Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

Method Article

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹ , Margaret Gibson¹ , Suman Chaudhary¹ , Li Qin Zhang¹ , Daniel P. Heruth¹ , Dmitry N. Grigoryev¹ , Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia kompletną i szczegółową procedurę zastosowania sekwencjonowania RNA, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez. Protokół ten można uogólnić na różne komórki lub tkanki dotknięte różnymi odczynnikami lub stanami chorobowymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka ekspresji genów w komórkach poprzez pomiar poziomu mRNA jest użytecznym narzędziem do określenia, jak na maszynerię transkrypcyjną komórki wpływają sygnały zewnętrzne (np. leczenie farmakologiczne), lub jak komórki różnią się między stanem zdrowym a chorym. Wraz z pojawieniem się i ciągłym udoskonalaniem technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) staje się coraz bardziej popularną metodą analizy transkryptomu w celu skatalogowania wszystkich gatunków transkryptów, określenia struktury transkrypcyjnej wszystkich wyrażonych genów oraz ilościowego określenia zmieniających się poziomów ekspresji całkowitego zestawu transkryptów w danej komórce, tkance lub organizmie^1,2 . RNA-seq stopniowo zastępuje mikromacierze DNA jako preferowaną metodę analizy transkryptomu, ponieważ ma zalety profilowania całego transkryptomu, zapewniając dane typu cyfrowego (numer kopii dowolnego transkryptu) i nie opierając się na żadnej znanej sekwencji genomu³.

Tutaj prezentujemy kompletny i szczegółowy protokół zastosowania sekwencyjnego RNA do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez niej. Protokół ten opiera się na naszym niedawno opublikowanym badaniu zatytułowanym "RNA-seq ujawnia nowy transkryptom genów i ich izoform w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną^", w którym z powodzeniem przeprowadziliśmy pierwszą pełną analizę transkryptomu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną przy użyciu sekwencji RNA. Dostarczyło to bezprecedensowych zasobów do dalszych eksperymentów w celu uzyskania wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw dysfunkcji śródbłonka za pośrednictwem trombiny w patogenezie stanów zapalnych, raka, cukrzycy i choroby niedokrwiennej serca, a także dostarcza potencjalnych nowych wskazówek dla celów terapeutycznych dla tych chorób.

Opisowy tekst tego protokołu jest podzielony na cztery części. W pierwszej części opisano leczenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc za pomocą izolacji trombiny i RNA, analizy jakości i kwantyfikacji. Druga część opisuje budowę i sekwencjonowanie biblioteki. Trzecia część opisuje analizę danych. Czwarta część opisuje test walidacyjny RT-PCR. Wyświetlane są reprezentatywne wyniki kilku kluczowych kroków. Przydatne wskazówki lub środki ostrożności, które pomogą Ci osiągnąć sukces w kluczowych krokach, znajdują się w sekcji Dyskusja. Chociaż protokół ten wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczone trombiną, można go uogólnić w celu profilowania transkryptomów zarówno w komórkach ssaków, jak i innych ssaków oraz w tkankach traktowanych różnymi bodźcami lub inhibitorami, lub w celu porównania transkryptomów w komórkach lub tkankach między stanem zdrowym a stanem chorobowym.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat blokowy przedstawiający ten protokół jest wyświetlany na rysunku 1.

1. Leczenie komórek trombiną, izolacja RNA, ocena jakości i kwantyfikacja RNA

Hodowla ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HMVEC-LBl) do 90-100% konfluencji w płytkach 6-dołkowych w pożywce EGM-2 z 5% FBS, czynnikami wzrostu i antybiotykami (Lonza, kat. # CC-3202).
Zmienić pożywkę na pożywkę głodową (0% FBS) 30 minut przed leczeniem trombiną.
Potraktować komórki trombiną o stężeniu 0,05 U/ml lub pozostawić bez leczenia jako kontrolę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
Wyizol....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla kroku 1: Stosunek 28s:18s jest tradycyjnie używany jako wskaźnik degradacji RNA. Idealnie byłoby, gdyby szczyt 28s miał około dwa razy większą powierzchnię niż pasmo 18s (stosunek 2), jednak ten idealny stosunek często nie jest spotykany w praktyce. Co więcej, proporcje 28s:18s uzyskane metodami spektrofotometrycznymi mogą zaniżać stopień degradacji RNA. Aby dokładniej określić ilościowo degradację, a tym samym jakość próbki RNA, system Experion oblicza liczbę wskaźnika jakości RNA (RQI). Algorytm RQ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki

Postępowanie z RNA: RNazy degradują nawet RNA o najwyższej jakości, dlatego należy zachować ostrożność podczas izolacji, przechowywania i stosowania RNA¹⁰. Rękawice są zawsze noszone, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazami znajdującymi się na ludzkich dłoniach. Rękawiczki należy często zmieniać, szczególnie po dotknięciu skóry, klamek lub innych wspólnych powierzchni. Zestaw pipet powinien być dedykowany wyłącznie do pracy z RNA, a wszystkie końcówki i ru.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Stephenowi Kingsmore'owi i Centrum Medycyny Genomu Pediatrycznego w Szpitalach i Klinikach Miłosierdzia Dziecięcego za wykorzystanie ich klastrów obliczeniowych do analizy danych, zespołowi usług terenowych Illumina (Elizabeth Boyer, Scott Cook i Mark Cook) oraz zespołowi konsultantów technicznych za szybkie odpowiedzi i pomocne sugestie dotyczące działania instrumentu do sekwencjonowania DNA nowej generacji, HiScanSQ i analiza jakości danych. Praca ta była częściowo wspierana przez National Institutes of Health Grant HL080042 (dla S.Q.Y.) oraz fundusz początkowy i fundację Children's Mercy Hospitals and Clinics, University of Missou....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płuc	Lonza	CC-2815
Lonza, zestaw pocisków	Lonza	CC-3202	Zawiera EGM-2, FBS, czynniki wzrostu i antybiotyki
Trombin	Sigma	T4393
Ambion mirVana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNase-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens RNA	Bio-Rad	700-7103
Zestaw do przygotowania RNA TruSeq	Illumina	FC-122-1001
Koraliki AMPureXP	Beckman Coulter	A63881
Indeks górny Odwrotna transkryptaza II	Life Technologies	18064-014
Experion DNA 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen	204163
Zestaw do generowania klastrów PE	Illumina	PE-401-3001
PhiX	Zestaw kontrolny Illumina	FC110-301
200 cykli SBS	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ*	Illumina	SY-103-2001
cBot	Illumina	SY-301-2002
Maszyna qPCR - Viia7	Life Technologies	Model #VIIA7 / Sprzęt #10631261	Lub równoważny
Experion System	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer to alternatywny system
Spektrofotometr	Bio-Tek	Epoch Spektrofotometr mikropłytkowy	Lub równoważny
Wirówka - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	Lub równoważny
Stojak magnetyczny	Life Technologies	AM10027
96-dołkowy termocykler	Ogólny dostawca
Tabela 3. Lista kluczowych odczynników i głównych urządzeń. *, Na filmie zademonstrowano HiSeq1000 zamiast HiScanSQ.

Zestaw sterujący laboratoryjny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

In This Article

Summary

Abstract

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles