Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Podsumowanie

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Streszczenie

Sekwencyjne fotowybielanie stanowi nieinwazyjną metodę znakowania poszczególnych komórek Schwanna (SC) w obrębie złącza neuromięśniowego (NMJ). NMJ jest największą synapsą w układzie nerwowym ssaków i służy jako model prowadzący w badaniach nad strukturą i funkcją synaptyczną. W NMJ myszy zakończenia aksonów ruchowych tworzą przypominające precla miejsca kontaktu z włóknami mięśniowymi. Akson ruchowy i jego zakończenie są otoczone przez SC. W ciągu ostatnich dekad stworzono kilka linii myszy transgenicznych w celu wizualizacji neuronów ruchowych i SC, na przykład odpowiednio myszy Thy1-XFP¹ oraz Plp-GFP².

Wzdłuż aksonów ruchowych mielinizujące komórki Schwanna (SC) są rozmieszczone w postaci niepokrywających się segmentów (internodów), oddzielonych węzłami Ranviera, co umożliwia skokowe przewodzenie potencjału czynnościowego. Z kolei terminalne komórki Schwanna w synapsie są wyspecjalizowanymi komórkami glejowymi, które monitorują i wspomagają neurotransmisję, usuwają resztki komórkowe oraz prowadzą regenerujące się aksony. Złącza neuromięśniowe (NMJ) są ściśle pokryte przez do sześciu niemielinizujących terminalnych komórek Schwanna – nie można ich jednak rozdzielić w mikroskopii świetlnej, ponieważ znajdują się one w bezpośrednim kontakcie błonowym³.

Istnieje kilka podejść do indywidualnej wizualizacji terminalnych komórek SC. Żadne z nich nie jest jednak pozbawione wad. Na przykład wypełnianie barwnikiem, polegające na nakłuciu pojedynczych komórek mikroelektrodą wypełnioną barwnikiem, wymaga zniszczenia znakowanej komórki przed wypełnieniem kolejnej. Jest to niezgodne z późniejszymi zapisami w trybie poklatkowym³. Wielospektralne znakowanie komórek SC metodą „Brainbow” osiągnięto dzięki kombinatoryjnej ekspresji białek fluorescencyjnych⁴. Technika ta wymaga jednak połączenia kilku transgenów i jest ograniczona przez wzorce ekspresji stosowanych promotorów. W przyszłości alternatywą może okazać się ekspresja białek „fotoprzełączalnych” w komórkach SC⁵. Przedstawiamy tutaj sekwencyjne fotowybielanie, w którym pojedyncze komórki są wybielane, a ich obraz uzyskuje się metodą subtrakcji. Uważamy, że podejście to – ze względu na swoją łatwość i wszechstronność – stanowi trwały dodatek do instrumentarium technologicznego neurobiologa, zwłaszcza że może być stosowane in vivo i przenoszone na inne typy komórek, obszary anatomiczne lub gatunki⁶.

W poniższym protokole szczegółowo opisujemy zastosowanie sekwencyjnego wybielania i następującej po nim konfokalnej mikroskopii poklatkowej w odniesieniu do terminalnych SC w eksplantach mięśnia triangularis sterni. Ta cienka, powierzchowna i łatwa do wypreparowania preparacja nerwowo-mięśniowa^7,8 okazała się użyteczna w badaniach nad rozwojem, fizjologią i patologią NMJ⁹. Na koniec wyjaśniamy, w jaki sposób przygotowuje się mięsień triangularis sterni po fiksacji w celu przeprowadzenia skorelowanego obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, immunohistochemii lub badań ultrastrukturalnych.

Protokół

1. Eksplant mięśnia mostkowo-obojczykowatego (Rysunek 1)

Czas trwania: 15 min.

1. Przygotować instrumenty chirurgiczne: 2 pary pęset, 1 parę nożyczek, 1 parę nożyczek sprężynowych, 1 naczynie do hodowli tkanek (10 cm). Schłodzony (4 °C) roztwór Ringera uprzednio napowietrzany (minimum przez 15 min) mieszaniną 5% CO₂/ 95% O₂. Naczynie do hodowli tkanek o średnicy 15 cm wypełnić lodem i przykryć metalową płytką. Przygotować mikroskop sekcyjny i umieścić naczynie 15 cm z lodem pod mikroskopem, aby chłodzić eksplant podczas sekcji.
2. Mysz poddać letalnej anestezji poprzez przedawkowanie izofluranu (lub inną zatwierdzoną metodą uśmiercania). Myszy spryskać 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu eksplantu sierścią. Do bielenia SC wykorzystano myszy Plp-GFP, które mogą być krzyżowane z Thy1-OFP3 lub Thy1-Membow13 w celu jednoczesnej wizualizacji aksonu.
3. Używając dużych nożyczek, wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej nad mostkiem oraz dwa nacięcia równoległe do dolnej krawędzi klatki piersiowej.
4. Używając dużych nożyczek, usunąć skórę, otworzyć ścianę brzuszną i wykonać nacięcia równoległe do klatki piersiowej aż do kręgosłupa. Następnie wypreparować mięśnie piersiowe, wykonując nacięcia blisko ich przyczepu do mostka.
5. Przeciąć przeponę tuż poniżej chrząstki miecza mostka i wypreparować ją wzdłuż przyczepów żebrowych.
6. Trzymając klatkę piersiową za wyrostek mieczowaty za pomocą pęsety, rozpocząć odcinanie żeber od kręgosłupa, jak najbliżej ich przyczepów. Cięcia lewe i prawe powinny zbiegać się nad sercem w kierunku rękojeści mostka. Należy starać się nie przeciąć dużych naczyń krwionośnych (zwłaszcza żył podobojczykowych). Lepszą widoczność uzyskuje się poprzez delikatne uniesienie preparatu podczas trzymania wyrostka mieczowatego pęsetą.
7. Wykonać cięcie poprzeczne tuż poniżej rękojeści mostka i przenieść eksplant do naczynia 10 cm z schłodzonym, napowietrzonym 5% CO₂/ 95% O₂ roztworem Ringera. Naczynie 10 cm umieścić na metalowej płytce przykrywającej naczynie 15 cm wypełnione lodem. Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać pod mikroskopem sekcyjnym.
8. Używając małych nożyczek sprężynowych, usunąć pozostałości grasicy, opłucnej, przepony (wewnątrz) i mięśni piersiowych (na zewnątrz; Rysunek 1B-D).
9. Aby dopasować eksplant do naczynia 3,5 cm, wypreparować wszystkie żebra, które nie przyczepiają się do mostka. Najlepiej zrobić to za pomocą małych nożyczek sprężynowych, przecinając tkankę między żebrami (Rysunek 1E).
10. Przytwierdzić eksplant nerwowo-mięśniowy m. triangularis sterni do naczynia do hodowli tkanek o średnicy 3,5 cm pokrytego Sylgardem, używając szpilek minutien (skróconych do < 4 mm; Rysunek 1G). Dwie szpilki powinny przejść przez chrzęstne (białe) części mostka. Wbić co najmniej dwie szpilki przez żebra zarówno po lewej, jak i prawej stronie eksplantu, celując w miękkie części chrzęstne i unikając żeber znajdujących się pod lub blisko mięśnia trójkątnego. Im więcej szpilek zostanie użytych, tym lepiej (zazwyczaj stosuje się 8-10). Podczas przytwierdzania preparatu należy upewnić się, że żebra są nieco rozczłonkowane, co ustawi mięsień w lekko rozciągniętej pozycji.
11. Opcjonalnie: Zwizualizować miejsca synaptyczne zawierające receptory acetylocholinowe, dodając bungarotoksynę sprzężoną z barwnikami Alexa (stężenie 0,8 μg/ml w napowietrzonym 5% CO₂/ 95% O₂ roztworze Ringera). Inkubować przytwierdzony eksplant w naczyniu pokrytym Sylgardem przez 15-20 min w temperaturze pokojowej, a następnie kilkakrotnie przemyć napowietrzonym 5% CO₂/ 95% O₂ roztworem Ringera.

2. Odbarwianie komórek macierzystych (SCs) i opcjonalna mikroskopia time-lapse (Rysunek 2)

Czas trwania: 30 - 45 min + opcjonalnie 1 - 5 hr dla rejestracji time-lapse.

1. Przenieś naczynie 3,5-cm powlekane Sylgardem do mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser argonowy (długość fali 488 nm) i obiektywy immersyjne w wodzie (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA oraz 100x, 1.0 NA lub 60x, 0.9 NA).
2. Opcjonalnie dla mikroskopii time-lapse: Włóż naczynie 3,5-cm powlekane Sylgardem do pierścienia grzewczego, zainstaluj system superfuzji i sondę temperatury (Ryc. 2A). Upewnij się, że żadna z tych części nie dotyka eksplantu, krawędzi naczynia ani powłoki Sylgard. Podgrzej próbkę do 33-35 °C. W przypadku wybielania SC bez obrazowania time-lapse lepiej zastosować temperaturę pokojową, ponieważ komórki wykazują mniejszą dynamikę pomiędzy etapami wybielania.
3. Za pomocą obiektywu powietrznego 4x zaobserwuj wzorzec unerwienia mięśnia triangularis sterni i zlokalizuj pas płyt końcowych mięśnia triangularis sterni. Przełącz się na obiektyw z zanurzalnym stożkiem 20x i zacznij szukać obszarów powierzchownych w obrębie pasa płyt końcowych (dobrymi kandydatami są obszary nad żebrami). Zmień obiektyw na 100x lub 60x z zanurzalnym stożkiem, aby sprawdzić poszczególne NMJ. Idealna jest NMJ pokryta przez kilka SC i położona bardzo powierzchownie (Ryc. 2B). Jeśli planujesz obrazowanie time-lapse po wybielaniu, wybierz do 3 NMJ położonych stosunkowo blisko siebie, aby zwiększyć wydajność.
4. Wykonaj obraz konfokalny NMJ przed fotowybielaniem poszczególnych SC (Ryc. 2B). (W celu obrazowania w pełnej rozdzielczości, np. na mikroskopie Olympus FV1000, użyj obiektywu 100x, 1.0 NA i przybliżenia 2,5, co pozwala na próbkowanie ograniczone kryterium Nyquista na poziomie ~0,1 μm na piksel).
5. „Zaparkuj” wiązkę lasera 488 nm centralnie na jądrze SC, używając maksymalnej mocy przez 5 sekund (alternatywnie można zastosować wydajny wzór skanowania w małym obszarze zainteresowania, taki jak funkcja „tornado scan” w mikroskopie Olympus; ponieważ używamy mikroskopu konfokalnego, laser jest ogniskowany w płaszczyznach sprzężonych z obrazem, zatem przy 488 nm i obiektywie 1,0 N.A. średnica wynosi < 0,5 μm). Ponownie ustaw ostrość na komórkę i oceń efekt wybielania. W razie potrzeby powtórz etap wybielania, aż poziomy GFP zostaną zredukowane do wartości bliskich tłu. Wykonaj obraz po wybielaniu (Ryc. 2C). Kluczowe jest upewnienie się, że wybielany obszar znajduje się poza jakimkolwiek nakładaniem się dwóch komórek – jeśli występuje nakładanie, wybielanie w drugiej komórce będzie oczywiste.
6. Powtarzaj powyższy krok, aż wszystkie poza jedną SC zostaną wybielone (Ryc. 2D-E). Ostatnia „niewybielona” SC nadaje się do konfokalnej mikroskopii time-lapse. Zrekonstruuj pojedyncze komórki poprzez odejmowanie obrazów, np. za pomocą oprogramowania Photoshop, aby wyznaczyć morfologię i terytorium pojedynczej SC (Ryc. 2F). Pamiętaj, że odejmowanie dwóch obrazów generuje szum (np. poprzez importowanie ich w kolejnych „warstwach” w Photoshopie, a następnie ustawienie górnego kanału na „difference” w menu rozwijanym na górze karty kanałów). Można tego uniknąć, stosując funkcję „despeckle” na kanałach przed odejmowaniem i wycinając tło, które ewidentnie nie pochodzi z wybielonej komórki. Aby zoptymalizować kontrast, konieczna może być regulacja jasności obu kanałów w oknie „levels”. Uzyskany obraz wybielonej komórki zostaje nałożony na oryginalny obraz synapsy, nadany unikalny pseudokolor i uczyniony przezroczystym, aby pokolorować terytorium wybielonej komórki na oryginalnym obrazie (wykonanie tego dla wszystkich wybielonych oraz ostatniej, niewybielonej komórki daje obraz przedstawiony na Ryc. 2F).
7. Opcjonalnie: Rozpocznij konfokalną mikroskopię time-lapse po wybieleniu wszystkich poza jedną SC. Wykonuj obrazy w stałych odstępach czasu (na przykład co 5 do 10 min). Używaj jak najmniejszej mocy lasera. W jednej sesji można obrazować do 3 NMJ.
8. Stwórz mapę NMJ z obrazowania time-lapse, wykonując obraz przy 100x bez przybliżenia, a następnie obrazy regionu przy użyciu obiektywów 20x i 4x (Ryc. 2G-I). Ta „mapa” jest niezbędna do odnalezienia NMJ po immunohistochemii utrwalonego mięśnia.
9. Do przetwarzania obrazów przekształć poszczególne obrazy w projekcje maksymalnej intensywności i zapisz w formacie tiff. Połącz wszystkie punkty czasowe z projekcji z osi z w stos i wyrównaj w osiach xy, np. używając wtyczki „stackreg”¹⁰ w programie Fiji (pakiet oparty na oprogramowaniu open source ImageJ; National Institutes of Health).

3. Fixacja i immunohistochemia (Rysunek 3)

Czas trwania: przez noc.

1. Przenieś eksplant do probówki reakcyjnej o pojemności 50 ml zawierającej co najmniej 15 ml 4% PFA, ostrożnie usuwając piny. Przeprowadź post-fiksację przedniej ściany klatki piersiowej z mięśniem triangularis sterni przez 1 hr w lodzie. Przepłucz utrwaloną tkankę 0,1 M glicyną w PBS (aby zneutralizować pozostałości utrwalacza i tym samym zmniejszyć tło) przez co najmniej 10 min. Na tym etapie próbki można przechowywać i przetworzyć później.
2. Przenieś utrwalony eksplant do naczynia hodowli tkankowej o średnicy 10 cm powleczonego Sylgardem i wypełnionego 0,01 M PBS. Wytnij kształt trapezu, w którym jedna strona jest równoległa do mostka, a druga przebiega przez przejścia kość-chrząstka – w tym obszarze na powierzchni znajduje się mięsień triangularis. Usuń dolne żebra, wykonując cięcie poziome (tzn. transsternalne), tak aby uzyskać swobodny dostęp do końca ogonowego mięśnia triangularis (Ryc. 3A-D).
3. Wprowadź igłę hipodermiczną jako pin w górną część trapezu (Ryc. 3E). Używając igły hipodermicznej przymocowanej do strzykawki 1 ml oraz pęsety, usuń znajdujący się na powierzchni mięsień triangularis, delikatnie trzymając za kąt ogonowy mięśnia i używając igły jako mikroskalpela. Upewnij się, że cięcia są wykonywane równolegle do płaszczyzny ściany klatki piersiowej. Po uwolnieniu części ogonowej mięśnia wprowadź kolejną igłę hipodermiczną jako pin pod mięsień, przez ścianę klatki piersiowej – unieruchomi to preparat i pozwoli na delikatne pociągnięcie mięśnia za pomocą pęsety (Ryc. 3F). Podczas przecinania przyczepów tkanki łącznej „odklejaj” mięsień od klatki piersiowej. Przetnij ostatni przyczep ogonowy nożyczkami sprężynowymi. Usuń pozostałości tłuszczu i naczyń krwionośnych za pomocą pęsety. Zachowaj ostrożność, aby nie zerwać nerwów. Uwaga: Do pracy z tkanką żywą i utrwaloną należy używać oddzielnych zestawów narzędzi i naczyń.
4. Rozpocznij immunohistochemię (zgodnie ze standardowym protokołem), przenosząc próbki tkanki do roztworu blokującego na 1 hr na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Minimalna objętość do barwienia w płytce 96-dołkowej wynosi 200 μl.
5. Nałóż przeciwciało pierwotne rozcieńczone w roztworze blokującym, 200 μl na dołek, przez noc w 4 °C na wytrząsarce.
6. Przepłucz w 0,01 M PBS trzy razy po 10 min.
7. Nałóż odpowiednie przeciwciało wtórne rozcieńczone w roztworze blokującym na 1-2 hr w temperaturze pokojowej.
8. Przepłucz w 0,01 M PBS trzy razy po 10 min.
9. Zamontuj w medium antyblaknącym (np. Vectashield) i przykryj szkiełkiem cover-slip.
10. Umieść preparat na magnetycznej płytce metalowej, połóż magnes na próbce, aby ją spłaszczyć przez kilka godzin lub przez noc w 4 °C. Uszczelnij lakierem do paznokci.

Wyniki

Przykład eksplantu mięśnia triangularis sterni przygotowanego do obrazowania w szalce pokazano na Rysunku 1G. Eksplant ten jest szczególnie odpowiedni do obrazowania złącza neuromięśniowego (NMJ) ex vivo, ponieważ mięsień triangularis składa się tylko z kilku warstw włókien mięśniowych. Pozwala to na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości z eksplantów pochodzących z transgenicznych linii myszy, które podkreślają komórki Schwanna (SCs) (Plp-GFP²) i/lub aksony (Thy1

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda wybiaszania komórek SC jest prosta, szybka i wszechstronna: (i) umożliwia ujawnienie morfologii i dynamiki pojedynczej komórki SC za pomocą mikroskopii konfokalnej w oparciu o pojedynczy transgen – co stanowi istotną zaletę przy łączeniu tego podejścia np. z modelami chorób wymagającymi dodatkowych alleli. (ii) Metoda jest szybka, ponieważ od momentu sekcji do fiksacji można ją przeprowadzić w ciągu pół dnia. (iii) Zakres zastosowań jest szeroki, gdyż można ją łączyć z innymi metodami,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70% (obj./obj.) roztwór etanolu	Roth	T913.1	w butelce z atomizerem
izofluran	Forene, Abbott		można zastosować jakikolwiek inny zatwierdzony środek znieczulający do przeprowadzenia eutanazji przez znieczulenie
myszy transgeniczne (Plp-GFP)			należy pozyskać z cytowanych źródeł
mikroskop stereoskopowy z oświetleniem zimnym	Olympus SZ51		wyposażony w Schott KL 1500 LCD
pinceta nr 2	Fine Science Tools	11233-20
pinceta nr 5	Fine Science Tools	11295-00
nożyczki medyczne, duże	Fine Science Tools	14108-09
nożyczki, małe zakrzywione sprężynowe	Fine Science Tools	15033-09
podgrzewacz przepływowy	Warner Instruments	SF-28
pierścień grzejny do naczyń o średnicy 3,5 cm	Warner Instruments	64-0110 DH-35
dwukanałowy system kontroli temperatury	Warner Instruments	TC-344B
system pompy do superfuzyjnej perfuzji			wykonany na zamówienie
szalka hodowlana o średnicy 15 cm	Sarstedt	83.1803.003	wypełnione lodem i przykryte metalową płytką
szalka do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm	Sarstedt	83.1802.003	z natlenionym roztworem Ringera
szalka hodowlana o średnicy 3,5 cm	Sarstedt	83.1800.003	wypełnione polimerem Sylgard
polimer Sylgard	Dow Corning	Zestaw do przygotowania elastomeru silikonowego Sylgard 184
mikroskop konfokalny	Olympus	FV1000	z laserem argonowym
probówka reakcyjna o pojemności 50 ml	Sarstedt	62.547.254 PP
4% PFA w PBS	Sigma	P6148
kaniula 0,5 mm x 25 mm	Neolab	E-1510
strzykawka 1 ml	Neolab	E-1496
przeciwciało przeciwko synaptofizynie	Invitrogen	18-0130	królik
przeciwciało wtórne	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
płytka 24-dołkowa	Sarstedt	83.1836
0,01 M PBS	Sygma	P4417
0,1 M glicyna w PBS	Roth	3790.1
szkiełka coverglass	Neolab	E-4132
preparaty	Neolab	E-4121
Vectashield	Vector labs	H-1000
piny do mikro manipulacji ×10	Fine Science Tools	26002-20	skrócone do &< 4 mm
α-Bungarotoksyna sprzężona z Alexa 594	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
Roztwór blokujący
0,01 M PBS
0,2% Triton-X100	Roth	3051.3
10% normalne serum kozie	Abcam	ab7481
1% albuminy surowicy bydlęcej	Sigma	A7030
roztwór Ringera napowietrzony 95% O22 /5% CO22
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2,5 mM KCl	Sigma	P9333
1,25 mM NaH2Sekwencyjne fotowybielanie stanowi nieinwazyjny sposób znakowania poszczególnych komórek Schwanna (SC) w obrębie połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). NMJ jest największą synapsą w układzie nerwowym ssaków i służy jako model wiodący do badania struktury i funkcji synaptycznych. W NMJ myszy zakończenia aksonów ruchowych tworzą z włóknami mięśniowymi miejsca kontaktu przypominające precla. Akson ruchowy i jego zakończenie są otoczone przez komórki SC. W ciągu ostatnich dekad stworzono kilka linii myszy transgenicznych umożliwiających wizualizację neuronów ruchowych i komórek SC, na przykład odpowiednio myszy Thy1-XFP1 i Plp-GFP. Wzdłuż aksonów ruchowych mielinizujące komórki SC są rozmieszczone w niezachodzących na siebie internodach, oddzielonych węzłami Ranviere’a, co umożliwia skokowe przewodzenie potencjału czynnościowego. Z kolei terminalne komórki SC w synapsie są wyspecjalizowanymi komórkami glejowymi, które monitorują i wspomagają neurotransmisję, usuwają resztki komórkowe i prowadzą regenerujące się aksony. NMJ są ściśle pokryte przez do sześciu niemielinizujących terminalnych komórek SC – nie można ich jednak rozróżnić pojedynczo za pomocą mikroskopii świetlnej, ponieważ pozostają one w bezpośrednim kontakcie błonowym. Istnieje kilka metod pozwalających na indywidualną wizualizację terminalnych komórek SC, jednak żadna z nich nie jest doskonała. Na przykład wypełnianie barwnikiem, w którym pojedyncze komórki są nakłuwane mikroelektrodą wypełnioną barwnikiem, wymaga zniszczenia znakowanej komórki przed wypełnieniem kolejnej. Jest to niezgodne z późniejszymi rejestracjami time-lapse. Wielospektralne znakowanie komórek SC metodą „Brainbow” osiągnięto poprzez kombinacyjną ekspresję białek fluorescencyjnych. Technika ta wymaga jednak połączenia kilku transgenów i jest ograniczona wzorcem ekspresji użytych promotorów. W przyszłości alternatywą może stać się ekspresja białek „fotoprzełączalnych” w komórkach SC. Przedstawiamy tutaj metodę sekwencyjnego fotowybielania, w której pojedyncze komórki są wybielane, a ich obraz uzyskuje się poprzez odejmowanie. Uważamy, że podejście to – ze względu na prostotę i wszechstronność – stanowi trwały dodatek do instrumentarium technologicznego neurobiologa, zwłaszcza że może być stosowane in vivo i przeniesione na inne typy komórek, obszary anatomiczne lub gatunki. W poniższym protokole szczegółowo opisujemy zastosowanie sekwencyjnego wybielania i następującej po nim konfokalnej mikroskopii time-lapse w odniesieniu do terminalnych komórek SC w eksplantach mięśnia trójkątnego piersiowego (m. triangularis sterni). Ten cienki, powierzchowny i łatwy do wypreparowania preparat nerwowo-mięśniowy okazał się użyteczny w badaniach rozwoju, fizjologii i patologii NMJ. Na koniec wyjaśniamy, w jaki sposób przygotowuje się mięsień trójkątny piersiowy po utrwaleniu, aby przeprowadzić skorelowane obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości, immunohistochemię lub badania ultrastrukturalne.4	Sigma	S8282
26 mM NaHCO33	Sigma	S6297
2 mM CaCl22	Sigma	21114
1 mM MgCl22	Sigma	63020
20 mM glukozy	Sigma	G7528
Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt.