Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Podsumowanie

Xenopus ekstrakt z jaj jest przydatnym systemem modelowym do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół dotyczy przygotowania ekstraktów z jaj Xenopus oraz odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA. Techniki te można zaadaptować do różnych metod wywołania uszkodzeń DNA w badaniach nad sygnałowaniem punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Streszczenie

Na co dzień komórki są narażone na różnorodne uszkodzenia endogenne i środowiskowe. Aby przeciwdziałać tym czynnikom, komórki wyewoluowały sygnalizację punktów kontrolnych uszkodzeń DNA jako mechanizm nadzoru służący do wykrywania uszkodzeń DNA i kierowania odpowiedziami komórkowymi na te uszkodzenia. W sygnalizacji punktów kontrolnych uszkodzeń DNA biorą udział kilka grup białek zwanych sensorami, transduktorami i efektorami (Rycina 1). W tej złożonej ścieżce sygnałowej ATR (ATM and Rad3-related) jest jedną z głównych kinaz, które mogą reagować na uszkodzenia DNA i stres replikacyjny. Aktywowana kinaza ATR może fosforylować swoje substraty w dół szlaku, takie jak Chk1 (Checkpoint kinase 1). W konsekwencji fosforylowana i aktywowana Chk1 prowadzi do wielu efektów w dół szlaku punktu kontrolnego uszkodzeń DNA, w tym do zatrzymania cyklu komórkowego, aktywacji transkrypcji, naprawy uszkodzeń DNA oraz apoptozy lub starzenia się komórkowego (Rycina 1). W przypadku uszkodzenia DNA brak aktywacji punktu kontrolnego skutkuje nieodwracalnymi uszkodzeniami, a w konsekwencji niestabilnością genomiczną. Badanie punktów kontrolnych uszkodzeń DNA pozwoli wyjaśnić, w jaki sposób komórki utrzymują integralność genomu i zapewni lepsze zrozumienie mechanizmów rozwoju chorób ludzkich, takich jak nowotwory.

Xenopus laevis ekstrakty z jaj komórkowych stają się potężnym, bezkomórkowym systemem modelowym w badaniach nad punktami kontrolnymi uszkodzeń DNA. Ekstrakt niskoprędkościowy (LSE) został pierwotnie opisany przez grupę Masui¹. Dodanie do LSE chromatiny plemników pozbawionych błon prowadzi do powstania jąder komórkowych, w których DNA replikuje się w sposób półkonserwatywny raz na cykl komórkowy.

Szlak sygnalizacji punktu kontrolnego zależny od ATR/Chk1 jest aktywowany przez uszkodzenia DNA lub stres replikacyjny ². Obecnie stosuje się dwie metody indukcji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA: podejścia powodujące uszkodzenia DNA oraz struktury naśladujące uszkodzenia DNA ³. Uszkodzenia DNA można indukować za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV), promieniowania γ, metanosulfonianu metylu (MMS), mitomycyny C (MMC), 4-nitrochinolino-1-tlenku (4-NQO) lub afidikoliny^{3, 4}. MMS jest czynnikiem alkilującym, który hamuje replikację DNA i aktywuje zależny od ATR/Chk1 punkt kontrolny uszkodzeń DNA ^4-7. Promieniowanie UV również aktywuje zależny od ATR/Chk1 punkt kontrolny uszkodzeń DNA ⁸. Strukturą naśladującą uszkodzenia DNA jest AT70, który stanowi kompleks dwóch odziedziczonych oligonukleotydów poly-(dA)70 i poly-(dT)70. System AT70 został opracowany w laboratorium Billa Dunphy'ego i jest powszechnie stosowany do indukcji sygnalizacji punktu kontrolnego ATR/Chk1 ^9-12.

W niniejszej pracy opisujemy protokoły (1) przygotowania ekstraktów z jaj bezkomórkowych (LSE), (2) poddania chromatyny plemników Xenopus dwóm różnym metodom uszkadzania DNA (MMS i UV), (3) przygotowania struktury AT70 naśladującej uszkodzenia DNA oraz (4) aktywacji zależnego od ATR/Chk1 punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników lub struktury naśladującej uszkodzenia DNA.

Protokół

1. Przygotowanie LSE

1. Samicom żab (Xenopus laevis) poddawane są dwukrotnej iniekcji w celu pobrania jaj. Pierwsza iniekcja (priming) to 100 U PMSG (gonadotropiny z surowicy klaczy w ciąży) na jedną żabę. Priming musi zostać przeprowadzony co najmniej dwa dni przed indukcją składania jaj; przygotowane w ten sposób żaby można wykorzystać przez maksymalnie dwa tygodnie. W celu przeprowadzenia primingu wstrzykните PMSG podskórnie do grzbietowych worków chłonnych, używając strzykawki 3 ml i igły 27 G.
2. Aby zindukować składanie jaj, wstrzykните 500 U hCG (ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej) podskórnie do grzbietowych worków chłonnych każdej przygotowanej żaby, używając igły 27 G. Inkubujcie wstrzyknięte żaby w oddzielnych wiadrach zawierających 2 litry 1x zmodyfikowanego roztworu Ringera według Marca (MMR). Pozostawcie żaby na 14-20 h do złożenia jaj przed ich pobraniem.
3. Wyjmijcie żaby z wiader i odlejcie roztwór MMR, aż pozostanie około 100 ml. Pobierzcie jaja z wiader, przenosząc je do zlewki o pojemności 250 ml.
4. Usuńcie galaretkę z jaj (dejellying), dodając 100 ml 2% cysteiny (dostosujcie pH do 7,8 za pomocą 10 M KOH). Delikatnie mieszajcie jaja, wykonując ruchy wirowe odwróconą szklaną pipetą Pasteura (o średnicy 0,7 cm) mniej więcej co 30 s. Zlejcie roztwór i zastąpcie go świeżą cysteiną dwukrotnie w trakcie inkubacji. Proces usuwania galaretki kończy się po około 5-15 min, gdy jaja tworzą bardziej zwartą warstwę na dnie zlewki.
5. Wylejcie roztwór cysteiny i przemyjcie jaja trzykrotnie roztworem 0,25x MMR. Mieszajcie jaja w roztworze za pomocą szklanej pipety. Jaja „wadliwe” rozpoznaje się na podstawie prostej inspekcji wizualnej — mają one „napuchnięty” biały wygląd. Po zamieszaniu jaja „wadliwe” skupią się w centrum zlewki. Usuńcie je za pomocą pipety Pasteura.
6. Przemyjcie jaja trzykrotnie buforem do lizy jaj (ELB). Usuńcie wszelkie pozostałe „wadliwe” jaja pipetą Pasteura. Przelejcie jaja do probówki Falcon 14 ml.
7. Wirujcie probówkę Falcon przez 55 s przy 188 x g (1 100 rpm), używając klinicznej wirówki naktowej CL2 IEC z rotorem z koszykami wahadłowymi, aby zagęścić jaja. Usuńcie nadmiar buforu z powierzchni warstwy jaj. Dodajcie 0,5 μl roztworu zapasowego Aprotininy/Leupeptyny oraz 0,5 μl roztworu zapasowego Cytochalazyny B na każdy 1 ml zagęszczonych jaj.
8. Centryfugujcie jaja przy 16 500 x g (10 000 rpm) przez 15 min w temperaturze 4 °C, używając wirówki superspeed Sorvall RC6 plus z rotorem wahadłowym HB6. Po centryfugacji w probówce powstają trzy warstwy: lipidowa, ekstraktu oraz żółtka/pigmentu (od góry do dołu). Przebijcie igłą 21 G ściankę probówki Falcon w dolnej części środkowej warstwy ekstraktu. Ostrożnie wyjmijcie igłę, ponieważ może ona zostać zablokowana przez plastik. W miejscu nakłucia wprowadźcie nową igłę 21 G połączoną ze strzykawką 1 ml, aby pobrać ekstrakt. Powoli aspirujcie ekstrakt do strzykawki, aby uniknąć pęcherzyków powietrza oraz zanieczyszczenia warstwami lipidową i żółtkową/pigmentową.
9. Przenieście ekstrakty do schłodzonej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Na każdy mililitr ekstraktu z jaj dodajcie następujące roztwory zapasowe substancji chemicznych do wskazanej końcowej stężenia (podanego w nawiasach): (1) 10 μl cykloheksymidu (100 μg/ml); (2) 1 μl Aprotininy/Leupeptyny (po 10 μg/ml każdej); (3) 1 μl cytochalazyny B (5 μg/ml); (4) 1 μl ditiotreitolu (1 mM); oraz (5) 0,33 μl nocodazolu (3 μg/ml). Delikatnie odwróćcie probę z ekstraktem z jaj co najmniej 10 razy. Otrzymany roztwór to LSE, który musi być przygotowany na świeżo i zużyty w ciągu 4 h. Jakość LSE ulega pogorszeniu po 4 h lub po cyklu zamrażania i rozmrażania.

2. Poddanie chromatyny plemników działaniu czynników uszkadzających DNA

1. Przygotować normalną chromatinę plemnikową zgodnie z wcześniej opisaną metodą ¹³.
2. Przygotować chromatinę plemnikową traktowaną MMS
   1. Resuspender normalną chromatinę plemnikową w 0,5 ml Buforu X.
   2. Dodać ~ 5,5 μl MMS (stężenie zapasu 9,1 M) do 500 μl resuspendowanej chromatyny, aby uzyskać stężenie końcowe 100 mM.
   3. Inkubować chromatinę plemnikową w probówce do mikrocentryfugi w temperaturze pokojowej przez 30 min przy rotacji.
   4. Wirować probówkę do mikrocentryfugi z prędkością 686 x g (2 100 rpm) przez 10 min w temperaturze pokojowej, używając klinicznej centryfugi IEC CL2 z rotorem z koszykami i adapterami do probówek.
   5. Odlać supernatant i resuspender osad w 0,5 ml Buforu X z dodatkiem BSA (3%), DTT (0,1 mM) oraz Aprotininy/Leupeptyny (po 10 μg/ml każdej).
   6. Powtórzyć kroki (4) i (5) dwukrotnie w celu przemycia chromatyny plemnikowej.
   7. Wyznaczyć stężenie chromatyny plemnikowej za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć do 100 000 plemników/μl. Przechowywać alikwoty 5 μl w zamrażarce -80 °C do dalszego użytku.
3. Przygotować chromatinę plemnikową traktowaną UV
   1. Nanieść pożądaną ilość (np. 10 μl) normalnej chromatyny plemnikowej na powierzchnię kawałka Parafilmu.
   2. Umieścić Parafilm w urządzeniu do sieciowania UV (crosslinker). Ustawić pożądany parametr energii, zależnie od eksperymentu, i rozpocząć naświetlanie chromatyny plemnikowej światłem UV. Na przykład uzyskanie 1 000 J/m² zajmuje około 21 s.
   3. Po naświetlaniu UV chromatinę plemnikową traktowaną UV należy niezwłocznie dodać do ekstraktów z komórek jajowych.

3. Przygotowanie struktury naśladującej uszkodzenie DNA (AT70)

1. Rozpuścić dwa syntetyczne oligonukleotydy poly-(dA)70 (oznaczony jako A70) oraz poly-(dT)70 (oznaczony jako T70) w wodzie do odpowiednio stężenia 2 μg/μl.
2. Do jednej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 100 μl A70 oraz 100 μl T70. Gotować zmieszany roztwór syntetycznych oligonukleotydów przez 5 min w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym.
3. Wyjąć blok grzejny (z probówką zawierającą mieszaninę AT) i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej na blacie laboratoryjnym. Ten etap dostosowania temperatury trwa około 45-60 min.
4. Schłodzona mieszanina to AT70 o stężeniu końcowym 2 μg/μl. Alikwoty AT70 o objętości 10 μl przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

4. Wywoływanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników lub struktury imitującej uszkodzenie DNA

1. Indukcja punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE z użyciem uszkodzonej chromatyny plemników
   1. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 50 μl LSE, a następnie uzupełnić o 1 μl mieszaniny energetycznej (Energy Mixture) i 2 μl uszkodzonej chromatyny plemników (stężenie końcowe ~4 000 plemników/μl reakcji).
   2. Inkubować probkę z reakcją w temperaturze pokojowej przez 90 min, potrząsając probówką co 10 min.
   3. Po 30-minutowej inkubacji nanieść 1 μl mieszaniny reakcyjnej na szkiełko mikroskopowe z dodatkiem 1 μl roztworu barwnika jądrowego. Przykryć mieszaninę reakcyjną szkiełkiem nakrywką i sprawdzić obecność jąder za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zazwyczaj po 30 min inkubacji powstają okrągłe jądra, co wskazuje na rozpoczęcie replikacji DNA.
   4. Przenieść 10 μl mieszaniny reakcyjnej do 90 μl buforu do próbek. Próbki analizuje się metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anty-Chk1 P-S344 lub anty-Chk1.
2. Indukcja punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE za pomocą AT70
   1. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 50 μl LSE uzupełnione o 1 μl mieszaniny energetycznej (Energy Mixture) i 1,6 μl stoku Tautomycyny.
   2. Do każdej reakcji dodać 1,25 μl przygotowanego wcześniej AT70 (2 μg/μl) lub wody (jako kontrolę negatywną). Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 90 min. Potrząsać probkami z reakcją co 10 min.
   3. Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej do 90 μl buforu do próbek. Próbki bada się metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anty-Chk1 P-S344 lub anty-Chk1.

5. Reprezentatywne wyniki

Uszkodzona chromatyna plemników lub struktura naśladująca uszkodzenie DNA mogą aktywować punkt kontrolny uszkodzeń DNA zależny od ATR/Chk1 w systemie ekstraktu z jaj Xenopus. Rycina 2A pokazuje, że MMS indukuje fosforylację Chk1 w obrębie Ser344 (Chk1 P-S344), co jest wskaźnikiem aktywacji kinazy ATR. Rycina 2B wykazuje, że AT70, jako struktura naśladująca uszkodzenie DNA, również wywołuje fosforylację Chk1. Próbki całkowitego białka Chk1 posłużyły jako kontrole ładowania w obu przykładach.

Rysunek 1. Schemat sygnalizacji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Rysunek 2. Fosforylacja Chk1 jest indukowana przez traktowanie MMS lub AT70 w ekstraktach z jaj Xenopus.(A) Chromatyna plemników uszkodzona przez MMS (MMS) lub prawidłowa chromatyna plemników (Con) są inkubowane w ekstraktach z jaj przez 90 min. Fosforylację Chk1 w pozycji Ser344 (Chk1 P-S344) oraz całkowitą ilość Chk1 w ekstraktach z jaj badano za pomocą immunoblottingu. (B) Do ekstraktów z jaj dodano odpowiednio AT70 lub wodę (Con). Próbki analizowano również za pomocą immunoblottingu, analogicznie jak w punkcie (A).

Dyskusja

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus wiąże się z kilkoma zaletami. Zastosowanie ekstraktów z jaj pozwala na uzyskanie dużej ilości ekstraktów bezkomórkowych zsynchronizowanych w fazie interfazy cyklu komórkowego. Ekstrakty z jaj można przygotować w sposób łatwy i niedrogi. Stosunkowo łatwo jest wywołać uszkodzenia DNA lub chromatyny i wykazać defekt w punkcie kontrolnym uszkodzeń DNA po immunodeplecji docelowego białka z ekstraktu z jaj. Następnie potencjalny defekt ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
przeciwciało anty-Chk1 P-S344	Sygnalizacja komórkowa	2348L
Przeciwciało anty-Chk1	Santa Cruz	SC7898
Aprotynina	MP Biomedicals	0219115880
cykloheksymida	Sigma	C7698-5G
Cytochalazyna B	EMD	250233
Ditiotreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-cysteina	Sigma	C7352-1KG
Leupeptyna	VWR	97063-922
Metanosulfonian metylu (MMS)	Sigma	129925-5G
Nokodazol	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Bufor do próbek	Sigma	S3401
Tautomycyna	Wako Chemicals USA	209-12041
Sprzęt
Kubełek do składania jaj	produkty komercyjne Rubbermaid	6308
Wirówka CL2 IEC z rotorem z koszami wahadłowymi	Thermo Scientific	004260F
wirnik z koszami wahadłowymi HB6	Thermo Scientific	11860
wirówka superspeed Sorvall RC6 plus	Thermo Scientific	46910
krzyżownik UV	UVP	95-0174-01
Roztwory
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO44, 2,5 mM CaCl22, 5 mM HEPES, doprowadzić pH do 7,8 za pomocą 10 M NaOH
Roztwór zapasowy aprotininy/leupeptyny			po 10 mg/ml w wodzie. Przechowywać w 20 μalikwoty w -80°C °C.
Bufor X			0,2 M sacharozy, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl22, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH skorygowane do 7,5 za pomocą HCl
Roztwór zapasowy cykloheksymidu			10 mg/ml w wodzie. Przechowywać w alikwotach po 1 ml w temperaturze -20°C. °C.
Roztwór stokowy cytochalazyny B			5 mg/ml w DMSO. Przechowywać w temperaturze 20 μalikwoty w temperaturze -20°C °C.
Roztwór stokowy ditiotreitolu (DTT)			1 M w wodzie. Przechowywać w aliquotach po 1 ml w temperaturze -20°C. °C.
ELB			0,25 M sacharozy, 1 mM DTT, 50 μg/ml cykloheksymidu, 2,5 mM MgCl22, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,7
Roztwór stokowy nocodazolu			10 mg/ml w DMSO. Przechowywać w temperaturze 5 μalikwoty w temperaturze -80°C °C.
Mieszanina energetyczna			375 mM fosforanu kreatyny, 50 mM ATP i 25 mM MgCl22Aliquoty są przechowywane w temperaturze -80°C. °C.
Roztwór barwnika jądrowego			0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glicerolu (v/v), w 1x PBS
Roztwór zapasowy tautomycyny			100 μM w DMSO. Przechowywać w temperaturze 10 μalikwoty w temp. -80°C °C.