Obrazowanie wbudowywania receptorów znakowanych pHluoriną w błonę plazmatyczną w pierwotnych kulturach neuronów mysich

Podsumowanie

Poprzez znakowanie domen pozakomórkowych receptorów błonowych za pomocą superecliptic pHluorin oraz obrazowanie tych receptorów fuzyjnych w hodowlanych neuronach mysich, możemy bezpośrednio wizualizować pojedyncze zdarzenia wbudowywania pęcherzyków z receptorami w błonę plazmatyczną. Technika ta będzie miała kluczowe znaczenie w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów sterujących wbudowywaniem receptorów w błonę plazmatyczną.

Streszczenie

Lepsze zrozumienie mechanizmów sterujących transportem receptorów między błoną plazmatyczną (PM) a przedziałami wewnątrzkomórkowymi wymaga podejścia eksperymentalnego o doskonałej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Ponadto takie podejście musi umożliwiać rozróżnienie receptorów zlokalizowanych na PM od tych znajdujących się w przedziałach wewnątrzkomórkowych. Co najważniejsze, wykrywanie receptorów w pojedynczym pęcherzyku wymaga wyjątkowej czułości detekcji, ponieważ każdy pęcherzyk przenosi jedynie niewielką liczbę receptorów. Standardowe metody badania transportu receptorów obejmują biotynylację powierzchniową z następującym po niej wykrywaniem biochemicznym, której brakuje zarówno niezbędnej rozdzielczości przestrzennej, jak i czasowej, oraz badanie receptorów powierzchniowych oznakowanych immunofluorescencyjnie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co wymaga chemicznej fiksacji komórek i w związku z tym nie zapewnia wystarczającej rozdzielczości czasowej^1-6. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, my i inni opracowaliśmy i zastosowaliśmy nową strategię, która umożliwia wizualizację dynamicznego wbudowywania receptorów do PM z doskonałą rozdzielczością przestrzenną i czasową ^7-17. Podejście to polega na połączeniu pH-wrażliwego GFP, superecliptic pHluorin ¹⁸, z N-końcową domeną zewnątrzkomórkową receptorów. Superecliptic pHluorin posiada unikalną właściwość polegającą na tym, że jest fluorescencyjny przy neutralnym pH i niefluorescencyjny przy pH kwasowym (pH < 6.0). W związku z tym receptory oznakowane są niefluorescencyjne, gdy znajdują się w kwasowym światle wewnątrzkomórkowych pęcherzyków transportowych lub przedziałów endosomalnych, i stają się łatwo widoczne dopiero po wystawieniu na zewnątrzkomórkowe środowisko o neutralnym pH, na zewnętrznej powierzchni PM. Nasza strategia pozwala w konsekwencji odróżnić receptory powierzchniowe PM od tych wewnątrz wewnątrzkomórkowych pęcherzyków transportowych. Aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość przestrzenną i czasową, a także czułość wymaganą do badania dynamicznego transportu receptorów, zastosowaliśmy mikroskopię fluorescencyjną całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM), która pozwoliła nam osiągnąć optymalną rozdzielczość przestrzenną obrazowania optycznego (~170 nm), rozdzielczość czasową mikroskopii w tempie wideo (30 frames/sec) oraz czułość pozwalającą na wykrycie fluorescencji pojedynczej cząsteczki GFP. Dzięki obrazowaniu receptorów oznakowanych pHluoriną przy użyciu TIRFM, byliśmy w stanie bezpośrednio zwizualizować pojedyncze zdarzenia wbudowywania receptorów do PM w hodowlach neuronów. To podejście obrazowe może potencjalnie zostać zastosowane do każdego białka błonowego z domeną zewnątrzkomórkową, którą można oznaczyć superecliptic pHluorin, i pozwoli na szczegółową analizę kluczowych mechanizmów sterujących wbudowywaniem różnych białek błonowych (receptorów, kanałów jonowych, transporterów itp.) do PM.

Protokół

1. Przygotowanie hodowli gleju mysiego do kondycjonowania hodowli neuronalnych

1. Kolb T75 powleka się roztworem kolagenu (rozcieńczenie Purecol w ddH₂O w stosunku 1:3). Kolby ustawia się pionowo i pozostawia do wyschnięcia przez noc w dygestorze do hodowli tkankowych.
2. Bufor do sekcji (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 30 mM dekstrozy, 25 mM HEPES, pH 7,4, bez wapnia) oraz pożywkę do gleju (DMEM uzupełniony o 10% FBS, 10 jednostek/ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny oraz Glutamax) przygotowuje się i przechowuje w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
3. W dniu hodowli gleju, pożywkę do gleju ogrzewa się przez co najmniej 30 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przed sekcją mózgów myszy. Myszy embrionalne lub noworodkowe uśmierca się poprzez szybką dekapitację. Korę mózgową wycina się pod mikroskopem sekcyjnym.
4. Wycięte tkanki mózgowe trawi się w roztworze papainy (100 ml papainy i 20 μl 1% DNase I w 2 ml buforu do sekcji) w temperaturze 37 °C przez 20 min.
5. Po trawieniu papainą tkanki mózgowe płucze się 10 ml podgrzanej wcześniej pożywki do gleju. Następnie do strawionych tkanek mózgowych dodaje się świeżą pożywkę do gleju (2 ml), a tkanki homogenizuje się za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura.
6. Do dysocjowanych tkanek dodaje się świeżą pożywkę do gleju (8 ml). Do przefiltrowania zawiesiny dysocjowanych tkanek używa się sitka komórkowego o oczkach 70 μm. Następnie komórki wysiewa się do kolb T75 (zazwyczaj 2-3 embriony mogą zasiać jedną kolbę T75) i umieszcza w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
7. Następnego dnia aspiruje się pożywkę z kolb T75. Kolby płucze się 10 ml PBS. Następnie do każdej kolby dodaje się świeżą pożywkę do gleju (10-15 ml).
8. W ciągu 10-12 dni glej w kolbach T75 powinien osiągnąć konfluencję. Komórki glejowe płucze się PBS i do każdej kolby T75 dodaje się 5 ml 0,05% trypsyny.
9. Po inkubacji z trypsyną w temperaturze 37 °C przez 5 min komórki glejowe zostają zdysocjowane, a następnie komórki glejowe z każdej kolby T75 rozdziela się do dwóch różnych kolb T75 powleczonych kolagenem.
10. Inserty hodowlane (Millipore PICM03050) przygotowuje się poprzez umieszczenie ich w płytkach 6-dołkowych, powlekanie kolagenem i suszenie na powietrzu przez noc. Pod każdy insert hodowlany wlewa się pożywkę do gleju (po 2 ml).
11. Glej z konfluencyjnych kolb T75 poddaje się trypsynizacji i wysiewa na inserty hodowlane (jedna kolba T75 na płytkę 6-dołkową, po 2 ml na każdy insert). Te inserty z hodowlą gleju będą wykorzystywane do kondycjonowania kultur neuronalnych.

2. Hodowla neuronów

1. Szklane szkiełka podstawowe do hodowli neuronów oczyszcza się poprzez moczenie w 70% HNO₃ przez co najmniej jedną noc. Następnie szkiełka przemywa się ddH₂O co najmniej 3 razy i suszy w piecu Isotemp (>200 °C) przez noc.
2. Oczyszczone szkiełka umieszcza się w płytce 6-dołkowej, po jednym szkiełku na dołek. Szkiełka pokrywa się roztworem poli-L-lizyny (2 ml, 0,1% w 100 mM kwasie borowym, pH = 8,5) przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
3. Roztwór poli-L-lizyny usuwa się ze szkiełek, a następnie przemywa się je 3 razy autoklawowaną wodą ddH₂O. Szkiełka inkubuje się następnie przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C w pożywce do wysiewu (Neurobasal uzupełniony o 5% inaktywowaną termicznie surowicą konia, 10 jednostek/ml penicyliny, 10 μg/ml streptomycyny, Glutamax; w dniu użycia do pożywki dodaje się 2% suplementu B27).
4. Następnego dnia pożywkę do wysiewu usuwa się i do każdego dołka ze szkiełkiem dodaje 2 ml świeżej pożywki do wysiewu z B-27.
5. Ciążne myszy (E15-18) usypia się za pomocą CO₂, a zarodki mysie uśmierca przez dekapitację. Hipokamp lub prążkowie wypreparowuje się z tkanki mózgowej i umieszcza w 15 ml probówce stożkowej z lodowatym buforem do dyssekcji, odpowiednio do hodowli neuronów hipokampa lub średnich neuronów kolczastych prążkowia.
6. Wypreparowane tkanki mózgowe dysocjuje się papainą, zgodnie z opisem w krokach 1.4) i 1.5).
7. Po dysocjacji liczbę komórek w każdej zawiesinie neuronowej zlicza się za pomocą hemocytometru. Neurony wysiewa się następnie na każde szkiełko z gęstością 0,4 x 10⁶ komórek na dołek płytki 6-dołkowej i inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc (neurony są w dniu DIV 0).
8. Aby przygotować wkłady do hodowli gleju do kondycjonowania hodowli neuronów, usuwa się pożywkę glejową z wkładów i dodaje świeżą pożywkę do wysiewu (2 ml do wkładu i 2 ml pod wkład).
9. Następnego dnia (DIV 1) szkiełka z neuronami umieszcza się pod wkładami do hodowli gleju, po jednym szkiełku w każdym dołku.
10. Neurony dokarmia się połową objętości świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki do karmienia (z B-27) co 3-4 dni, aż będą gotowe do transfekcji i eksperymentów obrazowych.

3. Transfekcja

1. Transfekcję neuronów przeprowadza się przy użyciu Lipofectamine 2000. Dla każdej hodowli neuronów (jedna hodowla na szkiełko podstawowe) stosuje się 2 μl Lipofectamine 2000 oraz 1 μg DNA. Do rozcieńczenia Lipofectamine i DNA wykorzystuje się świeże medium Neurobasal bez dodatków.
2. Po zmieszaniu DNA i Lipofectamine inkubuje się je przez 20 min w temperaturze pokojowej.
3. Należy pobrać 1 ml medium z obszaru pod każdym insertem z hodowlą gleju oraz 1 ml z wnętrza każdego insertu, a następnie przenieść medium do probówki stożkowej. Do pobranego medium należy dodać taką samą objętość medium odżywczego z dodatkiem B27 i inkubować w temperaturze 37 °C. Medium to jest wykorzystywane do hodowli neuronów po transfekcji.
4. Po 20-minutowej inkubacji Lipofectamine/DNA inserty z hodowlą gleju są na chwilę usuwane z płytek 6-dołkowych. Do każdego szkiełka z neuronami dodaje się 200 μl mieszaniny Lipofectamine/DNA. Następnie inserty z hodowlą gleju są ponownie umieszczane w każdym dołku, nad neuronami. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza pod membraną insertów hodowlanych. Neurony inkubuje się z mieszaniną Lipofectamine/DNA w temperaturze 37 °C przez 2-4 hr.
5. Po 2-4 godzinnym okresie inkubacji inserty z glejem są ponownie usuwane. Medium hodowlane z mieszaniną Lipofectamine/DNA jest usuwane z każdego dołka. Do neuronów dodaje się medium zachowane w kroku 3.3) (2 ml na dołek). Inserty z hodowlą gleju są przywracane do każdego dołka, a następnie medium z glejem jest usuwane z każdego insertu i zastępowane 2 ml medium z kroku 3.3).
6. Neurony hoduje się przez kolejne 24-72 hr, aby umożliwić ekspresję transfekowanego cDNA przed przeprowadzeniem obrazowania TIRF tych neuronów.

4. Obrazowanie TIRF

1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM glukozy, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 25 mM HEPES, pH = 7,4) zostanie wykorzystany w eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek. Nasz system obrazowania TIRF jest zestawem customowym z laserem cyjanowym o mocy 100 mW do wzbudzenia oraz kamerą z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem z mnożnikiem elektronowym (EMCCD) jako detektorem.
2. Przed eksperymentami z obrazowaniem aCSF jest ogrzewany w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min. Wkład grzewczy do obrazowania żywych komórek jest umieszczany na stole mikroskopu, a wkład grzewczy, laser i kamera są rozgrzewane przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem eksperymentów z obrazowaniem.
3. Kryształek zytransfected neuronami jest montowany w komorze do obrazowania żywych komórek. Po zmontowaniu komory do jej wnętrza wprowadza się uprzednio ogrzany aCSF; krok ten należy wykonać jak najszybciej.
4. Po umieszczeniu komory na wkładzie grzewczym na stole mikroskopu,ytransfected neurony są identyfikowane wizualnie w trybie obrazowania epi-fluorescencyjnego.
5. Po zidentyfikowaniu zdrowych ytransfected neuronów (patrz Ryciny 1 i 2), zazwyczaj przeprowadzamy 1 min fotowybielania, aby usunąć istniejącą fluorescencję pHluoriny z błony plazmatycznej, ponieważ receptory pHluoriny na błonie plazmatycznej wykazują bardzo wysoki poziom fluorescencji w momencie rozpoczęcia obrazowania TIRF, co utrudnia wizualizację pojedynczych zdarzeń insercji.
6. Po fotowybielaniu ustawienie wzmocnienia mnożnika elektronowego w kamerze EMCCD jest ustawiane na maksimum, a rejestracja jest prowadzona przez 1 min z częstotliwością 10 Hz.
7. Każda rejestracja będzie zawierać 600 obrazów. Pojedyncze zdarzenia insercji są identyfikowane poprzez odtwarzanie rejestracji w programie ImageJ. Pojedyncze zdarzenia insercji są analizowane ręcznie przy użyciu programu ImageJ.

5. Reprezentatywne wyniki

Spójna kultura neuronów jest kluczem do sukcesu eksperymentów z obrazowaniem na żywo. Rysunek 1 przedstawia neurony hipokampa myszy hodowane zgodnie z naszym protokołem od DIV 11 do DIV 18. Z obrazów jasno wynika, że neurony rozwinęły rozbudowane wypustki, a wypustki dendrytyczne są gęsto pokryte kolcami dendrytycznymi, co wskazuje na to, że neurony w kulturze są zdrowe. Nasz protokół hodowli może być stosowany również w przypadku innych typów neuronów w mózgu. Na przykład niedawno wykorzystaliśmy ten protokół do hodowli prążkowiowych neuronów średnio kolczastych w badaniu mającym na celu analizę insercji receptora dopaminy D2 (DRD2) w hodowanych prążkowiowych neuronach średnio kolczastych myszy ⁹. Rysunek 2 przedstawia prążkowiowe neurony średnio kolczaste myszy hodowane zgodnie z naszym protokołem w DIV 8. Z sukcesem przeprowadziliśmy również obrazowanie TIRF receptorów DRD2 znakowanych superecliptic pHluorin w tym typie neuronów. Rysunek 3 przedstawia ekspresję DRD2 znakowanego pHluorin (pH-DRD2) w neuronie średnio kolczastym oraz wizualizację insercji pH-DRD2 w tym neuronie.

Rysunek 1. Kultura hipokampa myszy z wykorzystaniem metody hodowli interfejsowej. DIV: dni in vitro, dzień założenia kultury uznaje się za DIV 0. Z obrazów wynika, że neurony hipokampa dojrzewają w tego typu kulturze między DIV 11 a DIV 15. W DIV 11 i 13 dendryty neuronów pokryte są filopodiami i niedojrzałymi kolcami. W DIV 15 i 18 dendryty neuronów pokryte są dużymi kolcami, co wskazuje na bardziej dojrzałe neurony. Panele lewe: obrazy neuronów hipokampa myszy o różnym wieku przy małym powiększeniu. Panele prawe: obrazy przy dużym powiększeniu (zbliżenie na dendryty neuronów z panelu lewego) procesów dendrytycznych z kolcami dendrytycznymi w różnym wieku.

Rycina 2. Kultura średnio kolczastych neuronów prążkowia myszy z zastosowaniem metody kultury interfejsowej. Neurony na obrazach znajdują się w dniu DIV 8.

Rysunek 3. Mysi średni kolczasty neuron prążkowia przetransfekowany receptorem dopaminy D2 z tagiem super ecliptic pHluorin (pH-DRD2). Obraz po lewej stronie przedstawia projekcję maksymalnej intensywności z rejestracji time-lapse (600 obrazów, 100 msec na obraz). Białe groty strzałek wskazują poszczególne zdarzenia wbudowywania pęcherzyków pH-DRD2. Obraz ten zachowuje informacje o wbudowywaniu w wymiarze x-y, ale traci informacje czasowe. Obraz po prawej stronie przedstawia projekcję maksymalnej intensywności y-t, w której stos x-y-t został obrócony o 90 stopni wokół osi y, a maksymalny piksel z każdej linii osi x został rzutowany na pojedynczy piksel osi y. Obraz ten zachowuje informacje o wbudowywaniu wzdłuż osi y-t, ale traci informacje z osi x.

Dyskusja

Z nieznanych przyczyn neurony mysie są zawsze trudniejsze w hodowli niż neurony szczurze. W naszym doświadczeniu mieszana hodowla neuronów i gleju sprawdza się dobrze w przypadku pierwotnych hodowli neuronów mysich. Jednak taka mieszana hodowla nie nadaje się do eksperymentów z obrazowaniem TIRF, ponieważ w tym typie hodowli neurony i ich wypustki mają tendencję do wzrostu na wierzchu komórek glejowych, co sprawia, że somata neuronalne i wypustki dendrytyczne znajdują się poza zasięgiem mikroskopii TIRF. Dlatego dla obra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
oczyszczony roztwór kolagenu bydlęcego (Purecol)	Advanced Biomatrix	5005-B
zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)	GIBCO, by Life Technologies	14185-045
penicylina-streptomycyna (Pen Strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
pirowinian sodu	GIBCO, by Life Technologies	11360-070
DMEM High Glucose	GIBCO, by Life Technologies	10313-021
płodowa surowica bydlęca (FBS)
GlutaMAX	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
papaina	Worthington Biochemical Corp.	LS003126
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-10MG
fosforanowo-buforowy roztwór soli Dulbecco (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
0.05% trypsyna	GIBCO, by Life Technologies	25300-054
hydrobromek poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	P2636-1G
kwas borowy	Fisher Scientific	BP 168-500
pożywka Neurobasal	GIBCO, by Life Technologies	21103-049
suplement bezsurowiczy B-27	GIBCO, by Life Technologies	17504-044
inaktywowana termicznie surowica konia	GIBCO, by Life Technologies	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
wkładka hodowlana (Culture Insert)	EMD Millipore	PICM03050