Echokardiografia płodowa myszy

Podsumowanie

Śmierć płodowa i okołoporodowa jest częstym zjawiskiem podczas badania zmian genetycznych wpływających na rozwój serca. Obrazowanie za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości poprawiło rozdzielczość 2-D i może dostarczyć doskonałych informacji na temat wczesnego rozwoju serca, stanowiąc idealną metodę wykrywania wpływu na strukturę i funkcję serca przed śmiercią.

Streszczenie

Myszy transgeniczne wykazujące nieprawidłowości w rozwoju i funkcji serca stanowią potężne narzędzie do zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących zarówno u podstaw prawidłowej funkcji układu sercowo-naczyniowego, jak i patofizjologicznych podstaw ludzkich chorób układu krążenia. Śmierć płodu oraz śmierć w okresie okołoporodowym są częstymi zjawiskami podczas badania zmian genetycznych wpływających na rozwój serca ^1-3. Aby zbadać rolę zmian genetycznych lub farmakologicznych we wczesnym rozwoju funkcji serca, obrazowanie ultradźwiękowe żywego płodu stało się ważnym narzędziem wczesnego rozpoznawania nieprawidłowości i prowadzenia obserwacji podłużnych. Nieinwazyjne obrazowanie ultradźwiękowe jest idealną metodą wykrywania i badania wad wrodzonych oraz ich wpływu na funkcję serca przed śmiercią ⁴. Pozwala ono na wczesne rozpoznanie nieprawidłowości u żywego płodu, a postęp choroby można śledzić wewnątrzmacicznie w ramach badań podłużnych ^5,6. Do niedawna obrazowanie serc płodów myszy często wiązało się z metodami inwazyjnymi. Płód musiał zostać uśmiercony w celu wykonania mikroskopii rezonansu magnetycznego i mikroskopii elektronowej lub wyjęty chirurgicznie do mikroskopii prześwietleniowej. Wykazano, że zastosowanie sond wysokiej częstotliwości z konwencjonalnym obrazowaniem 2-D i dopplerowskim w trybie impulsowym pozwala na pomiary skurczu serca i częstotliwości akcji serca podczas rozwoju embrionalnego, a obecnie dostępne są bazy danych dotyczących prawidłowych zmian rozwojowych ^6-10. Obrazowanie w trybie M dostarcza dodatkowo ważnych danych funkcjonalnych, choć odpowiednie płaszczyzny obrazowania są często trudne do uzyskania. Wysokoczęstotliwościowe obrazowanie ultradźwiękowe płodu poprawiło rozdzielczość 2-D i może dostarczyć doskonałych informacji o wczesnym rozwoju struktur serca ¹¹.

Protokół

1. Przygotowanie myszy do obrazowania

1. Przed badaniem obrazowym znieczulić samicę (2-3% izofluranu) w komorze indukcyjnej. Wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej i natychmiast umieścić pysk w masce nosowej podłączonej do systemu anestezjologicznego. Usunąć sierść od poziomu środka klatki piersiowej do kończyn dolnych (patrz Rysunek 1) za pomocą maszynki do strzyżenia. Pozostałą sierść na ciele usunąć za pomocą kremu do depilacji. Krem do depilacji można stosować również bez użycia maszynki; po zastosowaniu należy go dokładnie spłukać ze skóry, aby zapobiec podrażnieniom.
2. Umieścić znieczurzoną mysz w pozycji grzbietnej na podgrzewaczce z wbudowanymi odprowadzeniami EKG w celu utrzymania temperatury ciała (Rysunek 1). Nałożyć żel do elektrod na cztery łapy i przymocować je taśmą do elektrod EKG.
3. Utrzymywać stały poziom sedacji przez cały czas trwania procedury (1,0% do 1,5% izofluranu zmieszanego ze 100% O₂). Poziom znieczulenia można dostosowywać, aby utrzymać docelową częstość akcji serca na poziomie 450 ± 50 uderzeń na minutę (bpm). Należy zwrócić szczególną uwagę na minimalizację dawki izofluranu oraz skrócenie czasu sedacji do mniej niż jednej godziny.
4. Ostrożnie wprowadzić (po uprzednim nasmarowaniu) sondę rektalną w celu monitorowania temperatury ciała za pomocą podgrzewaczki. Ważne jest utrzymanie temperatury ciała w wąskim zakresie (37,0 °C ± 0,5 °C). Kontrolowana anestezja i stała temperatura ciała są niezbędne dla stabilności hemodynamicznej samicy i płodów.

Uwagi techniczne

Pozyskiwanie echokardiogramów płodowych może być trudne. Dane uzyskane z tych badań mogą być obarczone błędami ze względu na reakcję na stres zarówno samicy, jak i płodu. W idealnym przypadku temperaturę zwierzęcia należy utrzymywać przy użyciu podgrzewanej platformy obrazowej, krążącej podkładki grzewczej, lamp grzewczych lub autoregulowanych koców grzewczych. Ponadto zaleca się rutynowe stosowanie podgrzewanego żelu akustycznego. Chociaż główną kwestią dotyczącą kontroli temperatury ciała jest unikanie hipotermii, rozwój hipertermii powinien być równie istotny. Nie monitorowana aparatura grzewcza, taka jak zwykła podkładka grzewcza, lub bliskość oświetlenia halogenowego mogą prowadzić do szybkiego i niebezpiecznego wzrostu temperatury ciała. Ponieważ znaczne wahania temperatury ciała w obu kierunkach narażają zwierzę na ryzyko, należy dołożyć wszelkich starań, aby utrzymać prawidłową temperaturę ciała.

Osoba wykonująca badanie sonograficzne musi unikać wywierania nadmiernego nacisku głowicą na jamę ciała, ponieważ sama waga głowicy może doprowadzić do zaburzeń funkcji serca. Czas akwizycji obrazów musi być również ograniczony do minimum (idealnie poniżej jednej godziny), aby zredukować fizjologiczne i hemodynamiczne zmiany wynikające z przedłużonej sedacji. Ponadto, ze względu na potencjalne działanie teratogenne izofluranu, czas i stopień ekspozycji na izofluran podczas każdego badania muszą być ograniczone do minimum ¹².

2. Identyfikacja embrionów

1. Obrazowanie rozpoczyna się, wykorzystując pęcherz matki jako punkt orientacyjny; płody w lewym i prawym rogu macicy są oznaczane jako L1, 2, 3, et cetera (lewa strona) oraz R1, 2, 3, et cetera (prawa strona) (patrz Rycina 1C). Notowanie lokalizacji płodów jest przydatne przy późniejszym pobieraniu próbek po obrazowaniu.
2. Okazy znajdujące się zbyt głęboko w jamie brzusznej są skanowane w celu udokumentowania ich obecności, lecz zostają wykluczone z analizy danych ze względu na niską rozdzielczość. Możliwość skanowania sąsiednich embrionów może pomóc w śledzeniu lokalizacji płodów (Rycina 2A).
3. Płaszczyzny skanowania są modyfikowane poprzez zmianę orientacji myszy względem płaszczyzny skanowania. Dla każdego płodu pozyskiwane są obrazy w dwóch płaszczyznach ortogonalnych (Rycina 2). Podejmowane są próby uzyskania widoków odpowiadających płaszczyźnie poprzecznej, czołowej lub strzałkowej, jednak ze względu na położenie macicy w jamie brzusznej czasami ogranicza się to do płaszczyzn skośnych. Obrót głowicy skanującej pozwala również na modyfikację orientacji bez konieczności przesuwania samicy.

Kwestie techniczne

Choć podczas echokardiografii u dorosłych myszy możliwe jest ręczne prowadzenie głowicy, w przypadku obrazowania płodów nie jest ono zalecane. Identyfikacja płodów jest utrudniona ze względu na zmienną lokalizację w macicy, jej krętość oraz ruchomość. Aby zminimalizować trudności z lokalizacją płodu, niezbędne jest zastosowanie stacjonarnego przetwornika (Rysunek 1) z ograniczeniem ruchów poza płaszczyzną poziomą samicy.

3. Ocena struktury i funkcji

1. Obrazy w trybie skanowania B są wykorzystywane do identyfikacji podstawowych struktur serca, takich jak przedsionki, przegroda międzykomorowa, komory oraz lewy i prawy odpływ (Rysunek 2).
2. Obrazy w trybie M pozyskuje się z widoku osi krótkiej i służą one do pomiaru grubości ścian komór oraz wymiarów jam serca (Rysunek 3). Jeśli ze względu na położenie płodu nie można uzyskać prawidłowego ustawienia, do ilościowego określenia procentowego skrócenia frakcyjnego (FS) można wykorzystać pomiary z obrazów w trybie B. Zmiany czasowe między końcowym wymiarem skurczowym lewej komory (LVESD) a końcowym wymiarem rozkurczowym lewej komory (LVEDD) w trakcie cyklu serca są wykorzystywane do obliczenia frakcji skrócenia (FS) według następującego wzoru:
   %FS = [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] x 100
3. Lewą i prawą komorę identyfikuje się poprzez skanowanie od głowy do ogona. Należy oznaczyć stronę lewą i prawą. Widoczne strumienie przepływu generowane przez echogeniczną krew płodu ułatwiają dokładne umieszczenie próbki objętości Dopplera w obrębie otworu mitralnego. Prędkość napływu do lewej komory jest mierzona na poziomie zastawek mitralnych w widokach czterojamowych koniuszkowych oraz w widoku długiej osi LV (Rysunek 4,C). Pomiary odpływu aortalnego mogą być wykorzystane do pomiaru czasu wyrzutu skurczowego (Rysunek 4,D). Częstość akcji serca można obliczyć na podstawie pomiaru od jednego cyklu przepływu do następnego cyklu przepływu (Rysunek 4, C i D). Należy zadbać o to, aby przepływ krwi i wiązka Dopplera były wyrównane w celu zminimalizowania kąta Dopplera. Wartości uzyskane przy kącie powyżej 60 stopni są niedokładne i należy ich unikać.
4. Obrazy w trybie skanowania B są wykorzystywane do identyfikacji powszechnych wrodzonych wad strukturalnych, takich jak ubytki w przegrodzie międzykomorowej (Rysunek 5). Próbka objętości Dopplera w obrębie komór może być użyta do zidentyfikowania przepływu przez przegrodę międzykomorową. Dodatkowe parametry, które można łatwo monitorować, obejmują wielkość płodu, częstość akcji serca, prędkości przepływu, wysięki w worku osierdziowym oraz wodniczkę płodu. Ostateczna diagnoza konkretnych wad serca wymaga dodatkowej oceny podczas nekropsji i badania histopatologicznego.

Uwagi techniczne

Identyfikacja komór lewej i prawej w obrazowaniu serca płodu może być trudna ze względu na podobne wymiary komórt ventricularnych podczas rozwoju. Jedną ze strategii jest ustalenie orientacji prawej i lewej strony płodu w czasie rzeczywistym poprzez przesuwanie platformy obrazującej w płaszczyźnie poziomej. Identyfikacja pyszczka, pączków kończyn i kręgosłupa pomoże określić orientację lewo/prawo płodu. Jeśli to możliwe, śledzenie drogi odpływu do łuku lub wizualizacja głównej rozgałęzienia tętnicy płucnej pozwoli odpowiednio na identyfikację lewego lub prawego odcinka odpływu komory. W przypadku każdego badanego płodu ważne jest odnotowanie ustalonej orientacji lewo-prawo na zapisanych obrazach.

Monitorowanie i opieka nad zwierzętami po obrazowaniu

Po zakończeniu obrazowania samica zostaje przeniesiona do odpowiedniego pomieszczenia i monitorowana zgodnie ze standardowym instytucjonalnym protokołem pozabiegowym. Analgezja po tej procedurze obrazowania nie jest wymagana. Pełny powrót do normalnej aktywności spodziewany jest w ciągu pięciu minut.

4. Reprezentatywne wyniki echokardiografii płodowej

Opracowanie sond wysokiej częstotliwości (powyżej 8 MHz) pozwoliło komercyjnemu sprzętowi echokardiograficznemu na uzyskanie rozdzielczości osiowej wynoszącej około 0,2 mm oraz rozdzielczości bocznej 0,3 mm przy powiększeniu obrazu i akwizycji na głębokości 1 cm. Większość niedawno opracowanych przetworników jest liniowa, co daje zaletę w postaci uniknięcia artefaktów w polu bliskim. Ostatnio opracowano mechaniczne sondy wysokiej częstotliwości (30-50 MHz), które są odpowiednie dla klatki piersiowej i tętna myszy, umożliwiając uzyskanie rozdzielczości osiowej wynoszącej około 50 μm na głębokości 5-12 mm. W ostatnim czasie te wysokoczęstotliwościowe sondy mechaniczne zostały wyposażone w funkcję kolorowego Dopplera, co umożliwia pełną ocenę funkcji komór i zastawek oraz identyfikację wad przecieków w sercu płodu. Metody opisane w niniejszej pracy są wykonywane na systemie VisualSonics Vevo 770 i mogą być zastosowane w prawie wszystkich równoważnych systemach. Obecnie dostępne komercyjnie systemy ultradźwiękowe ultra-wysokiej częstotliwości mogą pracować z częstotliwością 40 Hz przy maksymalnej głębokości obrazowania od 7 do 14 mm, z rozdzielczością boczną do 60 mm oraz osiową od 50 do 100 mm (Vevo770, VisualSonics, Inc.). W porównaniu z tym, kliniczny system ultradźwiękowy Acuson Sequoia charakteryzuje się częstotliwością 60 Hz i głębokością obrazowania 20 mm, przy rozdzielczości osiowej od 50 do 100 mm i bocznej od 200 do 500 mm.

Ze względu na niewielki rozmiar serca płodu myszy, badania echokardiograficzne płodów myszy są trudne pod względem technicznym. W przeciwieństwie do echokardiografii u dorosłych myszy, sonograf musi stosować niekonwencjonalne płaszczyzny obrazowania ultradźwiękowego, definiowane przez osie ciała płodu. Na orientację płodu wpływa również krętość macicy, co należy wziąć pod uwagę. Ponadto inherentne ograniczenie głębokości penetracji ultradźwięków o bardzo wysokiej częstotliwości może utrudnić obrazowanie wszystkich osobników w ciążach z dużą liczbą płodów.

Strategia obrazowania ultrasonograficznego umożliwia wysokoprzepustowy screening w kierunku wrodzonych wad sercowo-naczyniowych i pozasercowych ⁷. Poza badaniem zmian genetycznych, technika ta może być wykorzystywana do wykrywania wad w badaniach farmakologicznych i toksykologicznych. Metodologia ta może służyć również jako narzędzie naprowadzające podczas procedur interwencyjnych, takich jak iniekcje czy pomiary ciśnień komorowych ¹³.

Nieinwazyjny charakter badania ultrasonograficznego płodu jest korzystny nie tylko dlatego, że pozwala na ocenę funkcji układu sercowo-naczyniowego w warunkach fizjologicznych, ale także dlatego, że dostarcza ono krytycznych informacji fenotypowych w czasie rzeczywistym. Badanie podłużne serc zarodkowych, choć technicznie możliwe, pozostaje trudne z kilku powodów. Seryjne badanie tego samego płodu oraz identyfikacja tego samego osobnika podczas każdego badania są utrudnione w przypadku braku ewidentnej wady strukturalnej. Ruchy macicy i płodu mogą całkowicie zmienić orientację preparatu, co utrudnia śledzenie podłużne i wykonywanie pomiarów kontrolnych ¹⁴.

Choć echokardiografia jest potężną techniką identyfikacji nieprawidłowości serca, konkretna diagnoza wad strukturalnych serca wymaga dalszego szczegółowego fenotypowania poprzez nekropsję i histopatologię ¹⁵. Korelacja genotypu z konkretnym płodem wymaga pobrania płodów poprzez hysterotomię, najlepiej bezpośrednio po badaniu echo i podczas gdy samica jest nadal pod wpływem znieczulenia, aby zminimalizować zmiany w orientacji i lokalizacji zarodka.

W literaturze podano normalne wartości wymiarów i funkcji jam dla myszy w okresie embrionalnym; użytkownikom tej techniki zaleca się zapoznanie z cytowanymi referencjami w celu weryfikacji tych wartości ^6-10. Ocena morfologii zastawek jest ograniczona przez rozdzielczość obrazu, jednak pomiary wymiarów pierścienia oraz pomiary prędkości przepływu w głównych naczyniach są możliwe już w ED 9.5. Należy zadbać o odpowiednie wyrównanie przetwornika z kierunkiem przepływu krwi ^{10, 16}.

Należy podkreślić, że wymiary serca różnią się w zależności od szczepu myszy, płci i wieku, a także gwałtownie zmieniają się w różnych punktach czasowych rozwoju zarodkowego i przy różnych częstotliwościach pracy serca. Ważne jest, aby zweryfikować, czy grupy myszy są dopasowane pod względem tych parametrów. Obrazowanie płodów również różni się w zależności od szczepu myszy. Na przykład ciężarna samica CD-1 zazwyczaj posiada więcej embrionów w porównaniu do szczepu C57/BL6, co może utrudniać wizualizację wszystkich osobników. Z tych powodów w każdym eksperymencie zamiast wartości referencyjnych należy stosować grupy kontrolne dopasowane pod względem wieku i szczepu. Ponadto pomiary poszczególnych parametrów, takich jak koniecrozkurczowy wymiar lewej komory i grubość ściany tylnej, mogą różnić się u zdrowych myszy nawet o 25% ⁸.

Rycina 1. Przegląd konfiguracji z wykorzystaniem systemu VisualSonics Vevo 770. (A) Zintegrowany system szynowy VisualSonics z jednostką monitorowania fizjologicznego. (B) Mysz jest pozycjonowana i odpowiednio unieruchomiona na podgrzewanej platformie. Cztery kończyny są przymocowane taśmą do elektrod EKG. (C) Schemat ciężarnej myszy i rozmieszczenie embrionów. Liczba embrionów w każdym rogu macicy może znacząco się różnić, podobnie jak orientacja płodów. (D) Upozycjonowana samica na platformie obrazującej ze strzałkami wskazującymi płaszczyzny manipulacji (oś X i oś Y) służące do przesuwania samicy podczas obrazowania. Oś Z odnosi się do ruchu przetwornika w górę i w dół (jak wskazano strzałką na panelu B). B, pęcherz moczowy; L, lewa; R, prawa.

Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy w trybie B. Rysunek ten zawiera reprezentatywne obrazy w trybie B płodu w 14,5 dniu embrionalnym. (A) Wizualizacja dwóch sąsiadujących płodów. Ramki wskazują położenie serca płodu. (B) Punkty orientacyjne anatomii płodu służące do wyznaczenia orientacji. Serce w 14,5 dniu embrionalnym w widoku czterojamowym (C), widok w osi krótkiej lewej i prawej komory (D), odpływ prawokomorowy i tętnica płucna (PA) (E) oraz odpływ lewokomorowy (LVOT) i aorta (F).

Rysunek 3. Reprezentatywna ocena funkcji komór. Rysunek ten zawiera reprezentatywne obrazy 2D echokardiografii w przekroju długiej osi serca w 14,5 dniu embrionalnym (A) oraz w przekroju czterojamowym (B). (C) Zapis w trybie M z liniami wskazującymi wewnętrzną średnicę prawej i lewej komory w rozkurczu (R/LVIDd) i skurczu (R/LVIDs) w płaszczyźnie obrazu czterojamowego. Widoczna jest również przegroda międzykomorowa (IVS).

Rycina 4. Reprezentatywna ocena Dopplera. Rycina ta zawiera reprezentatywne obrazy dwuwymiarowej echokardiografii serca w 14,5 dniu embrionalnym w przekroju czterojamowym koniuszkowym (A). Obrysowano lewy przedsionek oraz jamę lewej komory. (B) Reprezentatywne rozmieszczenie objętości próbkowania Dopplera impulsowego do rejestracji napływu przez zastawkę mitralną. (C) Wzorce Dopplera napływu mitralnego, z których można zmierzyć prędkość wczesnorozkurczową (oznaczoną jako „E”) oraz prędkość skurczu przedsionka (oznaczoną jako „A”). (D) Reprezentatywny przebieg Dopplera aorty. Strumień Dopplera aorty może być wykorzystany do pomiaru czasu wyrzutu (ET). Częstość akcji serca (HR) można obliczyć na podstawie pomiaru od jednego cyklu przepływu do następnego cyklu przepływu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 5. Reprezentatywne wykrycie ubytku w przegrodzie międzykomorowej. Rysunek ten zawiera reprezentatywne obrazy w trybie B serca z 14,5 dnia embrionalnego w widoku czterojamowym z wierzchołka (A) z zaznaczonymi jamami prawej i lewej komory w (B). Zwróć uwagę na obecność przegrody międzykomorowej. (C) Przekrój poprzeczny obrazowanego serca barwionego hematoksyliną i eozyną. (D) Obraz w trybie B serca z 14,5 dnia embrionalnego z ubytkiem w przegrodzie międzykomorowej (VSD) wskazanym strzałką. (E) Jamy prawej i lewej komory są zaznaczone z naniesioną objętością próbkowania Dopplera impulsowego (Pulse wave Doppler) do zapisu przepływu przez przegrodę międzykomorową. (F) Przekrój poprzeczny obrazowanego serca po pobraniu preparatu, barwiony hematoksyliną i eozyną. (G) Naniesiona objętość próbkowania Dopplera impulsowego do zapisu przepływu przez przegrodę międzykomorową. (H) Reprezentatywny zapis Dopplera z (G) wykazujący przepływ z lewej do prawej komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Zdolność do wykonywania pomiarów seryjnych oraz wykrywania płodów zmutowanych z wadami serca podkreśla użyteczność echokardiografii w badaniu prawidłowego i nieprawidłowego rozwoju układu sercowo-naczyniowego. Analiza struktury i funkcji serca in vivo stała się integralną częścią opisu genetycznych i niegenetycznych modyfikacji prawidłowego rozwoju płodu. Dostępność Dopplera sterowanego obrazem 2D umożliwia monitorowanie częstotliwości akcji serca i wzorców przepływu krwi przy jednoczesnym uzyskiwaniu obrazów w ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System obrazowania Vevo 770 (Toronto, Kanada)	VisualSonics
Przetwornik MHz		RMV707B15-45
Waporyzator izofluranu	Tec 3
Izofluran			2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane