Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Podsumowanie

Xenopus ekstrakt z jaj jest przydatnym systemem modelowym do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół dotyczy przygotowania ekstraktów z jaj Xenopus oraz odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA. Techniki te można zaadaptować do różnych metod wywołania uszkodzeń DNA w badaniach nad sygnałowaniem punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Streszczenie

Na co dzień komórki są narażone na różnorodne uszkodzenia endogenne i środowiskowe. Aby przeciwdziałać tym czynnikom, komórki wyewoluowały sygnalizację punktów kontrolnych uszkodzeń DNA jako mechanizm nadzoru służący do wykrywania uszkodzeń DNA i kierowania odpowiedziami komórkowymi na te uszkodzenia. W sygnalizacji punktów kontrolnych uszkodzeń DNA biorą udział kilka grup białek zwanych sensorami, transduktorami i efektorami (Rycina 1). W tej złożonej ścieżce sygnałowej ATR (ATM and Rad3-related) jest jedną z głównych kinaz, które mogą reagować na uszkodzenia DNA i stres replikacyjny. Aktywowana kinaza ATR może fosforylować swoje substraty w dół szlaku, takie jak Chk1 (Checkpoint kinase 1). W konsekwencji fosforylowana i aktywowana Chk1 prowadzi do wielu efektów w dół szlaku punktu kontrolnego uszkodzeń DNA, w tym do zatrzymania cyklu komórkowego, aktywacji transkrypcji, naprawy uszkodzeń DNA oraz apoptozy lub starzenia się komórkowego (Rycina 1). W przypadku uszkodzenia DNA brak aktywacji punktu kontrolnego skutkuje nieodwracalnymi uszkodzeniami, a w konsekwencji niestabilnością genomiczną. Badanie punktów kontrolnych uszkodzeń DNA pozwoli wyjaśnić, w jaki sposób komórki utrzymują integralność genomu i zapewni lepsze zrozumienie mechanizmów rozwoju chorób ludzkich, takich jak nowotwory.

Xenopus laevis ekstrakty z jaj komórkowych stają się potężnym, bezkomórkowym systemem modelowym w badaniach nad punktami kontrolnymi uszkodzeń DNA. Ekstrakt niskoprędkościowy (LSE) został pierwotnie opisany przez grupę Masui¹. Dodanie do LSE chromatiny plemników pozbawionych błon prowadzi do powstania jąder komórkowych, w których DNA replikuje się w sposób półkonserwatywny raz na cykl komórkowy.

Szlak sygnalizacji punktu kontrolnego zależny od ATR/Chk1 jest aktywowany przez uszkodzenia DNA lub stres replikacyjny ². Obecnie stosuje się dwie metody indukcji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA: podejścia powodujące uszkodzenia DNA oraz struktury naśladujące uszkodzenia DNA ³. Uszkodzenia DNA można indukować za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV), promieniowania γ, metanosulfonianu metylu (MMS), mitomycyny C (MMC), 4-nitrochinolino-1-tlenku (4-NQO) lub afidikoliny^{3, 4}. MMS jest czynnikiem alkilującym, który hamuje replikację DNA i aktywuje zależny od ATR/Chk1 punkt kontrolny uszkodzeń DNA ^4-7. Promieniowanie UV również aktywuje zależny od ATR/Chk1 punkt kontrolny uszkodzeń DNA ⁸. Strukturą naśladującą uszkodzenia DNA jest AT70, który stanowi kompleks dwóch odziedziczonych oligonukleotydów poly-(dA)70 i poly-(dT)70. System AT70 został opracowany w laboratorium Billa Dunphy'ego i jest powszechnie stosowany do indukcji sygnalizacji punktu kontrolnego ATR/Chk1 ^9-12.

W niniejszej pracy opisujemy protokoły (1) przygotowania ekstraktów z jaj bezkomórkowych (LSE), (2) poddania chromatyny plemników Xenopus dwóm różnym metodom uszkadzania DNA (MMS i UV), (3) przygotowania struktury AT70 naśladującej uszkodzenia DNA oraz (4) aktywacji zależnego od ATR/Chk1 punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników lub struktury naśladującej uszkodzenia DNA.

Protokół

1. Przygotowanie LSE

1. Samice żab (Xenopus laevis) poddaje się dwóm iniekcjom w celu pobrania jaj. Pierwsza iniekcja (przygotowawcza) to 100 U PMSG (gonadotropiny z surowicy klaczy w ciąży) na jedną żabę. Przygotowanie żab musi nastąpić co najmniej dwa dni przed indukcją składania jaj; tak przygotowane żaby można wykorzystać przez okres do dwóch tygodni. W celu przygotowania żab wstrzyknąć PMSG podskórnie do grzbietowych worków limfatycznych, używając strzykawki 3 ml i igły 27 G.
2. Aby indukować składanie jaj, wstrzyknąć 500 U hCG (ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej) podskórnie do grzbietowych worków limfatycznych każdej przygotowanej żaby, używając igły 27 G. Inkubować wstrzyknięte żaby w oddzielnych wiadrach zawierających 2 litry 1x zmodyfikowanego roztworu Ringera Marca (MMR). Pozostawić żaby na 14-20 hr w celu złożenia jaj przed ich pobraniem.
3. Wyjąć żaby z wiader i odlać roztwór MMR, aż pozostanie około 100 ml. Pobrać jaja z wiader, przenosząc je do zlewki o pojemności 250 ml.
4. Usunąć otoczkę galaretowatą z jaj, dodając 100 ml 2% cysteiny (dostosować pH do 7,8 za pomocą 10 M KOH). Delikatnie mieszać jaja odwróconą szklaną pipetą Pasteura (o średnicy 0,7 cm) w odstępach około 30 s. Zlać roztwór i zastąpić go świeżą cysteiną dwukrotnie podczas inkubacji. Proces usuwania otoczki kończy się po około 5-15 min, gdy jaja tworzą bardziej kondensowaną warstwę na dnie zlewki.
5. Wylać roztwór cysteiny i trzykrotnie przemyć jaja roztworem 0,25x MMR. Mieszać jaja w roztworze za pomocą szklanej pipety. Jaja „złe” rozpoznaje się poprzez zwykłą inspekcję wizualną; mają one „napuchnięty” biały wygląd. „Złe” jaja gromadzą się w centrum zlewki po wymieszaniu. Usunąć „złe” jaja pipetą Pasteura.
6. Przemyć jaja buforem do lizy jaj (ELB) trzykrotnie. Usunąć wszelkie pozostałe „złe” jaja pipetą Pasteura. Przelać jaja do probówki Falcon 14 ml.
7. Wirować probówkę Falcon przez 55 sec przy 188 x g (1 100 rpm) w wirówce stołowej CL2 IEC z rotorem z koszyczkami wahadłowymi, aby skondensować jaja. Usunąć nadmiar buforu znad warstwy jaj. Dodać 0,5 μl roztworu zapasowego Aprotininy/Leupeptyny oraz 0,5 μl roztworu zapasowego Cytochalazyny B na każdy 1 ml skondensowanych jaj.
8. Centryfugować jaja przy 16 500 x g (10 000 rpm) przez 15 min w temperaturze 4 °C w wirówce superszybką Sorvall RC6 plus z rotorem wahadłowym HB6. Po wirowaniu jaja frakcjonują się w probówce na trzy warstwy (od góry do dołu): lipidową, ekstraktu oraz żółtka/pigmentu. Przebić ściankę probówki Falcon w dolnej części środkowej warstwy ekstraktu igłą 21 G. Ostrożnie wyciągnąć igłę, ponieważ może ona zostać zablokowana przez plastik. W miejsce nakłucia wprowadzić nową igłę 21 G połączoną ze strzykawką 1 ml, aby pobrać ekstrakt. Powoli aspirować ekstrakt do strzykawki, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i zanieczyszczenia warstwami lipidową oraz żółtka/pigmentu.
9. Przenieść ekstrakty do schłodzonej probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml. Na każdy mililitr ekstraktu z jaj dodać następujące roztwory zapasowe do określonego stężenia końcowego (podanego w nawiasach): (1) 10 μl cykloheksymidu (100 μg/ml); (2) 1 μl Aprotininy/Leupeptyny (po 10 μg/ml każda); (3) 1 μl Cytochalazyny B (5 μg/ml); (4) 1 μl ditiotreitolu (1 mM); oraz (5) 0,33 μl nocodazolu (3 μg/ml). Delikatnie odwrócić ekstrakt z jaj co najmniej 10 razy. Jest to LSE, który musi być przygotowany na świeżo i zużyty w ciągu 4 hr. Jakość LSE ulega pogorszeniu po upływie 4 hr lub po cyklu zamrażania i rozmrażania.

2. Poddawanie chromatyny plemników działaniu metod uszkadzających DNA

1. Przygotować prawidłową chromatynę plemnikową zgodnie z wcześniej opisaną metodą ¹³.
2. Przygotować chromatynę plemnikową traktowaną MMS
   1. Resuspender prawidłową chromatynę plemnikową w 0,5 ml Buforu X.
   2. Do 500 μl resuspenderowanej chromatyny dodać ~ 5,5 μl MMS (stok 9,1 M) do uzyskania stężenia końcowego 100 mM.
   3. Inkubować chromatynę plemnikową w probówce do mikrocentryfugi w temperaturze pokojowej przez 30 min przy stałym obracaniu.
   4. Wirować probówkę w mikrocentryfudze przy 686 x g (2 100 rpm) przez 10 min w temperaturze pokojowej, używając wirówki klinicznej IEC CL2 z rotorem z koszyczkami i adapterami do probówek.
   5. Odlać supernatant i resuspender osad w 0,5 ml Buforu X z dodatkiem BSA (3%), DTT (0,1 mM) oraz aprotyniny/leupeptyny (po 10 μg/ml każda).
   6. Powtórzyć kroki (4) i (5) dwukrotnie w celu przemycia chromatyny plemnikowej.
   7. Wyznaczyć stężenie chromatyny plemnikowej za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć do 100 000 plemników/μl. Alikwoty 5 μl przechowywać w zamrażarce -80 °C do dalszego użycia.
3. Przygotować chromatynę plemnikową traktowaną UV
   1. Nanieść odpowiednią ilość (np. 10 μl) prawidłowej chromatyny plemnikowej na powierzchnię fragmentu Parafilmu.
   2. Umieścić Parafilm w urządzeniu do sieciowania UV. Ustawić żądany parametr energii, zależnie od eksperymentu, i rozpocząć naświetlanie chromatyny plemnikowej światłem UV. Przykładowo, osiągnięcie 1 000 J/m² zajmuje około 21 s.
   3. Po naświetlaniu UV traktowaną chromatynę plemnikową należy niezwłocznie dodać do ekstraktów jajowych.

3. Przygotowanie struktury naśladującej uszkodzenie DNA (AT70)

1. Rozpuścić dwa syntetyczne oligonukleotydy poly-(dA)70 (oznaczony jako A70) oraz poly-(dT)70 (oznaczony jako T70) w wodzie do odpowiedniego stężenia 2 μg/μl.
2. Do jednej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 100 μl A70 oraz 100 μl T70. Gotować zmieszany roztwór syntetycznych oligonukleotydów przez 5 min w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym.
3. Wyjąć blok grzejny (z probówką zawierającą mieszaninę AT) i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej na blacie laboratoryjnym. Dostosowanie temperatury trwa około 45-60 min.
4. Ochłodzona mieszanina to AT70 o końcowym stężeniu 2 μg/μl. Alikwoty AT70 o objętości 10 μl przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.

4. Wywoływanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE za pomocą uszkodzonej chromatyny plemników lub struktury naśladującej uszkodzenie DNA

1. Indukowanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu uszkodzonej chromatyny plemników
   1. Do probówki mikroodwirowej o pojemności 1,5 ml dodać 50 μl LSE, a następnie uzupełnić o 1 μl Energy Mixture oraz 2 μl uszkodzonej chromatyny plemników (stężenie końcowe ~4,000 sperm/μl reakcji).
   2. Inkubować probówkę z reakcją w temperaturze pokojowej przez 90 min, lekko potrząsając probówką co 10 min.
   3. Po 30-minutowej inkubacji nanieść 1 μl mieszaniny reakcyjnej na szkiełko przedmiotowe uzupełnione o 1 μl roztworu barwnika jądrowego. Nałożyć szkiełko nakrywkowe na mieszaninę reakcyjną i sprawdzić formowanie się jąder za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zazwyczaj po 30 min inkubacji tworzą się okrągłe jądra, co wskazuje na rozpoczęcie replikacji DNA.
   4. Przenieść 10 μl mieszaniny reakcyjnej do 90 μl buforu do próbek. Próbki analizuje się metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anti-Chk1 P-S344 lub anti-Chk1.
2. Indukowanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA w LSE przy użyciu AT70
   1. Do probówki mikroodwirowej o pojemności 1,5 ml dodać 50 μl LSE, uzupełnione o 1 μl Energy Mixture oraz 1,6 μl stoku Tautomycin.
   2. Do każdej reakcji dodać 1,25 μl przygotowanego wcześniej AT70 (2 μg/μl) lub wody (jako kontrolę negatywną). Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 90 min. Lekko potrząsać probówkami z reakcją co 10 min.
   3. Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej do 90 μl buforu do próbek. Próbki bada się metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał anti-Chk1 P-S344 lub anti-Chk1.

5. Reprezentatywne wyniki

Uszkodzona chromatyna plemników lub struktura naśladująca uszkodzenie DNA może aktywować punkt kontrolny uszkodzeń DNA zależny od ATR/Chk1 w systemie ekstraktu z komórek jajowych Xenopus. Rysunek 2A pokazuje, że MMS indukuje fosforylację Chk1 w pozycji Ser344 (Chk1 P-S344), co jest wskaźnikiem aktywacji kinazy ATR. Rysunek 2B pokazuje, że AT70, jako struktura naśladująca uszkodzenie DNA, również indukuje fosforylację Chk1. Próbki całkowitego białka Chk1 służą jako kontrole ładowania w obu przykładach.

Rysunek 1. Schemat sygnalizacji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Rysunek 2. Fosforylacja Chk1 jest indukowana przez traktowanie MMS lub AT70 w ekstraktach z jaj Xenopus. (A) Chromatyna plemników uszkodzona przez MMS (MMS) lub normalna chromatyna plemników (Con) są inkubowane w ekstraktach z jaj przez 90 min. Fosforylację Chk1 w pozycji Ser344 (Chk1 P-S344) oraz całkowitą ilość Chk1 w ekstraktach z jaj analizowano za pomocą immunoblottingu. (B) Do ekstraktów z jaj dodano odpowiednio AT70 lub wodę (Con). Próbki przeanalizowano za pomocą immunoblottingu analogicznie jak w (A).

Dyskusja

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus wiąże się z kilkoma zaletami. Zastosowanie ekstraktów z jaj pozwala na uzyskanie dużej ilości ekstraktów bezkomórkowych zsynchronizowanych w fazie interfazy cyklu komórkowego. Ekstrakty z jaj można przygotować w sposób łatwy i niedrogi. Stosunkowo łatwo jest wywołać uszkodzenia DNA lub chromatyny i wykazać defekt w punkcie kontrolnym uszkodzeń DNA po immunodeplecji docelowego białka z ekstraktu z jaj. Następnie potencjalny defekt ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
przeciwciało anty-Chk1 P-S344	Sygnalizacja komórkowa	2348L
Przeciwciało anty-Chk1	Santa Cruz	SC7898
Aprotynina	MP Biomedicals	0219115880
cykloheksymida	Sigma	C7698-5G
Cytochalazyna B	EMD	250233
Ditiotreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-cysteina	Sigma	C7352-1KG
Leupeptyna	VWR	97063-922
Metanosulfonian metylu (MMS)	Sigma	129925-5G
Nokodazol	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Bufor do próbek	Sigma	S3401
Tautomycyna	Wako Chemicals USA	209-12041
Sprzęt
Kubełek do składania jaj	produkty komercyjne Rubbermaid	6308
Wirówka CL2 IEC z rotorem z koszami wahadłowymi	Thermo Scientific	004260F
wirnik z koszami wahadłowymi HB6	Thermo Scientific	11860
wirówka superspeed Sorvall RC6 plus	Thermo Scientific	46910
krzyżownik UV	UVP	95-0174-01
Roztwory
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO44, 2,5 mM CaCl22, 5 mM HEPES, doprowadzić pH do 7,8 za pomocą 10 M NaOH
Roztwór zapasowy aprotininy/leupeptyny			po 10 mg/ml w wodzie. Przechowywać w 20 μalikwoty w -80°C °C.
Bufor X			0,2 M sacharozy, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl22, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH skorygowane do 7,5 za pomocą HCl
Roztwór zapasowy cykloheksymidu			10 mg/ml w wodzie. Przechowywać w alikwotach po 1 ml w temperaturze -20°C. °C.
Roztwór stokowy cytochalazyny B			5 mg/ml w DMSO. Przechowywać w temperaturze 20 μalikwoty w temperaturze -20°C °C.
Roztwór stokowy ditiotreitolu (DTT)			1 M w wodzie. Przechowywać w aliquotach po 1 ml w temperaturze -20°C. °C.
ELB			0,25 M sacharozy, 1 mM DTT, 50 μg/ml cykloheksymidu, 2,5 mM MgCl22, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,7
Roztwór stokowy nocodazolu			10 mg/ml w DMSO. Przechowywać w temperaturze 5 μalikwoty w temperaturze -80°C °C.
Mieszanina energetyczna			375 mM fosforanu kreatyny, 50 mM ATP i 25 mM MgCl22Aliquoty są przechowywane w temperaturze -80°C. °C.
Roztwór barwnika jądrowego			0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glicerolu (v/v), w 1x PBS
Roztwór zapasowy tautomycyny			100 μM w DMSO. Przechowywać w temperaturze 10 μalikwoty w temp. -80°C °C.