Artykuł metodologiczny

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

DOI:

10.3791/4393

⸱

13 lutego 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia kompletną i szczegółową procedurę zastosowania sekwencjonowania RNA, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez. Protokół ten można uogólnić na różne komórki lub tkanki dotknięte różnymi odczynnikami lub stanami chorobowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka ekspresji genów w komórkach poprzez pomiar poziomu mRNA jest użytecznym narzędziem do określenia, jak na maszynerię transkrypcyjną komórki wpływają sygnały zewnętrzne (np. leczenie farmakologiczne), lub jak komórki różnią się między stanem zdrowym a chorym. Wraz z pojawieniem się i ciągłym udoskonalaniem technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) staje się coraz bardziej popularną metodą analizy transkryptomu w celu skatalogowania wszystkich gatunków transkryptów, określenia struktury transkrypcyjnej wszystkich wyrażonych genów oraz ilościowego określenia zmieniających się poziomów ekspresji całkowitego zestawu transkryptów w danej komórce, tkance lub organizmie1,2 . RNA-seq stopniowo zastępuje mikromacierze DNA jako preferowaną metodę analizy transkryptomu, ponieważ ma zalety profilowania całego transkryptomu, zapewniając dane typu cyfrowego (numer kopii dowolnego transkryptu) i nie opierając się na żadnej znanej sekwencji genomu3.

Tutaj prezentujemy kompletny i szczegółowy protokół zastosowania sekwencyjnego RNA do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez niej. Protokół ten opiera się na naszym niedawno opublikowanym badaniu zatytułowanym "RNA-seq ujawnia nowy transkryptom genów i ich izoform w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną", w którym z powodzeniem przeprowadziliśmy pierwszą pełną analizę transkryptomu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną przy użyciu sekwencji RNA. Dostarczyło to bezprecedensowych zasobów do dalszych eksperymentów w celu uzyskania wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw dysfunkcji śródbłonka za pośrednictwem trombiny w patogenezie stanów zapalnych, raka, cukrzycy i choroby niedokrwiennej serca, a także dostarcza potencjalnych nowych wskazówek dla celów terapeutycznych dla tych chorób.

Opisowy tekst tego protokołu jest podzielony na cztery części. W pierwszej części opisano leczenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc za pomocą izolacji trombiny i RNA, analizy jakości i kwantyfikacji. Druga część opisuje budowę i sekwencjonowanie biblioteki. Trzecia część opisuje analizę danych. Czwarta część opisuje test walidacyjny RT-PCR. Wyświetlane są reprezentatywne wyniki kilku kluczowych kroków. Przydatne wskazówki lub środki ostrożności, które pomogą Ci osiągnąć sukces w kluczowych krokach, znajdują się w sekcji Dyskusja. Chociaż protokół ten wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczone trombiną, można go uogólnić w celu profilowania transkryptomów zarówno w komórkach ssaków, jak i innych ssaków oraz w tkankach traktowanych różnymi bodźcami lub inhibitorami, lub w celu porównania transkryptomów w komórkach lub tkankach między stanem zdrowym a stanem chorobowym.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat blokowy przedstawiający ten protokół jest wyświetlany na rysunku 1.

1. Leczenie komórek trombiną, izolacja RNA, ocena jakości i kwantyfikacja RNA

  1. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HMVEC-LBl) do 90-100% konfluencji w płytkach 6-dołkowych w pożywce EGM-2 z 5% FBS, czynnikami wzrostu i antybiotykami (Lonza, kat. # CC-3202).
  2. Zmienić pożywkę na pożywkę głodową (0% FBS) 30 minut przed leczeniem trombiną.
  3. Potraktować komórki trombiną o stężeniu 0,05 U/ml lub pozostawić bez leczenia jako kontrolę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Wyizoluj całkowite RNA z komórek poddanych działaniu środka i kontrolnych za pomocą zestawu Ambion mirVana zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Oceń jakość RNA za pomocą chipa eukariotycznego RNA Experion StdSense zgodnie ze standardowym protokołem na automatycznej stacji elektroforezy Experion (www.bio-rad.com).
  6. Określić ilościowo RNA przy użyciu standardowej metody spektrofotometrycznej.

2. Budowa i sekwencjonowanie bibliotek

  1. Jako materiał wyjściowy należy użyć 1 μg wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę.
  2. Aby zbudować bibliotekę, postępuj zgodnie ze standardową procedurą firmy Illumina (protokół # 15008136 Rev. A). W tym protokole wykonywane są dwie rundy selekcji poli(A) zawierającej mRNA w celu usunięcia rRNA w celu zminimalizowania sekwencjonowania rRNA.
  3. Oceń jakość bibliotek za pomocą chipa Experion DNA 1K zgodnie ze standardowym protokołem na Automatycznej Stacji Elektroforezy Experion (www.bio-rad.com).
  4. Określ ilościowo bibliotekę za pomocą qPCR: Użyj biblioteki, która została wcześniej zsekwencjonowana jako krzywa standardowa i startery specyficzne dla ligowanych adapterów. Użyj zakresu rozcieńczeń nieznanych bibliotek (np. 1:100, 1:500 i 1:1,000). Uruchom qPCR zgodnie z protokołem SyberGreen MM i oblicz pierwotne stężenie zapasów w każdej bibliotece.
  5. Rozcieńczyć zapasy biblioteczne do 10 nM i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do grupowania w komórkę przepływową.
  6. Gdy będziesz gotowy do grupowania komory przepływowej, rozmrozić płytkę odczynnika cBot w łaźni wodnej. cBot to instrument firmy Illumina używany do usprawnienia procesu generowania klastrów.
  7. Umyj instrument cBot.
  8. Denaturuj biblioteki: Połącz 13 μl biblioteki 1x TE i 6 μl 10 μM, a z boku probówki dodaj 1 μl 1 N NaOH (dostarczone przez Illumina). Wirować, odwirować, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i umieścić zdenaturowane biblioteki na lodzie.
  9. Rozcieńczyć biblioteki: Rozcieńczyć zdenaturowane biblioteki wstępnie schłodzonym buforem hybrydyzacyjnym (HT1, dostarczonym przez Illumina) poprzez połączenie 996 μl HT1 i 4 μl zdenaturowanej biblioteki w celu uzyskania końcowego stężenia 12 pM. Umieść zdenaturowane i rozcieńczone biblioteki na lodzie.
  10. Odwróć każdy rząd probówek na płytce cBot, upewniając się, że wszystkie odczynniki są rozmrożone. Zakręć płytką, usuń/przebij uszczelki foliowe i załaduj na cBota.
  11. Podwielokrotność 120 μl rozcieńczonych, zdenaturowanych bibliotek do probówki paskowej, oznaczonej 1-8. Dodaj 1,2 μl rozcieńczonej, zdenaturowanej biblioteki kontrolnej PhiX (od Illumina) do każdej probówki jako kontrolę skokową. Wiruj i zakręć rurki w dół i załaduj je na cBot we właściwej orientacji (rura #1 po prawej).
  12. Załaduj komórkę przepływową i kolektor do cBota.
  13. Zakończ sprawdzanie przepływu i rozpocznij przebieg klastrowania.
  14. Po zakończeniu przebiegu sprawdź dostarczanie odczynnika na wszystkich torach. Zanotuj wszelkie nieprawidłowości. Albo natychmiast rozpocząć sekwencjonowanie, albo umieścić komórkę przepływową w dostarczonej probówce w temperaturze 4 °C.
  15. Rozmrozić odczynniki do sekwencjonowania przez syntezę (SBS, Illumina).
  16. Załaduj odczynniki w odpowiednie miejsca na tackach na odczynniki, uważając, aby nie dotknąć innych odczynników po dotknięciu mieszanki rozszczepienia.
  17. Używając komory przepływowej bez sekwencjonowania (tj. takiej, która została wcześniej zsekwencjonowana), dwukrotnie zalać linie odczynników.
  18. Dokładnie wyczyść komórkę przepływową sekwencjonowania 70% EtOH i Kimwipes, a następnie 70% EtOH i papierem do soczewek. Sprawdź komórkę przepływową pod kątem smug. W razie potrzeby wyczyść go ponownie.
  19. Załaduj komórkę przepływową do sekwencera i przeprowadź kontrolę przepływu, aby upewnić się, że uszczelnienie między kolektorami a komorą przepływową jest szczelne.
  20. Rozpocznij sekwencjonowanie.
  21. Oceń metryki jakości (np. gęstość klastrów, klastry przechodzące filtr, Q30, intensywność), gdy stają się dostępne podczas uruchamiania.
  22. Monitoruj intensywność przez cały bieg.
  23. Po zakończeniu 101 cykli wykonaj proces chemiczny, aby zakończyć drugi odczyt: Rozmrozić sparowane odczynniki końcowe i drugi odczyt bufora inkorporacji (ICB, składnik odczynników SBS, Illumina) i załaduj odczynniki.
  24. Kontynuuj sekwencjonowanie, oceniając intensywność odczytu 2.stopnia, Q30 i inne wskaźniki jakości w miarę postępu przebiegu.

3. Analiza danych

  1. Użyj najnowszej wersji CASAVA (Illumina, obecnie 1.8.2), aby przekonwertować pliki podstawowych plików wywołań (.bcl) na pliki .fastq, ustawiając fastq-cluster-count na 0, aby zapewnić utworzenie jednego pliku fastq dla każdej próbki. Rozpakuj pliki fastq w celu dalszej analizy.
  2. Wykonaj wyrównanie sparowanych końców przy użyciu najnowszych wersji TopHat (1.4.1)5, który wyrównuje odczyty sekwencyjne RNA do genomów ssaków za pomocą ultra wysokowydajnego wyrównywacza krótkiego odczytu (Bowtie,0.12.7)6 i SAMtools (0.1.17)7. SAMtools implementuje różne narzędzia do wyrównania po przetwarzaniu w formacie SAM. Referencyjny transkryptom człowieka można pobrać ze strony iGenomes (www.illumina.com). Uruchamiając TopHat, użyliśmy wszystkich domyślnych ustawień parametrów, w tym opcji typu biblioteki jako fr-unstranded (domyślnie).
  3. Korzystając z programu CuffDiff, części pakietu oprogramowania CuffLinks (1.3.0)8, porównaj komórki traktowane trombiną z komórkami kontrolnymi, aby odsiać transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji w tych pierwszych na podstawie ludzkiego transkryptomu referencyjnego. To porównanie wykrywa różnicową ekspresję znanych transkryptów. Użyj programu Microsoft Excel, aby zwizualizować wynik w formie tabeli. Uruchamiając program Spinki do mankietów, użyliśmy wszystkich domyślnych ustawień parametrów. Te transkrypty genów z FPKM<0,05 i p>0,05 są odfiltrowywane.
  4. Aby wykryć nowe izoformy, uruchom spinki do mankietów bez transkryptomu referencyjnego. Porównaj pliki transkrypcji próbki z genomem referencyjnym za pomocą Cuffcompare i przetestuj ekspresję różnicową za pomocą Cuffdiff, używając połączonych plików transkryptów trombiny jako genomu referencyjnego dla jednej analizy i połączonych kontrolnych plików transkryptów jako genomu referencyjnego dla drugiej analizy. Użyj programu Microsoft Excel, aby zwizualizować wynik w formacie tabelarycznym. Ponownie, te transkrypty genów z FPKM<0,05 i p>0,05 są odfiltrowywane. Po tym kroku badacze mogą zdecydować się na przesłanie listy nowo zgłoszonych transkryptów na stronę internetową UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) w celu zweryfikowania ich ważności poprzez ręczną inspekcję.
  5. Prześlij listy genów o zróżnicowanej ekspresji do Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com) w celu scharakteryzowania genów i szlaków, na które wpływa leczenie trombiną. Na tym etapie badacze mogą zdecydować się na użycie CummeRbund (http://compbio.mit.edu/cummeRbund/), pakietu R, który został zaprojektowany, aby pomóc i uprościć zadanie analizy danych wyjściowych RNA spinki do mankietów, aby pomóc w zarządzaniu, wizualizacji i integracji wszystkich danych uzyskanych w wyniku analizy Cuffdiff.

4. Walidacja wyników sekwencjonowania RNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

  1. Przeprowadzić całkowitą izolację RNA z komórek kontrolnych i HMVEC-LBl traktowanych trombiną, ocenę jakości RNA i kwantyfikację RNA opisano w krokach od 1.4 do 1.6.
  2. Wygeneruj komplementarne DNA z 1 μg całkowitego RNA każdej próbki za pomocą zestawów RT SuperScript III First-Strand Synthesis System, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen, 18080-051).
  3. Wykonaj analizę qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems ViiA 7 przy użyciu oligonukleotydów zaprojektowanych przez Taqman Assay-on-Demand do wykrywania CUGBP, członka rodziny podobnego do Elav1 (CELF1, Hs00198069_m1), fankonianemii, grupy komplementacji D2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), czynnika 1 związanego z receptorem TNF (TRAF1, Hs01090170_m1) i β-aktyny (ACTB, Hs99999903_m1). Każda próbka miała matrycę odpowiadającą 5 ng całkowitego RNA. Zmierz ilościowo za pomocą metody DDCt i znormalizuj do β-aktyny. Każdy test przeprowadzono na co najmniej trzech kontrpróbach biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla kroku 1: Stosunek 28s:18s jest tradycyjnie używany jako wskaźnik degradacji RNA. Idealnie byłoby, gdyby szczyt 28s miał około dwa razy większą powierzchnię niż pasmo 18s (stosunek 2), jednak ten idealny stosunek często nie jest spotykany w praktyce. Co więcej, proporcje 28s:18s uzyskane metodami spektrofotometrycznymi mogą zaniżać stopień degradacji RNA. Aby dokładniej określić ilościowo degradację, a tym samym jakość próbki RNA, system Experion oblicza liczbę wskaźnika jakości RNA (RQI). Algorytm RQ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki

Postępowanie z RNA: RNazy degradują nawet RNA o najwyższej jakości, dlatego należy zachować ostrożność podczas izolacji, przechowywania i stosowania RNA10. Rękawice są zawsze noszone, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazami znajdującymi się na ludzkich dłoniach. Rękawiczki należy często zmieniać, szczególnie po dotknięciu skóry, klamek lub innych wspólnych powierzchni. Zestaw pipet powinien być dedykowany wyłącznie do pracy z RNA, a wszystkie końcówki i ru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Stephenowi Kingsmore'owi i Centrum Medycyny Genomu Pediatrycznego w Szpitalach i Klinikach Miłosierdzia Dziecięcego za wykorzystanie ich klastrów obliczeniowych do analizy danych, zespołowi usług terenowych Illumina (Elizabeth Boyer, Scott Cook i Mark Cook) oraz zespołowi konsultantów technicznych za szybkie odpowiedzi i pomocne sugestie dotyczące działania instrumentu do sekwencjonowania DNA nowej generacji, HiScanSQ i analiza jakości danych. Praca ta była częściowo wspierana przez National Institutes of Health Grant HL080042 (dla S.Q.Y.) oraz fundusz początkowy i fundację Children's Mercy Hospitals and Clinics, University of Missouri w Kansas City (dla S.Q.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płucLonzaCC-2815
Lonza, zestaw pociskówLonzaCC-3202Zawiera EGM-2, FBS, czynniki wzrostu i antybiotyki
TrombinSigmaT4393
Ambion mirVana KitLife TechnologiesAM 1560
RNase-ZapLife TechnologiesAM9782
Experion StdSens RNABio-Rad700-7103
Zestaw do przygotowania RNA TruSeqIlluminaFC-122-1001
Koraliki AMPureXPBeckman CoulterA63881
Indeks górny Odwrotna transkryptaza IILife Technologies18064-014
Experion DNA 1KBio-Rad700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen204163
Zestaw do generowania klastrów PEIlluminaPE-401-3001
PhiXZestaw kontrolny IlluminaFC110-301
200 cykli SBSIlluminaFC-401-3001
HiScanSQ* IlluminaSY-103-2001
cBotIlluminaSY-301-2002
Maszyna qPCR - Viia7Life TechnologiesModel #VIIA7 / Sprzęt #10631261Lub równoważny
Experion System Bio Rad7007001Bioanalyzer to alternatywny system
Spektrofotometr Bio-TekEpoch Spektrofotometr mikropłytkowyLub równoważny
Wirówka - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific75004521Lub równoważny
Stojak magnetycznyLife TechnologiesAM10027
96-dołkowy termocyklerOgólny dostawca
Tabela 3. Lista kluczowych odczynników i głównych urządzeń. *, Na filmie zademonstrowano HiSeq1000 zamiast HiScanSQ.
Zestaw sterujący laboratoryjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
  4. Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229(2012).
  5. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25(2009).
  7. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  8. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  9. Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).
  10. Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
  11. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
  12. Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
  13. Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
  14. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transcriptome ProfilingThrombin TreatmentRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

Powiązane artykuły