Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie dynamiki zachowania komórek in vivo w ciągu sekwencji rozwojowej może być potężną techniką pozwalającą zrozumieć mechanizmy wzorowania tkanek. Podczas rozwoju zwierząt kluczowe zdarzenia proliferacji i wzorowania komórek zachodzą bardzo szybko. Na przykład u Caenorhabditis elegans wszystkie podziały komórkowe niezbędne do ukształtowania planu budowy ciała larwy kończą się w ciągu sześciu godzin po zapłodnieniu, obejmując siedem cykli mitotycznych1; szesnaście lub więcej mitoz podczas embriogenezy Drosophila zachodzi w czasie krótszym niż 24 hr2. W przeciwieństwie do tego, podziały komórkowe podczas rozwoju roślin są powolne, zazwyczaj w skali jednego dnia 3,4,5. Stwarza to wyjątkowe wyzwanie i rodzi potrzebę długoterminowego obrazowania żywych tkanek w celu dokumentowania dynamicznych procesów podziału komórek oraz zdarzeń różnicowania podczas organogenezy roślin. Epidermis Arabidopsis jest doskonałym systemem modelowym do badania sygnalizacji, losu komórek i rozwoju roślin. W kotyledonie tkanka ta składa się z odpornych na działanie powietrza i wody komórek bruzdowych, pomiędzy którymi rozmieszczone są równomiernie aparaty szparkowe – zawory otwierające się i zamykające w celu kontroli wymiany gazowej i utraty wody. Odpowiednie rozmieszczenie tych aparatów szparkowych jest krytyczne dla ich funkcji, a ich rozwój przebiega zgodnie z sekwencją asymetrycznych podziałów i etapów różnicowania komórkowego, co prowadzi do powstania zorganizowanej epidermy (Rys. 1).
Niniejszy protokół umożliwia obserwację komórek i białek w epidermie podczas kilku dni rozwoju. Taki przedział czasowy pozwala na precyzyjną dokumentację podziałów komórek macierzystych oraz różnicowania komórek epidermy, w tym aparatów szparkowych i komórek epidermy typu pavement. Białka fluorescencyjne mogą być fuzowane z białkami zainteresowania w celu oceny ich dynamiki podczas procesów podziału i różnicowania komórek. Technika ta pozwala zrozumieć lokalizację nowego białka, POLAR6, podczas etapu proliferacji komórek linii szparkowej w epidermie liści zakrotniowych Arabidopsis, gdzie jest ono ekspresowane w komórkach poprzedzających zdarzenia podziałów asymetrycznych i przemieszcza się do charakterystycznego obszaru kory komórkowej krótko przed wystąpieniem podziału. Obrazy mogą być rejestrowane, a z nich łatwo tworzone płynne filmy przy użyciu oprogramowania z domeny publicznej, co pozwala na wizualizację dynamicznej lokalizacji białek oraz typów komórek zmieniających się w czasie.
Protokół
1. Sterylizacja nasion
- Przygotować roztwór do sterylizacji nasion: 33% wybielacz domowy, 0,1% Triton X-100.
- Nasiona posiadające pożądane konstrukty reporterów fluorescencyjnych i genotypy umieścić w probówce 1,7 ml i dodać 1 ml roztworu sterylizującego. Inkubować na nutatorze przez 15 min.
- W sterylnej komorze przepływu laminarnego za pomocą pipety usunąć roztwór sterylizujący z probówki, pozostawiając nasiona. Przepłukać 1 ml sterylnej wody. Powtórzyć czynność cztery razy.
- Inkubować w temperaturze 4 °C przez dwa dni lub dłużej.
2. Przygotowanie podłoży do szkiełek z komorkami
- W kolbie o pojemności 200 ml wymieszać 20 ml 0,5% roztworu Bacto Agar (nie czystej agarozy) w wodzie i podgrzewać w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia. Należy zachować ostrożność podczas wrzenia roztworu.
- Ostudzić roztwór do temperatury około 60 °C.
- Za pomocą pipety pobrać 1 ml roztworu agaru i powoli nanieść na szkiełko podstawowe wewnątrz komory preparatu (Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System). Zbyt gorący roztwór lub zbyt szybkie nanoszenie może doprowadzić do stopienia kleju lub pęknięcia szkła.
- Natychmiast dodać drugi 1 ml roztworu agaru. Pożywka agarowa powinna teraz całkowicie pokrywać dno komory preparatu. Taka minimalna ilość pożywki jest wystarczająca, aby przez cztery do pięciu dni wspierać rozwój w liścieniu rośliny, który zawiera zgromadzone składniki odżywcze, poprzez utrzymanie wilgotności i umożliwienie dyfuzji gazów.
- Ostudzić preparat na blacie laboratoryjnym z przykrytą komorą. Jeśli kolba jest szczelnie zamknięta, roztwór można przechować i ponownie podgrzać do przyszłego użycia.
3. Disekcja nasion
- Wyjmij probówkę ze sterylnymi nasionami z przechowywania w temperaturze 4 °C.
- Umieść chusteczkę papierową na stole mikroskopu stereoskopowego i zwilż ją wodą. Wygładź chusteczkę, aby stworzyć równą powierzchnię. Chusteczka służy do stabilizacji nasion podczas dysekcji.
- Przenieś pipetą 20-30 nasion z probówki na chusteczkę, dbając o to, aby znajdowały się w polu widzenia mikroskopu.
- Używając ostrych pincet (Roboz, końcówka biologiczna nr 5), ostrożnie usuń łupinę nasienną z znajdującego się wewnątrz zawiązka. Należy usunąć zarówno zewnętrzną, jak i wewnętrzną łupinę.
- Podczas obrazowania liści zasiedlinnych korzystne jest usunięcie podliścienia i korzenia zakiełkowego. Liście zasiedlinne zawierają wystarczającą ilość składników odżywczych, aby rozwijać się przez kilka dni zgodnie z tym protokołem. Jeśli pozostanie nienaruszone, podliścień gwałtownie wyprostuje się i wydłuży, przesuwając liść zasiedlinowy poza pole widzenia podczas rejestracji time-lapse. Użyj skalpela, aby oddzielić liście zasiedlinne od podliścienia.
- Przechowuj zdyssekowane liście zasiedlinne zanurzone w wodzie, w mikroprobówce lub podobnym naczyniu.
- Powtarzaj kroki 3.4-3.6, aż do uzyskania żądanej liczby liści zasiedlinnych. Przed montażem zaleca się wykonanie 15-20 udanych dysekcji.
4. Montowanie liści zasiedlonych w szkiełku komorowym
- Używając małego szkiełka nakrywkowego (18 mm2), przetnij podłoże agarowe i unieś całą warstwę znad szklanej podstawy preparatu z komorą.
- Przenieś pipetą wypreparowane liścienie z minimalną ilością wody z probówki transportowej do preparatu z komorą, pod uniesioną warstwę agaru.
- Ostrożnie opuść agar na liścienie. Jeśli pojawi się nadmiar wody, odsącz go chusteczką, uważając, aby nie przesunąć liścieni. Po zakończeniu montażu preparaty nie powinny się już łatwo przemieszczać.
- Nałóż pokrywkę na preparat z komorą i przenieś go na stolik mikroskopu.
5. Obrazowanie poklatkowe
- Przygotować odwrócony mikroskop konfokalny do obrazowania wybranych fluoroforów. Parametry LSM700: dla GFP wzbudzenie przy 488 nm i detekcja z filtrem pasmowym 440-530 nm; dla RFP wzbudzenie przy 555 nm i detekcja z filtrem pasmowym 570-610 nm.
- Obejrzeć zamocowane preparaty pod kątem uszkodzeń. Zaprogramować lokalizacje nienaruszonych, prawidłowo zamocowanych liści zaszyłych w oprogramowaniu mikroskopu. W programie Zen 2009: ustawić ostrość na liściu zaszyłym przy użyciu obiektywu 20x i przesunąć obiektyw do centrum szkiełka komory. W sekcji Acquisition Mode zmienić Zoom na 0,5 oraz Frame Size na 48x48 pikseli. Zaznaczyć pole wyboru Positions i kliknąć przycisk Scan overview image... w sekcji Positions, a następnie zwiększyć liczbę kafelków Horizontal oraz Vertical do 30-35. Po zakończeniu skanowania kliknąć przycisk Positions w zakładce Dimensions i umieścić celowniki na każdym liściu zaszyłym przeznaczonym do obserwacji.
- Przygotować serie z obejmujące epidermę liści zaszyłych we wszystkich próbkach. W programie Zen 2009: zaznaczyć pole wyboru Z-Stack. Wybrać każdą pozycję w sekcji Position List i kliknąć przycisk Move to. Ustawić ostrość na najwyższej płaszczyźnie epidermy liścia zaszyłego i kliknąć przycisk Set First w sekcji Z-Stack. Ustawić ostrość na najniższej pozycji, przy której epidermis jest jeszcze użytecznie widoczna, i kliknąć przycisk Set Last. Kliknąć przycisk obok napisu Optimal, który wskazuje optymalną grubość plastra z, aby go ustawić. Sprawdzić każdy liść zaszyły, aby potwierdzić, że ustawienia te obejmują wszystkie próbki; parametry z nie mogą być ustawiane dla poszczególnych pozycji w programie Zen 2009.
- Przygotować serie czasowe o żądanej rozdzielczości i długości. Przedziały 15-30 min przez trzy dni są skuteczne dla dynamiki białek podczas podziału komórek epidermy. Przedział ten można zmieniać w zależności od potrzeb. W programie Zen 2009: zaznaczyć pole wyboru Time Series. W sekcji Time Series ustawić liczbę pożądanych obrazów w polu Cycles, korzystając z suwaka lub wpisując wartość w polu tekstowym. Ustawić Interval na 30 i wybrać z menu rozwijanego jednostkę min.
- Rozpocząć wielopozycyjne skanowanie xyzt. Należy pamiętać, że liczba pozycji musi być ograniczona specyfikacją skanowania; jeśli całkowity czas skanowania przekroczy pożądany interwał, punkty czasowe będą nieprawidłowe. W naszym systemie przy obrazowaniu GFP i RFP dla 59 plastrów z w interwale 30-min można obrazować maksymalnie sześć pozycji jednocześnie. W programie Zen 2009: zmienić Frame Size na pożądaną rozdzielczość i kliknąć Start Experiment.
6. Montaż wideo
- Z pliku z danymi konfokalnymi wykonaj projekcję maksymalnej intensywności wzdłuż osi z dla każdej kombinacji czasu i pozycji, a następnie wyeksportuj je jako pliki obrazów w formacie bezstratnym, takim jak TIFF. Nazwy plików powinny być sformatowane tak, aby jedna seria przypadała na jedną pozycję (np. POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 itd., a nie POLAR-GFP_0001_pos1), aby oprogramowanie mogło połączyć je w film. W programie Zen 2009: użyj funkcji Copy:Subset w zakładce Processing, aby rozdzielić pozycje na osobne pliki, a następnie zastosuj Maximum Intensity Projection. Na koniec wyeksportuj obrazy jako TIFF (File:Export, Full resolution image window - series).
- Użyj programu FIJI7,8, aby wyrównać kolejne obrazy, uruchamiając makro bUnwarpJ9 (Plugins:Registration:bUnwarpJ). Zmień Registration Mode na Mono. W przypadku wszystkich Advanced Options można pozostawić wartości domyślne. Dla długich sekwencji time-lapse pobierz i zainstaluj makro „Affine + Consistent Elastic 2D Image Registration”, które automatycznie zastosuje bUnwarpJ do serii obrazów, a następnie otwórz swoje dane za pomocą File:Import:Image Sequence, aby z niego skorzystać. Odznacz opcję MOPS landmarks extraction i uruchom proces.
- Użyj programu FIJI/ImageJ lub Quicktime Pro, aby otworzyć sekwencję wyrównanych obrazów i zapisać ją w żądanym formacie wideo (dobrym wyborem jest AVI).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zestaw informacyjnych punktów czasowych zebranych za pomocą tej metody przedstawiono na Ryc. 3. Membrany komórkowe są znakowane RFP (pm-rb), a GFP jest połączone z białkiem POLAR pod jego natywnym promotorem (POLAR::POLAR-GFP)6 W skali czasowej 30 min obserwujemy podziały komórek wraz ze zmianami w lokalizacji białek im poprzedzającymi. Asymetryczne podziały komórek w linii stomatycznej tworzą przypominające komórki macierzyste prekursory szparek zwane merystemoidami, które zachowują ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta technika konfokalna typu time-lapse umożliwia badania podłużne ekspresji i lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie w pojedynczych komórkach epidermy liścienia Arabidopsis, co w przypadku białka POLAR i innych białek dynamicznie zmieniających się jest kluczowe dla właściwego zrozumienia ich funkcji. Wcześniej obrazowanie time-lapse o przedłużonym czasie trwania było stosowane do badania infekcji grzybowej korzeni Arabidopsis11 oraz wzrostu merystemu5,12, jednak włączenie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Amandzie Rychel za pomoc w opracowaniu protokołu time-lapse oraz Lynn Pillitteri za skonstruowanie POLAR::POLAR-eGFP. Jesteśmy również wdzięczni ABRC za udostępnienie konstruktu pm-rb. Protokół ten został opracowany dzięki wsparciu z grantu PRESTO przyznanego przez Japan Science Technology and Agency. Badania nad POLAR były wspierane również przez University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) oraz National Science Foundation (MCB-0855659). KMP jest stypendystą badawczym NSF (DGE-0718124), a KUT jest badaczem HHMI-GBMF.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar Bacto | BD | 214010 | |
| Szkiełko jednokomorowe | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Lub dwukomorowe (155379) |
| Skanujący konfokalny mikroskop laserowy | Zeiss | LSM700 | Oprogramowanie Zen 2009 |
| Obiektyw 20x | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Mikroskop sekcyjny | Benz (National) | 431TBL | Oświetlenie dolne |
| Pinceta #5, końcówka biologiczna | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Kluczowe są bardzo cienkie końcówki |
Bibliografia
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64(1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449(1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854(2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74(2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260(2011).
- Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36(2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296(2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011(2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619(2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
