Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

17.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4423

⸱

21 maja 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Streszczenie

Leczenie ubytków kostno-chrzęstnych w stawach stanowi od wielu lat wyzwanie dla lekarzy. Lepsze zrozumienie interakcji między chrząstką stawową a kością podchrzęstną w ostatnich latach doprowadziło do zwiększenia uwagi poświęcanej regeneracji całej jednostki kostno-chrzęstnej. W porównaniu z uszkodzeniami chrzęstnymi, regeneracja ubytków kostno-chrzęstnych jest znacznie bardziej złożona i stanowi znacznie większe wyzwanie chirurgiczne i terapeutyczne. Uszkodzona tkanka obejmuje nie tylko powierzchowną warstwę chrząstki, ale również kość podchrzęstną. W przypadku głębokich uszkodzeń kostno-chrzęstnych, takich jak np. w przebiegu osteochondrosis dissecans, konieczna jest rekonstrukcja pełnej grubości ubytku w celu przywrócenia powierzchni stawowej ¹. Odpowiednie procedury terapeutyczne muszą uwzględniać te dwie różne tkanki o odmiennym wewnętrznym potencjale gojenia ². W ostatnich dekadach pojawiło się kilka opcji chirurgicznego leczenia, które zostały już wprowadzone do praktyki klinicznej ^3-6.

Autologiczne lub allogeniczne przeszczepy kostno-chrzęstne składają się z chrząstki stawowej i kości podchrzęstnej, umożliwiając zastąpienie całej jednostki kostno-chrzęstnej. Ubytki wypełnia się cylindrycznymi graftami kostno-chrzęstnymi, których celem jest zapewnienie powierzchni pokrytej zgodną chrząstką szklistą ^3,7,8. Do wad tej metody należą: ograniczona ilość dostępnych graftów, zachorowalność w miejscu pobrania (w przypadku przeszczepów autologicznych) oraz niezgodność powierzchni; w związku z czym zastosowanie tej metody jest szczególnie ograniczone w przypadku dużych ubytków.

Nowe podejścia w dziedzinie inżynierii tkankowej otworzyły obiecujące możliwości dla regeneracyjnej terapii osteochondralnej. Implantacja autologicznych chondrocytów stanowiła pierwsze biologiczne podejście oparte na komórkach w leczeniu pełnowarstwowych uszkodzeń chrząstki i jest obecnie stosowane na całym świecie, przynosząc dobre wyniki kliniczne nawet 10 do 20 lat po implantacji ^9,10. Jednak do dziś technika ta nie nadaje się do leczenia wszystkich rodzajów uszkodzeń, takich jak głębokie defekty obejmujące kość podchrzęstną ¹¹.

technika kanapkowa (sandwich-technique) łączy przeszczepianie kości z aktualnymi podejściami w inżynierii tkankowej ^5,6. Kombinacja ta wydaje się pozwalać na przezwyciężenie ograniczeń obserwowanych w przypadku samych przeszczepów kostno-chrzęstnych. Po autologicznym przeszczepieniu kości w obszar ubytku podchrzęstnego, powyżej przyszywa się membranę zasiedloną autologicznymi chondrocytami, co ułatwia dopasowanie topografii przeszczepu do miejsca uszkodzenia. Oczywiście, wcześniejsza rekonstrukcja kostna wymaga dodatkowego czasu operacyjnego, a często nawet dodatkowego zabiegu chirurgicznego. Ponadto do chwili obec stanu brakuje danych długoterminowych ¹².

Inżynieria tkankowa bez dodatowego przeszczepu kostnego ma na celu przywrócenie złożonej struktury i właściwości natywnej chrząstki stawowej poprzez potencjał chondrogenny i osteogenny przeszczepionych komórek. Jednakże, ponownie, zazwyczaj regeneracji ulega w większym lub mniejszym stopniu jedynie tkanka chrzęstna. Dodatkowe uszkodzenia kostno-chrzęstne wymagają specyficznego, dalszego leczenia. Aby osiągnąć regenerację wielowarstwowej struktury ubytków kostno-chrzęstnych, trójwymiarowe produkty inżynierii tkankowej zasiane komórkami autologicznymi/allogenicznymi mogą zapewnić dobrą zdolność regeneracyjną ¹¹.

Oprócz autologicznych chondrocytów, mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wydają się być atrakcyjną alternatywą dla rozwoju pełnowarstwowej tkanki chrzęstnej. W licznych badaniach przedklinicznych in vitro i in vivo mezenchymalne komórki macierzyste wykazały doskonały potencjał regeneracji tkanek ^13,14. Istotną zaletą mezenchymalnych komórek macierzystych, szczególnie w leczeniu ubytków kostno-chrzęstnych, jest ich zdolność do różnicowania się zarówno w osteocyty, jak i chondrocyty. Dzięki temu potencjalnie umożliwiają one wielowarstwową regenerację ubytku.

W ostatnich latach opracowano i oceniono zatem kilka rusztowań o potencjale regeneracyjnym w obszarze osteochondralnym, uzyskując obiecujące wstępne wyniki ^1,15-18. Ponadto klej fibrynowy jako nośnik komórek stał się jedną z preferowanych technik w eksperymentalnej naprawie chrząstki i został już z sukcesem zastosowany w kilku badaniach na zwierzętach ^19-21, a nawet w pierwszych próbach klinicznych u ludzi ²².

Poniższy protokół zaprezentuje technikę eksperymentalną izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z szpiku kostnego królika, w celu ich późniejszej proliferacji w hodowli komórkowej oraz przygotowania standaryzowanego modelu in vitro skrzepów fibrynowo-komórkowych. Na koniec opisana zostanie technika implantacji wcześniej przygotowanych skrzepów fibrynowo-komórkowych do sztucznych ubytków osteochondralnych w stawie kolanowym królika.

Protokół

A. Przygotowanie królika dawcy do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych (sala operacyjna)

Komórki są izolowane od samców królików nowozelandzkich białych (NZW) w wieku 4 miesięcy i przy masie ciała około 3 kg.
Indukować znieczulenie propofolem (10 mg/kg masy ciała i.v.) i uśmiercić zwierzę za pomocą pentobarbitalu sodowego (100 mg/kg masy ciała i.v.).
Wygolić sierść z kończyn tylnych, grzbietu i brzucha za pomocą maszynki elektrycznej, a następnie odessać sierść odkurzaczem.
Dokładnie zdezynfekować wygolony obszar 70% etanolem.
Do usuwania tkanek i więzadeł używać pęsety tępodannej, ostrych nożyczek (lub skalpela) oraz kleszczy do kości.
Wyonać nacięcie wzdłuż powierzchni kranialnej nogi i łydki.
Odsunąć skórę i tkankę podskórną za pomocą rozdzielania ostrego lub tępego.
Oddzielić mięśnie i więzadła od kości piszczelowej i udowej. Wykonywać cięcia jak najbliżej kości, aby uzyskać czystą sekcję. Na tym etapie nie oddzielać kości udowej od piszczelowej.
Przeciąć staw biodrowy, aby oddzielić głowę kości udowej od panewki.
Unieść kompleks piszczelowo-udowy.
Użyć ostrza skalpela, aby zeskrobać pozostałą tkankę miękką z kości lub przetrzeć kości sterylnymi chusteczkami. Na tym etapie kość udowa i piszczelowa są nadal połączone.
Usunąć rzepkę poprzez przecięcie, a następnie przeciąć więzadła stawu kolanowego, aby ostatecznie oddzielić kości.
Spryskać oddzielone kości 70% etanolem, pozostawić do wyschnięcia, a następnie umieścić każdą kość w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z pożywką do hodowli komórkowych (DMEM + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep)), aby utrzymać ich wilgotność.
Przenieść pracę pod sterylną dygestorową komorę z laminarnym przepływem powietrza do hodowli komórkowych.

B. Wypłukiwanie MSC królika z kości i ich namnażanie (dygestorium do hodowli komórek)

Wyjąć kości z probówek i umieścić je w szalkach 150 mm za pomocą sterylnej pęsety.
Odciąć oba końce kości sterylną piłą i przenieść fragmenty do nowych szalek 150 mm.
Napełnić strzykawkę 10 ml pożywką (DMEM), przymocować igłę G18 i wprowadzić ją do otworu szpiku kostnego.
Następnie wypłukać jamę szpikową pożywką, aby wypłukać szpik kostny do szalki. Potem wypłukać z drugiego końca, jeśli jest to możliwe. W razie potrzeby odciąć więcej z końców. Jeśli kość pęknie, wypłukać jedynie wnętrze kości.
Zaspirować zawiesinę komórek w pożywce do strzykawki i wielokrotnie płukać szpik kostny, aż zawiesina będzie swobodnie przepływać przez jamę szpikową i nie będą pojawiać się kolejne skrzepy szpiku.
Po zebraniu szpiku kostnego ze wszystkich kości, rozbić grudki szpiku, przepuszczając je przez igłę G18: napełnić strzykawkę z przymocowaną igłą i wtłoczyć zawiesinę do pożywki.
Następnie przefiltrować zawiesinę przez filtr komórkowy do probówki 50 ml. Aby zapobiec utracie komórek, wypłukać szalkę hodowlaną 2x 10 ml pożywki i również przefiltrować.
Wirować zawiesinę przy 500 x g przez 5 min w RT.
Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 10 ml pożywki (DMEM + 1% Pen/Strep).
Oddzielić komórki krwi od mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) i mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) przy użyciu roztworu separacyjnego Biocoll.
Nalać 5 ml roztworu separacyjnego Biocoll do probówki 15 ml, ostrożnie nanieść na wierzch 5 ml zawiesiny komórkowej i wirować przy 800 x g przez 20 min w RT (bez hamowania).
Możliwe wyniki przedstawiono na Rysunku 1: Ze względu na większą gęstość niż Biocoll, erytrocyty osiadają na dnie, podczas gdy PBMC i mezenchymalne komórki macierzyste pozostają na granicy faz.
Ostrożnie pobrać frakcję z granicy faz do probówki 15 ml i wypłukać 5 ml PBS.
Wirować zgodnie z opisem w kroku 22, resuspendować w 5 ml PBS i powtórzyć 2-3x.
Następnie ponownie wirować przy 350 x g przez 10 min w RT (z hamowaniem).
Resuspendować w 10 ml pożywki i policzyć komórki w hemocytometrze.
Wysiać komórki w szalkach 150 mm z początkową gęstością zasiewu około 5 x 10⁶.
Po 2-3 dniach usunąć komórki nieprzywierające. Może być konieczne uprzednie wypłukanie PBS w celu usunięcia szczątków komórkowych. Następnie dodać świeżą pełną pożywkę (DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1% Pen/Strep).
Dokarmiać komórki co 3-4 dni (Rysunek 2).
Po 5-10 dniach przeprowadzić pierwsze pasażowanie komórek.

C. Przygotowanie skrzepów fibrynowych in vitro

W dniu implantacji uwolnić komórki adherentne z kolb/naczyń poprzez 3 min ekspozycji na 0,25% trypsyny-EDTA. Przerwać proces trypsynizacji poprzez dodanie pożywki kompletnej.
Przenieść komórki do probówki Falcon o pojemności 50 ml i dwukrotnie przemyć je PBS.
Określić żywotność i liczbę komórek za pomocą barwienia błęknitem trypanowym.
Przenieść 50 000 komórek do każdej probówki do mikrocentryfugi i zebrać osad poprzez wirowanie przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przygotować mastermix dla co najmniej jednego dodatkowego skrzepu w razie potrzeby.
Resuspendować osad komórkowy w 17 μl PBS i zmieszać 25 μl komponentu fibrynogenu z zestawu TISSUCOL-Kit z tą 17 μl zawiesiną MSC.
Przygotować sterylną płytkę z nawierconymi otworami (3x3,6 mm) zgodnymi z otworami wierconymi in vivo (Rysunek 3).
Najpierw wprowadzić 4 μl roztworu trombiny (500 IU/ml) do jednego otworu, a następnie niezwłocznie dodać 42 μl zawiesiny fibrynogenu z komórkami i ponownie 4 μl roztworu trombiny na wierzch. Nie mieszać zawiesiny, aby uniknąć krzepnięcia w końcówce pipety. Początkowo objętość 50 μl naniesionej zawiesiny fibrynogenu z komórkami będzie wystawać ponad krawędź nawierconych otworów, nie rozlewając się dzięki napięciu powierzchniowemu. Jednak po całkowitym skrzepnięciu (po 60 min) skrzep kurczy się i dopasowuje do nawierconego otworu.
Ostrożnie wyjąć skrzep za pomocą pęsety tępokrawędznej i umieścić go w probówce do mikrocentryfugi z PBS. Przygotować 2 skrzepy na zwierzę.
Przenieść skrzepy do sali operacyjnej.

D. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Wprowadzić króliczka (NZW, samiec, masa ciała 3,5-4,0 kg, wiek 5-6 miesięcy) w stan znieczulenia poprzez dożylną iniekcję propofolu (10 mg/kg masy ciała).
Ogolić kolano, które ma zostać poddane operacji, za pomocą trymera elektrycznego i odessać sierść. Wszystkie wyżej wymienione procedury wykonuje się w pomieszczeniu przygotowawczym do zabiegów, aby uniknąć zanieczyszczenia sterylnego środowiska sali operacyjnej.
Po intubacji podtrzymać znieczulenie, podając dożylnie propofol w dawce 1,5 mg/kg/min oraz fentanyl w dawce 0,05 mg/kg/min. Monitorować znieczulenie za pomocą kapnografii, pulsoksymetrii i pomiaru tętna.
Dokładnie zdezynfekować ogolone kolano i przykryć resztę ciała królika sterylnym opatrunkiem.
Zbadać rzepkę palpacyjnie i wykonać nacięcie skóry po stronie przyśrodkowej rzepki.
Otworzyć staw kolanowy poprzez przyśrodkową artrotomię oko rzepkową w warunkach sterylnych. Należy starać się nie przeciąć żadnych małych powierzchownych naczyń krwionośnych.
Przesunąć rzepkę bocznie (Rycina 4).
Po zbadaniu stawu kolanowego pod kątem współistniejących uszkodzeń chrząstki lub anomalii stawowych, utworzyć dwa defekty osteochondralne (o głębokości 3 mm, w kształcie ósemki) w bruździe kości bloczkowej za pomocą sterylnej pneumatycznej wiertarki chirurgicznej (o średnicy 3,6 mm) z ogranicznikiem głębokości (Rycina 5).
Oczyścić defekty i wypłukać je sterylną solą fizjologiczną.
Przed implantacją wprowadzić 20 μl kleju fibrynowego do defektów i rozprowadzić go równomiernie na dnie ubytku.
Następnie zaimplantować skrzepy, dopasowując je ciasno do defektów w kształcie ósemki.
Po skrzepnięciu przywrócić rzepkę do bruzdy kości bloczkowej oraz kilka razy zgjąć i wyprostować kolano.
Ponownie przesunąć rzepkę bocznie i sprawdzić, czy skrzepy z fibrynogenu i komórek nadal znajdują się na miejscu.
Ponownie przywrócić rzepkę i zakończyć operację poprzez warstwowe zamknięcie rany za pomocą pojedynczych szwów węzełkowych (4-0 Vicryl) oraz ciągłego szwu skórnego (4-0 Monocryl) (w obu przypadkach zastosowano wchłanialny materiał szewny).
Na koniec zabezpieczyć ranę sprayem opatrunkowym przepuszczalnym dla pary wodnej.
W ramach opieki pooperacyjnej ranę sprawdza się codziennie przez 7 dni. W celu przeciwbólowego leczenia pooperacyjnego króliki otrzymują Karprofen 4 mg/kg s.c. co 24 h (przez 4 dni) oraz Buprenorfinę 0,03 mg/kg s.c. co 12 h (przez 2,5 dnia). Stabilizacja kolana (np. opatrunek) nie jest konieczna.