In vitro synteza natywnego, włóknistego kolagenu o długim odstępie oraz kolagenu segmentowego o długim odstępie

Podsumowanie

Opisano proste i powtarzalne procedury wytwarzania trzech strukturalnie odmiennych skupisk kolagenu z powszechnie dostępnego komercyjnie monomeru kolagenu typu I. Kolagen typu natywnego, włóknisty o długim rozstawie lub segmentowy o długim rozstawie może być otrzymywany poprzez zmianę warunków, na jakie narażony jest monomer budulcowy o długości 300 nm i średnicy 1,4 nm.

Streszczenie

Włókna kolagenowe występują w macierzy pozakomórkowej tkanek zwierzęcych, zapewniając rusztowanie strukturalne i wytrzymałość mechaniczną. Naturalne włókna kolagenowe charakteryzują się specyficzną prążkowaną periodycznością wynoszącą ~67 nm i powstają in vivo poprzez hierarchiczną samoorganizację monomerów kolagenu typu I, które mają długość 300 nm i średnicę 1.4 nm. In vitro, poprzez zmianę warunków, jakim poddawane są monomery budulcowe, można tworzyć unikalne struktury o długościach sięgających 50 mikronów, w tym nie tylko włókna typu naturalnego, ale także kolagen o włóknistej długiej przestrzeni (fibrous long spacing) oraz kolagen o segmentowej długiej przestrzeni (segmental long spacing). W niniejszym opracowaniu przedstawiamy procedury formowania trzech różnych struktur kolagenowych z powszechnie dostępnego komercyjnie monomeru kolagenu. Stosowanie protokołów opublikowanych wcześniej przez nas i innych autorów w celu wytworzenia tych trzech typów zazwyczaj prowadzi do powstawania mieszanin struktur. W szczególności, podczas wytwarzania kolagenu naturalnego często stwierdzano obecność włókien bezprążkowych, a podczas tworzenia kolagenu o włóknistej długiej przestrzeni często występowały włókna naturalne. Nowe procedury mają tę zaletę, że pozwalają na otrzymanie niemal wyłącznie pożądanego typu włókien kolagenowych. Formowanie pożądanych struktur jest weryfikowane za pomocą obrazowania z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych.

Wprowadzenie

Kolagen to klasa białek strukturalnych o potrójnej strukturze helikalnej, utworzonej z trzech łańcuchów polipeptydowych. Monomery te łączą się w sposób hierarchiczny, tworząc sukcesywnie większe struktury. Zidentyfikowano co najmniej 28 genetycznie różnych typów kolagenu ¹. Łącznie kolageny stanowią 30% całkowitej zawartości białek w organizmach zwierzęcych, przy czym typ I jest formą dominującą, stanowiąc do 90% wszystkich białek kolagenowych ². Kolagen typu I występuje w postaci struktur włókienstych w skórze, więzadłach, ścięgnach i kościach. Obrazy natywnych włókien kolagenu typu I uzyskane za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) i mikroskopu elektronowego (EM) zazwyczaj wykazują prążkowanie o charakterystycznym okresie ~67 nm (często określane jako prążkowanie D) ^3-5.

Monomer kolagenu typu I jest heterotrimerem o strukturze potrójnej helisy, składającym się z dwóch identycznych łańcuchów α1(I) i jednego łańcucha α2(I), z których każdy ma długość ponad tysiąca aminokwasów. Jest on długi i cienki, o wymiarach 300 nm długości i 1,4 nm średnicy. Monomer kolagenu typu I można łatwo uzyskać poprzez rozkład naturalnie tworzących się struktur wyższego rzędu ⁶. My ⁷ oraz wielu innych autorów ^8-10 wykazaliśmy, że te rozpuszczalne monomeryczne bloki budulcowe mogą następnie zostać wykorzystane do rekonstrukcji fibryli z prążkami D in vitro (Rycina 1).

Oprócz natywnych włókien kolagenowych, stwierdzono, że przy użyciu tego samego monomeru budulcowego in vitro tworzą się dwie inne kolagenowe struktury wyższego rzędu. Są to kolagen o włóknistym długim odstępie (FLS) oraz kolagen o segmentowym długim odstępie (SLS) (Rysunek 1). Kolagen FLS jest konstrukcją włóknistą, podobnie jak kolagen natywny, lecz charakteryzuje się większą periodycznością prążkowania niż kolagen natywny ¹¹. In vitro kolagen FLS powstaje, gdy monomer kolagenu zostanie połączony z α1-glikoproteiną kwasową ¹². Kolagen FLS obserwowano również in vivo, choć rzadko ¹³. Kolagen SLS opisuje się jako krystality, ponieważ monomery są w nich uporządkowane w rejestrach, podobnie jak w sieci krystalicznej ¹⁴. Kolagen SLS powstaje, gdy monomer kolagenu zostanie połączony z adenozynotrifosforanem (ATP) ¹⁵. Naturalnie występujący kolagen SLS zaobserwowano w pożywce hodowlanej fibroblastów, ale nie w ekstraktach z próbek tkanek, co prawdopodobnie wynika z jego niewielkiego rozmiaru i braku rozróżnialnych cech topograficznych ¹⁶.

Celem niniejszej publikacji jest przedstawienie szczegółowych procedur wytwarzania natywnych włókien kolagenowych, a także kolagenu FLS i SLS, które mogą zostać odtworzone nawet przez najmniej doświadczonego badacza. Wykorzystując dostępne komercyjnie zaawansowane materiały wyjściowe, dążyliśmy do maksymalnego uproszczenia protokołów przy jednoczesnym zachowaniu ich niezawodności. Szczegółowo opisujemy również sposób wykorzystania AFM do charakteryzacji otrzymanych różnych struktur kolagenowych. Praca ta będzie pomocna dla badaczy chcących analizować jedną lub więcej z tych struktur kolagenowych wyższego rzędu i/lub wykorzystywać je jako prekursory w innych zastosowaniach, a którzy obecnie nie posiadają odpowiedniej wiedzy specjalistycznej lub po prostu nie chcą pracować z próbkami tkanek.

Protokół

UWAGA: Woda stosowana we wszystkich protokołach ma rezystywność >18 MΩ.cm.

1. Rodzime włókna kolagenowe

1. W probówce do mikrowirówki połączyć 6 μl wody, 20 μl 200 mM Na₂HPO₄ o pH 7 (skorygowanym za pomocą HCl) oraz 10 μl 400 mM KCl, a następnie wymieszać.
2. Do probówki dodać 4 μl monomeru kolagenu (~3 mg/ml w 0,01 N HCl) i wymieszać. Roztwór powinien być klarowny i bezbarwny.
3. Probówkę z mieszaniną reakcyjną umieścić w bloku grzewczym wstępnie podgrzanym do 37 °C i pozostawić na 3 do 4 hr. W tym momencie roztwór powinien być lekko mętny i zawierać głównie natywne fibryle kolagenu.

2. Włóknisty kolagen o dużych odstępach

1. Poddać dializie 1 ml monomeru kolagenu (~3 mg/ml w 0,01 N HCl), używając membrany o MWCO 12-14 kDa przeciwko 400 ml wody, wymieniając wodę cztery razy w ciągu 24 h w temperaturze pokojowej. Dializowany monomer kolagenu, który nie zostanie wykorzystany natychmiast, można przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
2. W probówce do mikrocentryfugi połączyć 20 μl wody, 20 μl α1-acid glycoprotein o stężeniu 3 mg/ml w wodzie oraz 20 μl dializowanego monomeru kolagenu. Roztwór powinien być przejrzysty i bezbarwny.
3. Pozostawić probówkę z mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej na 30 min. W tym momencie roztwór powinien stać się mętny i zawierać głównie włókna kolagenowe FLS.

3. Kolagen z segmentowymi dużymi odstępami

1. W probówce do mikrocentryfugi połączyć 67 μl wody, 60 μl 100 mM buforu glicyna-HCl o pH 3.3 oraz 40 μl ATP w stężeniu 10 mg/ml w wodzie, a następnie wymieszać.
2. Do probówki dodać 33 μl monomeru kolagenu (~3 mg/ml w 0.01 N HCl) i wymieszać. Roztwór powinien być klarowny i bezbarwny.
3. Probówkę z mieszaniną reakcyjną pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 hr. Na tym etapie roztwór nadal będzie klarowny, ale powinien zawierać głównie kolagen SLS.

4. Charakterystyka AFM

1. Oddziel powierzchnię kawałka miki przytwierdzonego do podłoża AFM, naklejając na powierzchnię miki kawałek taśmy klejącej, a następnie odklejając ją. Po zakończeniu sprawdź taśmę, aby potwierdzić, że oddzielono całą warstwę miki w celu zredukowania nierówności powierzchni i upewnić się, że stara próbka została usunięta w przypadku ponownego wykorzystania miki.
2. Nanieś 20 μl roztworu włókien kolagenowych na świeżo oddzielone podłoże mikowe. Pozostaw na 5 min.
3. Delikatnie wypłucz roztwór włókien kolagenowych wodą. Zaleca się, aby nie aplikować wody bezpośrednio na środek podłoża mikowego, lecz na jego krawędź, pozwalając jej spłynąć przez próbkę.
4. Osusz powierzchnię pod łagodnym strumieniem gazu azotowego. Zaleca się skierowanie strumienia na krawędź, a nie na środek podłoża mikowego.
5. Pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 200× próbki kolagenu natywnego i FLS powinny wykazywać skupiska włókien. Kolagen SLS nie będzie widoczny.
6. Charakterystyczne cechy trzech różnych struktur kolagenu można obserwować za pomocą AFM. Zazwyczaj obrazujemy włókna kolagenu natywnego za pomocą AFM w trybie przerywanego kontaktu, wykorzystując krzemowe sondy AFM, natomiast włókna kolagenu FLS i SLS obrazujemy zazwyczaj w trybie kontaktu, wykorzystując sondy AFM z azotku krzemu. Wynika to z względów czasowych i kosztowych. Krzemowe sondy AFM są zazwyczaj ostrzejsze niż sondy z azotku krzemu, co czyni je szczególnie użytecznymi do obrazowania węższej struktury prążkowania włókien kolagenu natywnego. Jednak krzemowe sondy AFM są znacznie bardziej podatne na zanieczyszczenie próbkami kolagenu niż sondy z azotku krzemu i wymagają częstej wymiany. Dlatego zastrzegamy użycie krzemowych sond AFM głównie do obrazowania włókien kolagenu natywnego, gdzie wyższa rozdzielczość jest bardziej konieczna, i pracujemy w trybie przerywanego kontaktu, aby przedłużyć okres ich przydatności.

Zalecamy wykonanie wstępnego skanowania w obszarze 100 × 100 μm², co powinno ukazać co najmniej kilka struktur kolagenowych. Następnie należy zwiększyć powiększenie, wykonując skany o rozmiarach 10 × 10 μm², a potem 2 × 2 μm², aby zaobserwować okresowość prążkowania kolagenu natywnego i FLS lub drobniejsze cechy kolagenu SLS. Wskazane jest również sprawdzenie co najmniej dwóch innych obszarów w próbce kolagenu, aby potwierdzić, że wstępne skany są reprezentatywne.

Wyniki

Kolagen natywny

Mieszanina reakcyjna zawierająca ~0,3 mg/ml monomeru kolagenu w 100 mM fosforanie i 100 mM KCl przy pH 7, inkubowana w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny, pozwoli na otrzymanie roztworu zawierającego natywne fibryle kolagenu z wyraźnym prążkowaniem D o szerokości ~67 nm, bez obecności fibryli nieprążkowanych.

Pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 200× na podłożu z miki zazwyczaj widoczne są skupiska kilku fibryl, szczególnie w mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) (Rycina 2). W typowej próbce podczas skanowania AFM przypadkowego obszaru o wymiarach 100 × 100 μm² zwykle widocznych jest co najmniej kilka fibryl o długości od 5 do 50 mikronów (Ryciny 3a-c). Na tym etapie można łatwo zidentyfikować pojedyncze, odseparowane fibryle kolagenu. Przy skanowaniu obrazu o rozdzielczości 512 × 512 pikseli² powiększenie obszaru skanowania do 10 × 10 μm² pokazuje, że wszystkie fibryle są prążkowane (Ryciny 3d-f). Aby dokładnie zmierzyć okresowość prążkowania, najlepiej powiększyć obraz do obszaru skanowania 2 × 2 μm² (Ryciny 3g-i).

Okresowość prążkowania można wyznaczyć, mierząc i uśredniając odległość wzdłużną między kilkoma szczytami lub dolinami. Alternatywnie, jeżeli oprogramowanie AFM na to pozwala, można również zastosować jednowymiarową transformatę Fouriera wzdłuż przekroju podłużnego. Rysunek 4 przedstawia obraz wysokości fibry wykonany za pomocą AFM oraz odpowiadający mu przekrój podłużny.

Kolagen FLS

Mieszanina reakcyjna zawierająca 1 mg/ml glikoproteiny kwasowej μ1 oraz ~1 mg/ml monomeru kolagenu w wodzie, pozostawiona w temperaturze pokojowej na 30 min, utworzy roztwór włókienek kolagenowych FLS.

Kępki fibryli, podobne do tych obserwowanych w przypadku kolagenu natywnego, są łatwo widoczne na podłożu z miki pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 200×. W typowej próbce losowy skan AFM o rozmiarze 100 × 100 μm² zazwyczaj wykazuje co najmniej kilka fibryli. Przy rozmiarze skanu obrazu 512 × 512 pikseli², okresowość prążkowania można zmierzyć poprzez powiększenie skanu do 10 × 10 μm² (Rycina 5a) lub bardziej precyzyjnie za pomocą skanu 2 × 2 μm² (Rycina 5b). Rycina 5c przedstawia podłużny przekrój poprzeczny fibryli FLS.

Kollagen SLS

Mieszanina reakcyjna zawierająca 2 mg/ml ATP oraz ~0,5 mg/ml monomeru kolagenu w 100 mM buforze glicyna-HCl o pH 3,3, pozostawiona w temperaturze pokojowej na 2 h, pozwoli na otrzymanie roztworu kolagenu SLS.

Zazwyczaj krystality SLS nie są widoczne pod mikroskopem optycznym. Do potwierdzenia obecności krystalitów SLS wymagany jest AFM. W typowej próbce losowe skanowanie AFM obszaru 100 × 100 μm² zwykle wykazuje obecność wielu punktów. Powiększenie skanu do obszaru 10 × 10 μm² zazwyczaj ujawnia kilka krystalitów SLS (Rysunek 6a). Z kolei skan obszaru 2 × 2 μm² (Rysunek 6b) pokazuje drobniejszą strukturę krystalitu SLS.

Rycina 1. Trzy strukturalnie różne formy fibryli kolagenowych, które mogą zostać utworzone in vitro z monomeru kolagenu. Obrazy AFM przedstawiające monomer kolagenu oraz trzy struktury kolagenowe wyższego rzędu, wszystkie w tej samej skali (2 × 2 μm²).

Rycina 2. Cyfrowy obraz przy powiększeniu ~200× wykonany za pomocą optycznej mikroskopii DIC natywnych włókien kolagenowych na miki (a) w stanie nienaruszonym oraz (b) po zastosowaniu progowania i wyostrzenia w celu uwidocznienia włókien.

Rysunek 3. Obrazy AFM natywnych włókien kolagenowych na mice. Przedstawiono obrazy amplitudy AFM w trybie przerywanego kontaktu.

Rysunek 4. (a) Obraz wysokości AFM w trybie przerywanego kontaktu o obszarze 0,5 × 1 μm² (skala pionowa = 100 nm) oraz (b) podłużny przekrój natywnego włókna kolagenowego.

Rysunek 5. Obrazy AFM włókien kolagenowych FLS na miki. (a) obraz ugięcia AFM w trybie kontaktowym o rozmiarze 10 × 10 μm², (b) obraz ugięcia AFM w trybie kontaktowym o rozmiarze 2 × 2 μm² oraz (c) przekrój podłużny włókna kolagenowego FLS.

Rysunek 6. Obrazy AFM kolagenu SLS na miki. Przedstawiono obrazy amplitudy AFM w trybie przerywanego kontaktu.

Dyskusja

Oczyszczony monomer kolagenu jest stabilny przy niskim pH i temperaturze, a tworzenie natywnych włókien kolagenowych polega w zasadzie na podniesieniu pH i temperatury roztworu monomeru kolagenu. Procedury rekonstytucji prążkowanych włókien kolagenowych z monomerów istnieją od ponad 50 lat. Procedura, której nasze laboratorium używało w pierwszych badaniach nad kolagenem 15 lat temu ⁷, opierała się na metodach podsumowanych przez Chapmana i współpracowników w 1986 roku ¹⁰. Warunki tworzenia włókien kolagenowych w tamtych wcześniejszych badaniach obejmowały 0,18 mg/ml monomeru kolagenu w buforze Na₂HPO₄/KH₂PO₄ (I = 0,2, pH 7,4) w temperaturze 34 °C. Wadą tej oraz innych próbowanych przez nas procedur jest to, że obok pożądanych włókien prążkowanych zawsze tworzą się włókna nieprążkowane. Nasze nowe warunki to ~0,3 mg/ml monomeru kolagenu w 100 mM fosforanie i 100 mM KCl przy pH 7 i temperaturze 37 °C przez 3-4 h. Opisana tutaj procedura różni się pod każdym względem od wcześniejszej metody otrzymywania natywnych włókien kolagenowych. Co najważniejsze, podwoiliśmy siłę jonową, zwiększając stężenie buforu i dodając 100 mM KCl. Zwiększenie siły jonowej skutkuje bardziej powtarzalnym tworzeniem się wyłącznie prążkowanych włókien kolagenowych.

W naszym doświadczeniu jedynymi sytuacjami, w których ta procedura nie doprowadziła do powstania kolagenu typu natywnego, były przypadki, gdy termin przydatności roztworu monomeru kolagenu zalecany przez producenta już upłynął. W takich sytuacjach obserwowane zjawiska obejmowały zarówno mniejszą liczbę fibryli, z których wszystkie były pozbawione prążkowania, jak i liczne fibrylle, które jednak pozostawały w przeważającej mierze nieprążkowane. Należy zauważyć, że przeterminowany monomer kolagenu często wciąż może być z sukcesem wykorzystany do otrzymania kolagenu natywnego, jednak w przypadku niepowodzenia należy bezwzględnie zakupić nowy monomer kolagenu.

FLS zostały po raz pierwszy zidentyfikowane przez Highberger et al. ¹⁷ w preparatach kolagenowych opracowanych przez Orekhovich et al. ¹⁸. Dalsze badania doprowadziły Highbergera i Schmitta do wniosku, że to glikoproteina kwasowa α1 promuje tworzenie się FLS ¹². Później udało nam się powtórzyć procedurę otrzymywania kolagenu FLS poprzez połączenie dostępnego komercyjnie monomeru kolagenu i glikoproteiny kwasowej α1 przy niskim pH, a następnie powolne zwiększanie pH poprzez dializowanie mieszaniny przeciwko wodzie przez 24 hr ¹¹. Przedstawiamy obecnie modyfikację tej procedury, polegającą na uprzednim dializowaniu monomeru kolagenu przeciwko wodzie, a następnie prostym połączeniu go z glikoproteina kwasową α1 w wodzie w celu utworzenia kolagenu FLS. Warunki montażu kolagenu FLS opisane w niniejszym tekście są znacznie mniej czasochłonne. Monomer kolagenu nadal musi być wstępnie dializowany przeciwko wodzie, ale można to wykonać masowo, a następnie przechowywać go stabilnie w 4 °C do momentu użycia. Ta nowa procedura pozwala na otrzymanie przeważnie prążkowanych fibryli kolagenowych FLS.

Z naszego doświadczenia wynika, że α1-kwasowa glikoproteina o niższej łącznej zawartości białka i wody, a w konsekwencji wyższej zawartości cukrów, ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytwarzania fibryli FLS. Zazwyczaj weryfikujemy u producenta, czy partia α1-kwasowej glikoproteiny, której używamy, ma łączną zawartość białka i wody równą 82% lub mniej. Podobnie jak w procedurze syntezy kolagenu natywnego, zbyt stary monomer kolagenu może również doprowadzić do niepowodzenia w produkcji kolagenu FLS. Dodatkowo, w tej procedurze krytyczna jest czystość wody używanej do dializy. Na przykład dializa monomeru kolagenu przeciwko wodzie o oporności nawet ~8 MΩ.cm zamiast >18 MΩ.cm skutkuje otrzymaniem roztworu kolagenu, który nie uformuje kolagenu FLS.

Spośród trzech typów włókien kolagenowych najłatwiejszym do przygotowania jest kolagen SLS. Pierwszą metodę otrzymywania SLS opisali Schmitt i współpracownicy ¹⁵. Przed 12 laty opublikowaliśmy adaptację tej procedury pozwalającą na otrzymanie kolagenu SLS z wykorzystaniem kolagenu dostępnego w handlu ¹⁴. Procedura ta polegała po prostu na połączeniu 2 mg/ml ATP oraz 0,5 mg/ml monomeru kolagenu w 0,05% (v/v) kwasie octowym o pH 3,5 i pozostawieniu mieszaniny w temperaturze pokojowej przez noc.

W naszym doświadczeniu krytycznym aspektem montażu SLS, który musi być kontrolowany, jest pH roztworu reakcyjnego. SLS montowany w warunkach bardziej zasadowych (~pH 3,6-3,9) prowadzi do powstania zagregowanych skupisk krystalitów. Warunki bardziej kwasowe (~pH 2,9-3,2) skutkują powstaniem cieńszych i bardziej rozdzielonych krystalitów niż te montowane w idealnych warunkach pH 3,3-3,5. Wartości pH reakcji poza tym zakresem (< 2,8 oraz > 4) nie dają żadnego kolagenu SLS. W przeszłości korygowaliśmy pH mieszaniny reakcyjnej poprzez dodanie kwasu octowego. Aby jeszcze bardziej uprościć procedurę, w niniejszym artykule wprowadziliśmy bufor glicyna-HCl w celu kontroli pH.

Trzy różne struktury kolagenu utworzone zgodnie z opisanymi powyżej protokołami posiadają charakterystyczne cechy, które można rozpoznać jedynie za pomocą instrumentów o rozdzielczości nanometrowej. Kolagen natywny oraz kolagen FLS charakteryzują się okresowością prążkowania wynoszącą odpowiednio ~67 nm i ~270 nm. Największy wymiar kolagenu SLS wynosi zaledwie ~360 nm. Opisaliśmy szczegółowo sposób wykorzystania AFM do charakteryzacji tych trzech różnych struktur kolagenu. Niemniej jednak, każdy AFM pracujący w trybie kontaktowym lub przerywanym kontakcie z dowolną sondą AFM o promieniu <10 nm powinien być w stanie obrazować te struktury kolagenu. Dodatkowo do charakteryzacji tych struktur kolagenu można wykorzystać i wykorzystywano mikroskopię elektronową ¹⁹.

Główną zaletą tych procedur jest to, że prowadzą one do powstania przede wszystkim pożądanego konstruktu kolagenowego. Jedyną inną formą kolagenu występującą w tych reakcjach jest monomer wyjściowy, który często jest widoczny w tle obrazów AFM. W przypadku kolagenu natywnego oraz FLS, można go łatwo oddzielić od większości nieprzereagowanego monomeru poprzez wielokrotne odwirowywanie i przemywanie otrzymanego granulatu kolagenu natywnego lub FLS wodą.

Przedstawiliśmy proste i niezawodne procedury otrzymywania kolagenu natywnego, FLS oraz SLS z wykorzystaniem zaawansowanych, dostępnych komercyjnie materiałów wyjściowych. Monomer kolagenu użyty we wszystkich tych procedurach jest dostępny komercyjnie w formie oczyszczonej. α1-glikoproteina kwaśna oraz ATP są również dostępne w sprzedaży.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monomer kolagenu typu I (~3 mg/ml w 0,01 N HCl)	Inamed Advanced Biomatrix	5409 5005-B	Partia 1261443 (2,9 mg/ml, pH 2,1) Partia 1629346 (3,2 mg/ml, pH 2,1) Partia 6006 (3,2 mg/ml, pH 2,1)
ATP	Research Biochemicals International	A-141	Partia FBJ-1194A
α1-glikoproteina kwasowa z osocza bydlęcego	Sigma-Aldrich	G3643	Partia 051K7440 (89,8%) Partia 011K7410 (82%) Partia 065K7405 (71,2%) Partia 063K7495 (71,9%) Partia 117K7535 (75,9%) (zawartość białka + wody)
a1-glikoproteina kwasowa z osocza ludzkiego	Sigma-Aldrich	G9885	Partia 128H7606 (70,9%) Partia 049K7565V (68%) (zawartość białka + wody)
mika	Ted Pella	53
Pointprobe – krzemowy sensor SPM	Nanoworld	NHC	Krzemowa sonda AFM stosowana w trybie przerywanego kontaktu
Grotki Veeco Nanoprobe	Veeco (obecnie sondy Bruker AFM)	NP-S	Sonda AFM z azotku krzemu stosowana w trybie kontaktowym