, że badania przesiewowe siRNA mogą być stosowane do identyfikacji endogennych genów zaangażowanych w sygnalizację EGFR-Grb2 lub inne receptory czynnika wzrostu wiążącego Grb2, takie jak c-KIT lub receptor erytropoetyny. W związku z tym istnieje wiele potencjalnych zastosowań tej techniki. Analogiczne podejście można zastosować do systemów reporterowych oznaczonych GFP dla innych cząsteczek adapterowych, takich jak Shc, Gab lub IRS.

Jedną z głównych zalet stosowania tego testu komórkowego w komórkach ssaków jest to, że umożliwia on identyfikację fizjologicznie istotnych interakcji. Test jest odczytem dla tworzenia kompleksów białkowych, ale co ważniejsze, odpowiednie interakcje są monitorowane we właściwym miejscu subkomórkowym. Pod tym względem technika ta pozwala przezwyciężyć artefakty z innych metod interakcji białko-białko, takich jak drożdże-dwie hybrydy lub testy in vitro . Należy jednak zauważyć, że pośrednie interakcje mogą również skutkować rekrutacją Grb2. Podobnie, transkrypcyjna regulacja w górę partnerów wiążących może być indukowana przez ekspresję cDNA. Aby rozróżnić te możliwości, konieczne jest przeprowadzenie odpowiednich testów wtórnych w celu rozróżnienia między bezpośrednim i pośrednim skutkiem wiązania.

Podsumowując, test translokacji cząsteczek GFP-adapter daje nadzieję na duży potencjał w zakresie badań przesiewowych całego genomu i zastosowań związanych z odkrywaniem leków.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biblioteka cDNA	Origene
LB+amp
Uszczelki gazoprzepuszczalne	ThermoScientific	AB-0718
Nucleospin 96 Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740625.4
Transfektyna	BioRad	170-3351
H– CHST33342	Sondy molekularne	H3570
Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Freedom Evo	Tecan		Z kolektorem próżniowym
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	PerkinElmer