Mikroiniekcja insuliny do hipokampa i mikrodializa in vivo podczas testów pamięci przestrzennej

Podsumowanie

Modulacja zależnej od hipokampa przestrzennej pamięci roboczej poprzez bezpośrednią mikroiniekcję wewnątrzhipokampalną, połączoną z następującą po niej mikrodializą in vivo w celu oznaczania metabolitów u świadomych, aktywnych behawioralnie zwierząt.

Streszczenie

Metabolizm glukozy jest użytecznym markerem lokalnej aktywności neuronalnej, stanowiąc podstawę takich metod jak zastosowanie 2-deoksyglukozy oraz funkcjonalny rezonans magnetyczny. Jednakże stosowanie tych metod w modelach zwierzęcych wymaga znieczulenia, co zmienia stan mózgu i uniemożliwia pomiary behawioralne. Alternatywną metodą jest wykorzystanie mikrodializy in vivo do ciągłego pomiaru stężeń glukozy, mleczanu i powiązanych metabolitów w płynie pozakomórkowym mózgu u zwierząt budzących się i nieunieruchomionych. Technika ta jest szczególnie przydatna w połączeniu z zadaniami opierającymi się na konkretnych obszarach mózgu i/lub ostrymi manipulacjami farmakologicznymi; na przykład pomiary w hipokampie podczas zadania z pamięcią operacyjną przestrzenną (spontaniczna alternacja) wykazują spadek poziomu glukozy pozakomórkowej i wzrost poziomu mleczanu, co sugeruje nasilenie glikolizy^1-3,4-5, a wewnątrzhipokampowe podanie insuliny zarówno poprawia pamięć, jak i zwiększa glikolizę w hipokampie⁶. Substancje takie jak insulina mogą być dostarczane do hipokampa za pomocą tej samej sondy do mikrodializy, która służy do pomiaru metabolitów. Wykorzystanie spontanicznej alternacji jako miary funkcji hipokampa ma na celu uniknięcie wszelkich czynników zakłócających wynikających ze stresowych motywatorów (np. wstrząsy stóp), unieruchomienia lub nagród (np. pokarm), z których każdy może zmienić zarówno wyniki zadania, jak i metabolizm; zadanie to zapewnia również pomiar aktywności motorycznej, co pozwala na kontrolę niespecyficznych efektów leczenia. Razem metody te umożliwiają bezpośredni pomiar zmiennych neurochemicznych i metabolicznych regulujących zachowanie.

Protokół

1. Przygotowanie do zabiegu

1. Oswojenie. Zwierzęta (najczęściej szczury lub myszy, choć metoda mikrodializy i jej połączenie z testami behawioralnymi mają charakter ogólny i wymagają jedynie niezbędnych adaptacji specyficznych dla gatunku, np. w zakresie znieczulenia) są poddawane oswojeniu przez minimum 10 min/dobę przez co najmniej dwa dni przed operacją. Wykazano, że intensywne oswojenie sprawia, iż zwierzęta w czasie testów pozostają w stanie wolnym od stresu, co pozwala uniknąć możliwych czynników zakłócających^4-5,7,8. W niniejszym protokole jako gatunek przykładu będziemy wykorzystywać szczury. Oswojenie musi być przeprowadzane bez wywoływania stresu spowodowanego szarpaniem futra, do czego mogą prowadzić np. rękawiczki lateksowe lub nitrylowe; najlepiej osiągnąć to, używając gołych rąk, po konsultacji z lekarzem weterynarii placówki oraz służbami medycyny pracy. Jeśli nie jest to możliwe, na rękawiczki barierowe należy założyć miękkie rękawiczki bawełniane, aby uniknąć szarpania futra szczurów.
2. Przygotowanie pola sterylnego. Przed rozpoczęciem operacji przygotowuje się obszar zabiegowy, tworzy pole sterylne wokół aparatu stereotaktycznego i nakłada sterylną obrusnicę na aparat, przykrywając podkładkę grzewczą służącą do utrzymania temperatury ciała szczura. Aby zapobiec przegrzaniu zwierzęcia, stosuje się podkładkę z krążącą ciepłą wodą z precyzyjnym termostatem.
3. Indukcja znieczulenia. Sprawdza się, czy parownik izofluranu zawiera optymalną ilość izofluranu, a następnie podłącza go do komory indukcyjnej. Sprawdza się połączenia, aby potwierdzić szczelność obiegu. Weryfikuje się sprawność systemu odsysania powietrza. Włącza się parowanie izofluranu i umieszcza zwierzę w komorze indukcyjnej, stosując mieszankę 5% izofluranu w tlenie; oznacza to dodanie 5% izofluranu do strumienia 100% tlenu dostarczanego do komory indukcyjnej.
4. Umieszczenie w aparacie. Zwierzęta są unieruchamiane w aparacie stereotaktycznym za pomocą wsporników usznych i poprzeczki zębowej. Prawidłowe umieszczenie wsporników usznych skutkuje unieruchomieniem głowy i ułożeniem uszu płasko wzdłuż wsporników. Zwierzęta są szybko stabilizowane, a ich nosy wsuwane do specjalnie zaprojektowanego stożka anestezjologicznego; podawanie odparowanego izofluranu przełącza się z komory indukcyjnej na stożek, a mieszankę anestetyczną dostosowuje tak, aby do strumienia tlenu kierowanego do stożka trafiało 2-3% izofluranu.
5. Potwierdzenie znieczulenia. Poziom znieczulenia chirurgicznego potwierdza się poprzez mocne uciśnięcie stopy oraz dmuchnięcie w oko; żadna z tych czynności nie powinna wywołać reakcji. Testy te powtarza się w odstępach około 15 min w trakcie całej operacji, aby potwierdzić utrzymanie poziomu znieczulenia chirurgicznego. Przed wejściem w pole sterylne usuwa się sierść z miejsca nacięcia.

2. Operacja

1. Wstępne przygotowanie zwierzęcia. Do każdego gałki ocznej aplikuje się maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu. Podskórnie (s.c.) podaje się 1 ml sterylnej soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu podczas operacji, a ciało przykrywa się sterylną draperią. Do skóry głowy aplikuje się Betadine, przecierając od środka na zewnątrz za pomocą patyczka bawełnianego; analogicznie przeciera się 70% ethanol; oba etapy przecierania powtarza się dwukrotnie, aby zapewnić odpowiednie przygotowanie miejsca nacięcia. Czas kontaktu Betadine i alkoholu ze skórą powinien wynosić co najmniej 3 min przed wykonaniem nacięcia. Anestezja jest utrzymywana i regularnie kontrolowana przez cały czas trwania operacji; w celu rozpoczęcia analgezji podaje się pojedynczą dawkę karprofenu (5 g/kg) s.c., stosując technikę aseptyczną. Analgezję podaje się po indukcji anestezji, aby zminimalizować stres związany z zastrzykiem.
2. Nacięcie i przygotowanie czaszki. W centrum czaszki wykonuje się nacięcie strzałkowe o długości 3-4 cm. Miejscowo aplikuje się mieszaninę bupiwakainy i epinefryny w stosunku 1:1, aby zapewnić dodatkową analgezję i zminimalizować krwawienie. Skórę głowy odsuwa się od nacięcia za pomocą klipsów chirurgicznych, a błony przykrywające czaszkę usuwa się za pomocą sterylnych gazików. Współrzędne wiercenia wyznacza się, przyjmując bregma jako punkt odniesienia, zaznacza się je za pomocą sterylnego wiertła (lub alternatywnie ręcznego urządzenia do kauteryzacji) i ponowną weryfikuje przed rozpoczęciem wiercenia. Współrzędne dla konkretnych obszarów mózgu (np. w tym przypadku hipokampa) ustala się na podstawie atlasu mózgu. W przypadku mikrodializy hipokampa miejsce wiercenia wyznaczamy na 5,6 mm tylnie od bregma, +5,0 bocznie i 3,0 brzusznie od opony twardej.
3. Wiercenie. W czaszce wierci się trzy otwory, dbając o przyłożenie minimalnej siły, tak aby uraz opony twardej i błon pod nią był minimalny lub nie wystąpił. Jeden otwór znajduje się w wyznaczonym miejscu wprowadzenia kanuli; pozostałe dwa są rozmieszczone w sposób wygodny do wkręcenia śrub czaszkowych. W otworach tych umieszcza się śruby o odpowiednim rozmiarze (np. samowiercące śruby 1,17 mm; Fine Science Tools), uważając, aby nie uszkodzić mózgu, i wykorzystuje się je jako punkty zakotwiczenia do późniejszej aplikacji cementu dentystycznego.
4. Umieszczenie kanuli i zamknięcie. Kanulę ustawia się w współrzędnych wprowadzenia, po ponownym potwierdzeniu miejsca wywierconego otworu, a następnie powoli opuszcza na docelową głębokość. Po prawidłowym ustawieniu kanulę stabilizuje się cementem dentystycznym. W razie potrzeby do zamknięcia rany stosuje się pojedynczy sterylny szew chirurgiczny. Do kanuli wprowadza się zgłębnik, aby zachować jej drożność. W tym protokole stosujemy sondę CMA12 i kanulę prowadzącą (CMA/Microdialysis).
5. Ostra opieka pooperacyjna. Podskórnie podaje się 3 ml sterylnej soli fizjologicznej w celu kontynuacji nawadniania; podaje się również pojedynczą dawkę karprofenu (5 g/kg) s.c. w celu rozpoczęcia analgezji. Zwierzęta usuwa się z aparatury i umieszcza w ogrzewanym pomieszczeniu rekonwalescencyjnym, w czystej klatce, i monitoruje do czasu pełnego wybudzenia z anestezji. Pełną rekonwalescencję ocenia się na podstawie przywrócenia odruchu prostowania i normalnej lokomocji. Następnie zwierzęta przenosi się do ich macierzystych klatek i standardowego pomieszczenia hodowlanego.
6. Krótkoterminowa opieka pooperacyjna. Klatki zwierząt, które przeszły operację, oznacza się datą zabiegu. Zwierzęta monitoruje się co najmniej raz dziennie przez minimum trzy dni po operacji oraz podaje im jedną tabletkę do żucia z karprofenem (2 mg) w dniu po operacji oraz w każdym z dwóch kolejnych dni. Jeśli zwierzęta nie przyjmują karprofenu doustnie, można podać go w formie zastrzyku, aby zapewnić odpowiednią analgezję. Monitoruje się ogólny stan zdrowia zwierzęcia oraz stan miejsca rany (pod kątem infekcji, zaczerwienienia itp.) zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi opieki nad zwierzętami, w razie potrzeby korzystając z pomocy lub porad personelu opiekuńczego lub lekarza weterynarii. Ważne jest, aby zapewnić odpowiednie obchodzenie się ze zwierzętami i ich aklimatyzację do eksperymentatora: zwierzęta powinny być często manipulowane, w tym z manipulacją kanulą, aż do momentu, gdy podczas kontaktu z eksperymentatorem nie będzie już widać oznak zdenerwowania lub stresu.
7. Dalsza opieka i traktowanie zwierząt. Zwierzęta będą poddawane odpowiednim procedurom testowym i eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem oraz przynależnością do konkretnej grupy eksperymentalnej.

3. Mikrodializa (mD)

1. Przygotowanie perfuzatu. Sztuczny płyn zewnątrzkomórkowy (aECF) przygotowuje się z 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl, 1,25 mM glukozy, w buforze o pH 7,4.⁹. UWAGA precyzyjny skład płynu jest niezbędny: niedokładności lub zastosowanie innych, mniej fizjologicznych płynów, takich jak płyn Ringera lub PBS, w mikrodializie doprowadzą do uzyskania wyraźnie błędnych wyników⁹W szczególności należy zauważyć, że skład jonowy płynu zewnątrzkomórkowego (ECF) NIE jest taki sam jak skład płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), co wykazaliśmy w szczegółowym badaniu ECF hipokampa przeprowadzonym w 2004 roku⁹W dniu przeprowadzania badania należy dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 2% masy/masy i całkowicie ją rozpuścić; zapobiega to utracie peptydów, takich jak insulina, na skutek przylegania do drenów, a także zmniejsza ryzyko utraty płynu (ultrafiltracji) na membranie sondy. Po przygotowaniu perfuzat należy przefiltrować przez filtr 0,2 μm.
2. Jeśli lek, taki jak insulina, ma zostać podany do badanego obszaru mózgu (w tym przypadku do hipokampa), należy przygotować go, wykorzystując alikwot przygotowanego aECF o odpowiednim stężeniu leku. W przypadku insuliny wykazano, że stężenie 400 nM (66,7 μU/μl) podawane za pomocą odwrotnej mikrodializy wpływa na funkcje metaboliczne i poznawcze hipokampa.¹⁰Należy zauważyć, że wynikowe stężenie insuliny w tkance nie jest tutaj mierzone i pozostaje nieznane.
3. Konfiguracja sondy i linii mikrodializy (mD). Przygotować nową sondę i linię do mikrodializy w dniu poprzedzającym testy. Utworzyć dwie oddzielne linie: „dopływową” (inflow) i „odpływową” (outflow). Użyć rurek PE50 do połączenia dwóch 1-metrowych odcinków rurek FEP, zapewniając minimalną przestrzeń martwą między liniami. Połączyć linię dopływową ze strzykawką Hamiltona o pojemności 1 ml wypełnioną sterylnie filtrowaną, dejonizowaną H₂0 (dH2O)₂0), a następnie przytwierdzić do sondy.
4. Obrotowy łącznik do mikrodializy. Aby umożliwić swobodne poruszanie się zwierzęcia podczas pomiarów, należy połączyć linie dopływową i odpływową z łącznikiem cieczowym w pobliżu pompy, wykorzystując dodatkowe rurki FEP. Należy pamiętać o uwzględnieniu objętości wewnętrznej tego łącznika oraz rurek przy określaniu czasu pobierania próbek (poniżej).
5. Konfiguracja pompy mD. Włącz pompę mD i prowadź przepływ z prędkością 1,5 μl/min, aż pojawi się dH₂wyjście z rurki odpływowej sondy. Następnie, przy wyłączonej pompie, połącz drugą linię między rurką odpływową a probówką do zbierania próbek. Przepuść przez rurkę 5 ml cieczy, a następnie umieść sondę w fiolce zawierającej sterylną dH2O₂0 przez noc; należy upewnić się, że końcówka sondy pozostaje cały czas zwilżona.
6. Przygotowanie obiektu badawczego przed właściwym pomiarem. Na 24 h przed badaniem należy usunąć z głowy szczura atrapy styletu i wprowadzić sondę mD (używaną wyłącznie w tym celu, nie do pobierania próbek) na 10 min. Następnie należy ponownie wprowadzić atrapy styletu i umieścić szczura w klatce. Procedura ta ma na celu zminimalizowanie wpływu reaktywnej gliozy w dniu badania.^11-12 a w naszych badaniach daje to dobre wyniki, które są zgodne z danymi uzyskanymi za pomocą innych technik i wydają się odzwierciedlać aktywację hipokampa^4-5,8,10,13inni stosowali podobne podejście, polegające na pozostawieniu sondy w miejscu pomiaru na 24 godziny przed dokonaniem odczytu, co jest również właściwą metodą, pod warunkiem uniknięcia uszkodzenia sondy w ciągu nocy.
7. Równoważenie sondy. W dniu mikrodializy należy napełnić strzykawkę Hamiltona oraz fiolkę scyntylacyjną przefiltrowanym aECF i przepompowywać ciecz przez 1 h w celu przeprowadzenia równoważenia. W razie potrzeby należy napełnić drugą strzykawkę Hamiltona przygotowanym preparatem do leczenia (np. insuliną-aECF) i umieścić ją w pompie strzykawkowej.
8. Wprowadzenie sondy. Po zakończeniu procesu równoważenia usuwa się prowadnik i ostrożnie wprowadza zrównoważoną sondę mD do mózgu szczura poprzez kaniulę. Szczura umieszcza się w przezroczystym plastikowym pudełku zawierającym część ściółki z jego klatki macierzystej. Należy zapewnić przeciwwagę dla przewodów: do rurek poza klatką przymocowuje się probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml wypełnioną wodą w taki sposób, aby siła grawitacji zapobiegała załamaniom linii mikrodializy, nie napinając ich jednocześnie. SONDĘ pozostawia się w mózgu szczura do równoważenia przez 2 h. Na początku tego okresu należy potwierdzić, że przepływ perfuzatu nie jest zablokowany: najłatwiej zrobić to poprzez zebranie odpływu perfuzatu w określonym czasie i zważenie próbki, aby potwierdzić, że z układu wypływa oczekiwana objętość. Każda sonda, która daje
9. Pobieranie próbek. Należy upewnić się, że korelacja między dializą próbki (z mózgu) a jej pobraniem (do probówki) jest dokładnie obliczona. Przykładowo, przy zastosowaniu dwóch metrów rurki FEP pomiędzy złączem obrotowym a sondą, całkowita objętość między sondą a miejscem poboru wynosi 30 μl, w związku z czym przy szybkości przepływu 1,5 μl/min próbka potrzebuje 20 min, aby przejść przez sondę, rurkę, złącza i złącze obrotowe i dotrzeć do końca rurki w celu pobrania. Podczas pobierania próbek należy upewnić się, że zebrano objętość wystarczającą do uzyskania stężenia niezbędnego dla przeprowadzanych analiz. W tym przypadku zastosujemy 5-minutowe interwały pobierania, gromadząc w każdej probówce 7,5 μl dializatu.
10. Próbki bazowe. Po zakończeniu równoważenia należy rozpocząć pobieranie próbek. Należy pobrać co najmniej trzy próbki podczas spoczynku szczura w komorze homeostatycznej, aby ustalić stabilną linię bazową pomiarów.
11. Czas podania leku. Należy starannie obliczyć wymagany czas rozpoczęcia podawania leku przed eksperymentem: należy pamiętać, że podobnie jak występuje opóźnienie czasowe między dializą a pobraniem próbki, istnieje opóźnienie (zazwyczaj identyczne) między momentem opuszczenia strzykawki przez perfuzat a jego dotarciem do hipokampa zwierzęcia. W związku z tym w naszej konfiguracji, przy objętości 30 μl między strzykawką a sondą, należy wymienić strzykawkę na taką zawierającą perfuzat z lekiem na 20 min przed planowanym rozpoczęciem dostarczania leku do hipokampa.
12. Wymiana strzykawek. W razie potrzeby można zastosować zawór przełączający, choć nie jest on konieczny: w odpowiednim momencie należy po prostu odłączyć linię dopływową od strzykawki z perfuzatem kontrolnym i szybko podłączyć ją do strzykawki z perfuzatem terapeutycznym. Czynność ta nie powinna zająć więcej niż 5 s, aby uniknąć znaczącej przerwy w przepływie perfuzatu. UWAGA proces ten należy odwrócić po podaniu pożądanej dawki, jeśli zamierzono ograniczyć czas podawania leczenia. Alternatywnie leczenie może być kontynuowane przez cały czas trwania pobierania próbek (patrz Rycina 2). Podczas wymiany strzykawek należy dopilnować, aby do linii nie dostały się pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one gromadzić się na membranie dializacyjnej i obniżać wydajność sondy.
13. Badania behawioralne. W przypadku wykonywania zadania behawioralnego należy postępować zgodnie z odpowiednią procedurą (patrz sekcja 4 poniżej). UWAGA że ważna jest koordynacja z podaniem leku do hipokampa. Przykładowo, podanie insuliny powinno zostać zaplanowane na 10 min przed rozpoczęciem testów ¹⁴Zatem przejście na perfuzat zawierający insulinę powinno nastąpić 30 min przed testami behawioralnymi (20 min na przepływ perfuzatu przez linie oraz 10 min pożądanego czasu podawania przed rozpoczęciem testów).
14. Zakończenie pobierania próbek. Po pobraniu wymaganych próbek ostrożnie wyjmij sondę z głowy zwierzęcia, pamiętając ponownie o uwzględnieniu opóźnienia czasowego między dializą a pobraniem próbki. Zwróć zwierzę do klatki macierzystej i uważnie obserwuj, czy po zakończeniu eksperymentu nie wystąpiły zmiany w stanie zdrowia lub zachowaniu, aż do momentu uśmiercenia zwierzęcia i wyjęcia mózgu w celu potwierdzenia prawidłowego umiejscowienia sondy. Jeśli uśmiercenie nie nastąpi niezwłocznie, wprowadź atrapy styla do kaniuli, aby zapobiec wprowadzeniu jakichkolwiek ciał obcych.
15. Analiza. Metodologia analityczna będzie różnić się w zależności od analizowanych substancji. Ponieważ pobieranie próbek metodą dializy nie pozwala na pełne wyrównanie stężeń analizitów na membranie sondy, stężenia w próbkach należy skorygować w celu wyznaczenia stężeń w płynie pozakomórkowym (ECF), stosując metodę zerowego przepływu netto (zero-net-flux method).^15,16.

4. Badania behawioralne

1. Umieszczenie w labiryncie. Po pobraniu próbek bazowych (t.j. po zakończeniu dializy co najmniej trzech próbek, które mogą wciąż znajdować się w drenie odpływowym w trakcie zbierania), delikatnie przenieś szczura do aparatury do testów behawioralnych. Można zastosować dowolne odpowiednie zadanie; dane w rysunku 1 zostały zebrane przy użyciu labiryntu w kształcie krzyża o czterech ramionach i pomiarze spontanicznej alternacji, która jest miarą pamięci roboczej przestrzennej: szczura umieszcza się początkowo w centrum labiryntu i pozwala mu na swobodną eksplorację^13,17-18. Ponieważ można zastosować dowolny test behawioralny, celem niniejszego protokołu nie jest konkretne zadanie użyte tutaj jako przykład (które zostało szczegółowo opisane w innym miejscu^13,19,20), lecz w skrócie: zwierzęta mogą eksplorować labirynt (okres zaznaczony szarym polem w rysunku 1) i wykorzystywać procesy zależne od hipokampa, aby zachować pamięć o tym, które ramiona zostały niedawno odwiedzone.
2. Ruch drenu dializacyjnego podczas testowania. Trzymaj dren w taki sposób, aby poruszał się swobodnie, nie utrudniając ruchu szczura i nie przesuwając się przed zwierzęciem, co mogłoby je rozproszyć. Pozostań w miejscu i ogranicz własne ruchy, aby nie wpływać na zachowanie szczura.
3. Kontynuacja pobierania próbek. Podobnie jak w przypadku próbek bazowych, przenoś dren odpływowy do nowej probówki co 5 min.
4. Testowanie alternacji. Pozwól zwierzęciu na swobodną eksplorację labiryntu przez 20 min. Zapisz sekwencję i czas wejść do ramion za pomocą nagrania wideo lub ręcznie w celu późniejszej analizy wyników zadania ^13,20.

5. Procedury po testowaniu

1. Końcowe pobieranie próbek. Po zakończeniu testów delikatnie wyjmij szczura z labiryntu i przenieś go z powrotem do komory kontrolnej. Kontynuuj pobieranie próbek mikrodializy, aż do uzyskania co najmniej czterech próbek, aby objąć okres regeneracji po wykonaniu zadania.
2. Usunięcie sondy. Po pobraniu wszystkich próbek delikatnie usuń sondę z głowy zwierzęcia i umieść ją w fiolce do przechowywania; zwróć zwierzę do jego klatki domowej.
3. Przechowywanie sondy. Po powrocie zwierzęcia do klatki domowej i zakończeniu pobierania pozostałego dializatu, dokładnie wypłucz sondę dH₂0 i przechowuj w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej dH₂0 i zakrytej parafilmem. Przepłucz cewkę, przełączając ją na strzykawkę zawierającą roztwór Kathon w dH₂0 w stosunku 1:10 000, aby zapobiec wzrostowi drobnoustrojów. Sondy można ponownie wykorzystywać, o ile zachowują dobry przepływ i membrana nie jest uszkodzona; przy zachowaniu ostrożności liczba użyć rutynowo przekracza dziesięć.
4. Histologia. Uśmierć zwierzę i wyjmij mózg. Wykonaj skrawki na kriostacie i zastosuj standardowe techniki histologiczne (np. barwienie fioletem krezylu), aby potwierdzić prawidłowe umiejscowienie sondy.

Wyniki

Szczury powinny szybko dojść do siebie po operacji i stać się czujne, mobilne oraz aktywne w ciągu 30 min od zakończenia znieczulenia. Wpływ nakrętki kaniuli powinien być minimalny, pod warunkiem że operacja została przeprowadzona starannie i użyto minimalnej ilości cementu dentystycznego. W przypadku zauważenia jakichkolwiek oznak infekcji podczas monitorowania pooperacyjnego lub jeśli szczur w jakikolwiek sposób wykazuje oznaki stresu bądź dyskomfortu, należy natychmiast przerwać eksperyment; powinno to zdarzyć się nie...

Dyskusja

Wszystkie roztwory stosowane w mikrodializie powinny zostać przefiltrowane bezpośrednio przed użyciem, przy użyciu filtra .2 μm. Po wprowadzeniu sondy do kaniuli prowadzącej należy upewnić się, że przepływ nie jest utrudniony i trwa pobieranie próbek. Jeśli przepływ ustanie po wprowadzeniu, najbardziej prawdopodobną przyczyną jest uszkodzenie membrany sondy wynikające z niewłaściwej ostrożności podczas aplikacji; w takim przypadku należy zastosować nową sondę.

Jak wspomniano powyżej, kluczową...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Większość odczynników jest standardowej czystości laboratoryjnej i może być zakupiona u dowolnego dostawcy. Podobnie sprzęt, taki jak pompy strzykawkowe i rurki, może pochodzić od różnych producentów. Specyficzne elementy użyte w tej procedurze, których szczegóły są istotne, obejmują:
Sondy do mikrodializy CMA 12	CMA/ Microdialysis	CMA-12-XXX	Są one dostępne w różnych długościach membran i zakresach odcięcia (cut-off), co jest oznaczone konkretnymi kodami w miejscu „XXX”.
Insulina ludzka (Humulin)	Eli Lilly	N/a
Przegub płynowy (liquid swivel)	Instech	375/D/22QM	Ten konkretny przegub charakteryzuje się bardzo niskim momentem obrotowym i objętością wewnętrzną oraz posiada niereaktywną wyściółkę kwarcową.