Opisano eksperymentalną technikę leczenia uszkodzeń chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Implantacja autologicznych chondrocytów osadzonych na macierzy jest powszechnie akceptowaną metodą przebudowy i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej, zapewniającą satysfakcjonujące długoterminowe wyniki. Transplantacja autologicznych chondrocytów wspomagana macierzą (MACT) oferuje zstandaryzowaną i klinicznie uznaną metodę implantacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Uszkodzenia chrząstki stawowej są uważane za istotny problem zdrowotny, ponieważ chrząstka stawowa ma ograniczoną zdolność do samoregeneracji 1. Nieleczone zmiany chrząstki prowadzą do uporczywego bólu, negatywnie wpływają na jakość życia i predysponują do rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano kilka technik chirurgicznych do leczenia takich zmian. Jednak do tej pory nie udało się osiągnąć pełnej naprawy w zakresie pokrycia ubytku chrząstką stawową szklistą lub zapewnienia satysfakcjonującej długoterminowej regeneracji 2-4. W związku z tym urazy chrząstki stawowej pozostają głównym celem technik regeneracyjnych, takich jak inżynieria tkankowa. W przeciwieństwie do innych technik chirurgicznych, które często prowadzą do powstania tkanki włóknistej lub włóknisto-chrząstkowej, inżynieria tkankowa dąży do pełnego przywrócenia złożonej struktury i właściwości oryginalnej chrząstki stawowej poprzez wykorzystanie potencjału chondrogennego przeszczepionych komórek. Niedawne osiągnięcia otworzyły obiecujące możliwości w zakresie regeneracyjnych terapii chrząstki.
Pierwsze podejście oparte na komórkach w leczeniu pełnowarstwowych uszkodzeń chrząstki lub uszkodzeń osteochondralnych zostało przeprowadzone w 1994 roku przez Larsa Petersona i Matsa Brittberga, którzy zapoczątkowali kliniczną implantację autologicznych chondrocytów (ACI) 5. Obecnie technika ta jest dobrze ugruntowana klinicznie w leczeniu dużych ubytków chrząstki szklistej kolana, zapewniając dobre wyniki kliniczne nawet 10 do 20 lat po implantacji 6. W ostatnich latach implantacja autologicznych chondrocytów przeszła szybki rozwój. Coraz popularniejsze stało się wykorzystanie sztucznej trójwymiarowej macierzy kolagenowej, na której następnie replantowane są komórki 7-9.
MACT składa się z dwóch procedur chirurgicznych: Po pierwsze, w celu pobrania chondrocytów należy wykonać biopsję chrząstki z obszaru stawu kolanowego niepodlegającego obciążeniom. Następnie chondrocyty są ekstrahowane, oczyszczane i namnażane in vitro do uzyskania odpowiedniej liczby komórek. Chondrocyty są następnie wysiewane na macierz trójwymiarową, która może zostać później reimplantowana. Podczas przygotowywania implantu inżynierii tkankowej kluczowe dla skutecznej regeneracji tkanki są tempo proliferacji oraz zdolność do różnicowania 10. Uważa się, że zastosowanie macierzy trójwymiarowej jako nośnika komórek wspiera te charakterystyki komórkowe 11.
Poniższy protokół podsumowuje i demonstruje technikę izolacji chondrocytów z biopsji chrząstki, ich proliferację in vitro oraz ich wysiew na matrycę 3D (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Szwajcaria). Na koniec opisano implantację konstruktów komórka-matryca w sztucznie wytworzonych ubytkach chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Technika ta może być wykorzystana jako układ doświadczalny w dalszych badaniach nad regeneracją chrząstki.
Protokół
A. Biopsja chrząstki (sala operacyjna; kroki 1-5 w niesterylnym pomieszczeniu przygotowawczym)
- Przeprowadź końcową kontrolę masy ciała królika (królik nowozelandzki biały, samica, masa ciała 3,5-4,0 kg, wiek 6 miesięcy), aby umożliwić prawidłowe dawkowanie leków oraz monitorowanie masy ciała po operacji.
- Wprowadź królika w stan znieczulenia poprzez dożylny wtrysk 10 mg/kg propofolu.
- Po intubacji utrzymuj znieczulenie dożylnie za pomocą 1,5 mg/kg/min propofolu i 0,05 mg/kg fentanylu. Monitoruj znieczulenie, korzystając z kapnografii, pulsoksymetrii oraz pomiaru tętna.
- Ogól kolano, które ma zostać poddane operacji, za pomocą trymera elektrycznego i odessij sierść odkurzaczem.
- Dokładnie zdezynfekuj ogolone kolano i przykryj resztę ciała królika jałowym opatrunkiem.
- Zmierz palcami rzepkę i wykonaj nacięcie skóry po stronie przyśrodkowej rzepki.
- Otwórz staw kolanowy poprzez przyśrodkową artrotomię oko-rzepkową w warunkach sterylnych. Staraj się uniknąć przecięcia małych powierzchownych naczyń krwionośnych.
- Przemieść rzepkę bocznie.
- Obejrzyj staw kolanowy pod kątem ewentualnych anomalii i makroskopowych uszkodzeń chrząstki.
- Ostrożnie wyciąć małe fragmenty chrząstki (2-3 mm) z bloczka kości udowej za pomocą jałowego skalpela (Rysunek 1).
- Natychmiast umieść pobrane biopsje chrząstki w probówce 50 ml z pełną pożywką (DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep)), aby kontynuować hodowlę in vitro bezpośrednio po operacji.
- Oczyść ubytki i przepłucz je jałową solą fizjologiczną.
- Przywróć rzepkę do położenia w bruździe bloczka.
- Zamknij ranę warstwowo za pomocą pojedynczych szwów węzełkowych (4-0 Vicryl) i ciągłego szwu skórnego (4-0 Monocryl). Użyj wchłanialnego materiału szewnego.
- Na koniec zabezpiecz ranę przepuszczalnym dla pary wodnej opatrunkiem w sprayu.
B. Hodowla in vitro
- Przetworzyć pobrane fragmenty chrząstki biopsyjnej tak szybko, jak to możliwe po operacji, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek.
- Przemyć sterylną, pobraną chrząstkę 2x w PBS, a następnie odwirować przy 500 x g przez 3 min w RT.
- Pokroić chrząstkę na fragmenty o objętości 1 mm3, przenieść do probówki Falcon 50 ml i trawić na wytrząsarce przez 30 min w 10 ml trypsyny-EDTA (0,25%) i 10 ml PBS przez 30 min.
- Po 30 min przerwać trypsynizację poprzez dodanie pożywki kompletnej. Następnie inkubować fragmenty chrząstki na wytrząsarce przez kolejne 12 hr z kolagenazą A (0,21 U/mg) w pożywce bezsurowiczej (DMEM + 1% Pen/Strep).
- Odwirować otrzymany roztwór przy 170 x g przez 3 min w RT.
- Resuspendować osad komórkowy w 5 ml pożywki kompletnej.
- Zasiać wyizolowane chondrocyty do kolb do hodowli tkanek o powierzchni 25 cm2 w 5 ml pożywki kompletnej i inkubować w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.
- Hodować chondrocyty do osiągnięcia gęstości 80%.
- Uwolnić komórki z kolb, przemywając je 2x w PBS, a następnie poddać działaniu 0,05% trypsyny-EDTA przez 3 min. Po odczepieniu się chondrocytów przerwać trypsynizację poprzez dodanie 10 μl pożywki kompletnej.
- Odwirować zawiesinę przy 300 x g (3 min) i resuspendować osad w pożywce kompletnej.
- Zasiać komórki w kolbach do hodowli tkanek (75 cm2) i pasażować w stosunku 1:3 (∼5 000 komórek/cm2) co 5ty dzień lub po osiągnięciu 80% konfluencji.
- Określić liczbę i żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
C. Zasiewanie komórek na matrycy
- Przed implantacją wypłukać i uwolnić komórki zgodnie z powyższym opisem. Przeprowadzić zliczanie komórek i przenieść 5 x 104 komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie wirować przy 500 x g przez 5 min w RT.
- Resuspendować osad w 15 μl pożywki kompletnej, aby uzyskać pełne nasycenie matrycy.
- Wyciąć dwuwarstwowy rusztowanie kolagenowe o wymiarach dokładnie odpowiadających defektowi bloczka przy użyciu sterylnego wycinaka do biopsji.
- Umieścić matrycę w naczyniu do hodowli tkankowej o odpowiednim rozmiarze (np. płytkach 24-dołkowych).
- Zasiać komórki na porowatej, adhezyjnej stronie matrycy. Zapobiega to migracji komórek poza obszar matrycy.
- Pozostawić zasiane komórkami matryce bez dodatkowej pożywki hodowlanej w inkubatorze przez 1 hr, aby umożliwić pełną adhezję chondrocytów.
- Następnie umieścić konstrukty komórka-matryca w naczyniach hodowlanych (np. płytkach 24-dołkowych) ze świeżą pożywką kompletną. Należy uważać, aby nie wypłukać komórek z matrycy, mimo oczekiwanej silnej adhezji.
- Obecnie konstrukty komórka-matryca mogą zostać przeniesione do sali operacyjnej w celu reimplantacji.
D. Autologiczna transplantacja chondrocytów wspomagana macierzą
- Wykonaj artrotomię parapatelarną kolana przeciwległego zgodnie z powyższym opisem (A. 1-8).
- Utwórz dwa odizolowane defekty chrzęstne w bruździe międzykłykciowej za pomocą sterylnego pneumatycznego wiertła chirurgicznego (o średnicy 3,6 mm).
- Oczyść defekt i wypłucz sterylną solą fizjologiczną.
- Należy zwrócić uwagę, aby w żadnym momencie nie otworzyć jamy szpiku. W razie potrzeby dno defektów należy zabezpieczyć za pomocą elektrokoagulacji przeciwkrwawiennej.
- Zaimplantuj macierze zasiane hodowlą chondrocytów stroną porowatą do dołu (Rysunek 2). Następnie wprowadź je do otworów wiertniczych metodą press-fit i wyrównaj z powierzchnią otaczającą.
- Uszczelnij zaimplantowane macierze niewielką ilością kleju fibrynowego (Tissucol Duo S), aby zapewnić stabilną fiksację.
- Po skrzepnięciu przywróć rzepkę do bruzdy międzykłykciowej i kilkukrotnie wykonaj pełny zakres ruchu stawu kolanowego.
- Ponownie przemieść rzepkę bocznie i sprawdź, czy nie występuje żadne zdarzenie lub oznaka niestabilnej fiksacji. Macierze muszą pozostać nieruchomo na swoim miejscu.
- Ponownie przywróć rzepkę na miejsce i zakończ operację warstwowym zamknięciem rany oraz nałożeniem opatrunku w sprayu zgodnie z powyższym opisem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisana technika chirurgiczna umożliwia skuteczną izolację i implantację autologicznych chondrocytów w sztucznym defekcie chrząstki. Układ doświadczalny doprowadził do pomyślnej integracji implantu z otaczającą chrząstką.
Po 12 tygodniach in vivo ubytek chrzestny został wypełniony tkanką naprawczą o jednorodnej i nienaruszonej powierzchni, co zredukowało naprężenia ścinające i uszkodzenia implantu (Rycina 4). Ponadto nie zaobserwowano hipertrofii ani zwapnienia implan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony protokół opisuje uznaną 9,12,13 i łatwo powtarzalną technikę izolacji autologicznych chondrocytów w celu ich późniejszej proliferacji i reimplantacji do sztucznie wywołanych ubytków chrząstki w kolanach królików. Wykorzystanie autologicznych chondrocytów do remodelingu i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej znajduje już zastosowanie w praktyce klinicznej, zapewniając satysfakcjonujące wyniki długoterminowe 6.
Poważne problemy, takie jak np. przerost okostnej...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Projekt ten był finansowany przez Niemiecką Agencję Badawczą (DFG, HE 4578/3-1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nazwa odczynnika/sprzętu | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Kolagenaza A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Płodowa surowica bydlęca (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicylina/Streptomycyna | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Etanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsyna-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | w PBS bez Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| Roztwór NaCl (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Szalki do hodowli tkankowych 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Powierzchnia wzrostu 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Kolby do hodowli tkankowych 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Probówki do wirówki (50 ml) | TPP AG | 91050 | Sterylizowane gamma |
| Hemocytometr | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauera |
| Roztwór błękitu trypanu 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Opatrunek w sprayu (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Przepuszczalny dla pary wodnej |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Wycinak do biopsji | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
Bibliografia
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
