Artykuł metodologiczny

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

DOI:

10.3791/50011

⸱

3 stycznia 2013

 ,  , 
1Life Science Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu. Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne badanie normalnego zachowania ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) i tego, jak normalne komórki nabywają nieprawidłowych właściwości, może być ułatwione przez systemy hodowli in vitro, które dokładniej modelują biologię in vivo. Wykorzystanie materiału pochodzącego od człowieka do badania różnicowania komórkowego, starzenia się, starzenia i nieśmiertelności jest szczególnie korzystne, biorąc pod uwagę wiele znaczących różnic molekularnych w tych właściwościach między ludzkimi a powszechnie wykorzystywanymi komórkami gryzoni1-2. Komórki sutka stanowią wygodny system modelowy, ponieważ ze względu na częstotliwość operacji mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii dostępne są duże ilości normalnych i nieprawidłowych tkanek.

Gruczoł sutkowy składa się ze złożonej domieszki wielu różnych typów komórek, np. nabłonkowych, tłuszczowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych. Komórki nabłonkowe są odpowiedzialne za zróżnicowaną funkcję sutka w laktacji, a także są źródłem zdecydowanej większości ludzkich nowotworów piersi. Opracowaliśmy metody przetwarzania tkanek odrzuconych chirurgicznie gruczołu sutkowego na czyste składniki nabłonka, a także komórki mezenchymalne3. Przetworzony materiał może być przechowywany w stanie zamrożonym w nieskończoność lub zainicjowany do hodowli pierwotnej. Materiał chirurgiczny jest transportowany do laboratorium i ręcznie preparowany w celu wzbogacenia o tkankę zawierającą nabłonek. Późniejsze trawienie wypreparowanej tkanki za pomocą kolagenazy i hialuronidazy usuwa materiał zrębu z nabłonka przy błonie podstawnej. Powstałe małe kawałki drzewa nabłonkowego (organoidy) można oddzielić od strawionego zrębu poprzez sekwencyjną filtrację na membranach o stałej wielkości porów. W zależności od wielkości porów można uzyskać frakcje składające się z większych fragmentów przewodowych/pęcherzykowych, mniejszych skupisk pęcherzyków płucnych lub komórek zrębu. Zaobserwowaliśmy lepszy wzrost, gdy kultury są inicjowane jako organoidy, a nie jako zdysocjowane pojedyncze komórki. Umieszczenie organoidów w hodowli przy użyciu pożywek indukujących stres wspiera długoterminowy wzrost prawidłowego HMEC z markerami wielu typów linii (mioepitelialny, luminalny, progenitor)4-5. Z tkanki jednej osoby można uzyskać wystarczającą liczbę komórek, aby umożliwić szeroko zakrojone badanie eksperymentalne przy użyciu standaryzowanych partii komórek, a także przesłuchanie przy użyciu metod o wysokiej przepustowości.

Hodowlane HMEC zostały wykorzystane w wielu różnych badaniach badających normalne procesy rządzące wzrostem, różnicowaniem, starzeniem się i starzeniem oraz jak te normalne procesy są zmieniane podczas transformacji nieśmiertelności i złośliwości4-15,16. Efekty wzrostu w obecności materiału macierzy zewnątrzkomórkowej, innych typów komórek i/lub hodowli 3D można porównać ze wzrostem na plastiku5,15. Hodowany HMEC, zaczynając od normalnych komórek, zapewnia eksperymentalnie wykonalny system do badania czynników, które mogą napędzać lub zapobiegać starzeniu się człowieka i kancerogenezie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przetwarzanie i trawienie tkanek

  1. Uzyskaj ludzką tkankę sutka jako materiał do odrzucenia z zabiegów chirurgicznych. Mammoplastyka redukcyjna może zapewnić normalne lub łagodne komórki; Gruczolakowłókniaki i ginekomastie dostarczają łagodnych komórek; Tkanki nienowotworowe po mastektomii (obwodowe lub przeciwległe do guza lub podskórne) dostarczają komórek, które mogą wahać się od normalnych przez łagodne do zawierających mikroguzy. Upewnij się, że istnieje odpowiednia zgoda IRB przed uzyskaniem wyrzuconego materiału. Cały materiał powinien być poddawany obróbce zgodnie z przepisami dotyczącymi patogenów przenoszonych przez krew.
  2. Umieścić materiał w sterylnych pojemnikach zawierających bufor lub pożywkę (np. 1:1 Zmodyfikowane podłoże Orła Dulbecco i F-12 szynki) uzupełnione 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml fungizonu, 50U/ml polimyksyny B i 10% płodowej surowicy bydlęcej i przetransportować do laboratorium w temperaturze 4 °C. Tkanka mammoplastyki redukcyjnej może być przechowywana lub wysyłana w temperaturze 4 °C przez 72 godziny bez znaczącego wpływu na późniejszą żywotność komórek. Małe fragmenty nieredukcyjnej tkanki mammoplastyki mogą wymagać szybszego przetworzenia.
  3. Oddziel obszary nabłonka od macierzy zrębu tkanki tłuszczowej, tkanki łącznej i naczyń krwionośnych za pomocą kombinacji sterylnego skalpela, kleszczy i nożyczek. Wytnij kawałki chusteczki nożyczkami i umieść w dużym szklanym sterylnym naczyniu (np. 150 mm). Delikatnie wypreparuj obszary nabłonka, które wyglądają jak białe pasma osadzone w bardziej żółtej macierzy zrębu, używając kleszczy do przytrzymania materiału i skalpela do zeskrobania grubo tłustego materiału. Aby ułatwić trawienie, pokrój tkankę nabłonkową na mniejsze kawałki o wielkości ~3-4 mm za pomocą przeciwstawnych skalpeli i umieść w probówce o pojemności 50 ml. Jeśli przetwarzane są duże ilości tkanki, mogą być potrzebne świeże ostrza skalpela. Usuń materiał tłuszczowy z naczynia w celu utylizacji zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    1. W tkankach silnie włóknistych (np. mastektomia podskórna z ciężką chorobą włóknisto-torbielowatą) będzie więcej jednolitego białego, nienabłonkowego materiału. Wypreparowanie komórek nabłonkowych z takich włóknistych matryc może być trudne. Duże kawałki materiału włóknistego można pokroić na mniejsze kawałki o powierzchni ~1-3 mm kwadratowej i trawić osobno.
  4. Wypreparowaną tkankę nabłonkową umieścić w stożkowej probówce wirówkowej (50 ml lub 15 ml), przy czym tkanka ta stanowi nie więcej niż jedną trzecią objętości probówki. Doprowadzić probówkę do pełnej objętości, pozostawiając tylko niewielką przestrzeń powietrzną, aby umożliwić mieszanie podczas rotacji, przy użyciu mieszaniny do trawienia tkankowego (DME/F-12 lub równoważny, 10 μg/ml insuliny, antybiotyki jak powyżej, i końcowe stężenie 10% FCS, 200 U/ml surowej kolagenazy i 100 U/ml hialuronidazy.
  5. Umieść probówki na rotatorze rurowym HulaMixer i obracaj o 360° przy 8 obr./min przez noc w temperaturze 37 °C.
  6. Probówki wirówkowe o stężeniu 600 x g przez 5 min. Odrzucić sklarowany tłuszcz i pożywkę do usunięcia zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  7. Sprawdzić, czy trawienie zostało zakończone, rozcieńczając małą porcję osadu w pożywce. Trawienie jest zakończone, gdy badanie mikroskopowe pokazuje grudki komórek (organoidy) z gładko wyglądającymi strukturami przewodowymi, pęcherzykowymi lub przednio-pęcherzykowymi wolnymi od przyczepionego zrębu (ryc. 1A). Tkanki mammoplastyki redukcyjnej zwykle nadal wykazują przyczepiony zrąb po całonocnym trawieniu i będą wymagały dodatkowego czasu trawienia.
    1. Zawiesić niecałkowicie strawiony osad w mieszaninie do wytrawiania świeżych tkanek i ponownie inkubować z rotacją w temperaturze 37 °C przez kolejne 4-12 godzin. Powtórzyć kroki 1.6 i 1.7. Jeżeli trawienie jest nadal niepełne, ponownie dodać mieszaninę wytrawiającą do osadu i ponownie inkubować z rotacją w temperaturze 37 °C przez noc. Stężenie enzymów może zostać zmniejszone, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu przez noc.
  8. Po zakończeniu trawienia odwirować probówki o sile 600 x g przez 5 minut, odessać mieszankę wytrawiania, ponownie zawiesić osad w pożywce plus antybiotyki w probówce o pojemności około 15 ml/50 ml, probówka 5 ml/15 ml.

2. Filtracja i zamrażanie strawionego materiału

  1. Przenieść porcje zawieszonego osadu na sterylne sitko o średnicy 100 μm na sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Pozwól pożywce spłynąć do probówki, a następnie ponownie umyj organoidy na wierzchu 1-2 razy 2-3 ml pożywki. Powtarzać tę czynność, aż cała zawieszona osadka zostanie przeniesiona. Jeśli na filtrze znajduje się zbyt wiele organoidów, a podłoże nie spływa już łatwo, należy użyć nowego filtra (filtrów) dla pozostałego materiału. Ostrożnie przełóż filtr(y) na inną sterylną probówkę i umyj organoidy w probówce większą ilością pożywki. Jest to pula organoidów o wielkości 100 μm.
  2. Pobrać materiał, który odsączył się do oryginalnej probówki o pojemności 50 ml i powtórzyć proces opisany w ppkt 2.1 przy użyciu sitka o średnicy 40 μm, aby uzyskać pulę organoidów o objętości 40 μm, która zawiera głównie struktury pęcherzykowe płuc. Materiał, który spływa do rurki, stanowi pulę filtratu, która zawiera pojedyncze/małe grudki komórek mezenchymalnych i nabłonkowych oraz małe fragmenty układu krwionośnego.
  3. Granulować baseny o wielkości 100 μm, 40 μm i filtrować przy 600 x g przez 5 minut.
  4. Odessać supernatant, rozpuścić każdą probówkę w CPM II (DME/F-12 lub równoważnym z 44% FCS i 6% DMSO), używając około 1 ml CPMII na 0,1 ml wypełnionego osadu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Wysiewać naczynie testowe do 2 pul organoidów, umieszczając 0,1 ml ponownie zawieszonego materiału w plastikowym naczyniu z kulturą tkankową o średnicy 35 mm, kropla po kropli, jak w ppkt 3.2 poniżej. Pula filtratu może być bezpośrednio wysiewana na tworzywie sztucznym do hodowli tkankowych za pomocą pożywki fibroblastów (DME/F-12 lub równoważny z 10 μg/ml insuliny i 10% FBS).
  6. Pozostałą zawiesinę zawiesiny rozdzielić na ampułki do zamrażania typu Nunc (ampułka 1 ml/2 ml). Zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C, a następnie niezwłocznie przenieść do przechowywania w ciekłym azocie. Nie zaobserwowaliśmy żadnej znaczącej utraty żywotności w naszych oryginalnych ampułkach przechowywanych w stanie zamrożonym od końca lat 70-tych.

3. Wysiewanie mrożonych organoidów i subkultur kultur pierwotnych

  1. Zamrożoną ampułkę zawierającą organoidy należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zasiać organoidy na 2 do 10 (zwykle ~6) szalek o średnicy 60 mm lub 1-3 szalek o średnicy 100 mm, w zależności od wizualnego oszacowania liczby organoidów w ampułce. Optymalna jest około 20-40 organoidów wysianych na szalkę o średnicy 60 mm.
  2. Rozmrożone organoidy są ostrożnie umieszczane, kropla po kropli, na powierzchni naczynia za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub pipety Pasteura w celu równomiernego rozprowadzenia organoidów. Organoidy umieszczone blisko siebie będą miały ograniczoną przestrzeń do wzrostu, co spowoduje powstanie mniejszej liczby komórek do subhodowli lub zamrożenia. Unikaj drapania powierzchni naczynia (komórki zwykle nie rosną poza porysowane powierzchnie). Odczekaj 1-2 minuty, aby organoidy mogły się przyczepić, a następnie powoli dodaj pożywkę wzrostową, aby uniknąć przemieszczenia organoidów (np. szalka 2-3 ml/60 mm). Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze CO2 . To są kultury podstawowe. Obecnie używamy pożywki M87A + oksytocyny(X) w celu uzyskania najbardziej niezawodnego wzrostu HMEC (ryc. 2).
  3. Po 1 dniu sprawdź, czy organoidy są przymocowane. Dodaj dodatkowe podłoże (np. naczynie 2-3 ml/60 mm). Migracja komórek z organoidów powinna być widoczna po 24-48 godzinach, a wzrost mitotyczny po 48-72 godzinach od wysiewu (ryc. 1B, C). Czasami przyczepienie jest słabe po 24 godzinach, szczególnie w przypadku posiewu nadmiernie strawionych organoidów lub organoidów od starszych kobiet, ale większość preparatów przyczepia się w ciągu 72 godzin. Małe fragmenty układu krwionośnego mogą przyczepiać się i powodować rozrost komórek fibroblastów (ryc. 1D).
  4. Karm kultury co najmniej 3 razy w tygodniu. Komórki wyhodowane na pożywce typu M87A rosną do prawie konfluencji w ciągu 5-8 dni, w zależności od gęstości wysiewu.
  5. Jeśli występuje znaczny wzrost fibroblastów, do usunięcia fibroblastów potrzebna jest trypsynizacja różnicowa (DT), oparta na szybkim oderwaniu fibroblastów od powierzchniowego tworzywa sztucznego. Gdy plamy nabłonkowe staną się duże, odessać pożywkę, umyć naczynie (np. naczynie 1-2 ml/60 mm) STE (sól fizjologiczna, 0,05% trypsyna, 0,02% EDTA), aspirat, dodać świeże 0,5 ml STE i pozostawić w temperaturze pokojowej na około 1 minutę z ciągłą obserwacją mikroskopową. Kiedy fibroblasty odkleją się, ale komórki nabłonkowe nadal przylegają, delikatnie, ale ostro uderz bokiem naczynia o twardą powierzchnię, aby usunąć fibroblasty, a następnie szybko aspiruj. Umyj raz PBS i ponownie odessać. Kultury silnie zanieczyszczone fibroblastami mogą wymagać dodatkowego DT.
  6. Subkultura kultur pierwotnych, gdy obecne są duże plamy nabłonka, ale przed konfluencją. Gęstość wysiewu i przyczepiania organoidów będzie miała wpływ na wymagany czas. Aby zachować kulturę pierwotną i wygenerować wiele kultur wtórnych, rozłożonych w czasie, przeprowadzamy częściowe trypsynizacje (PT).
  7. Odessać pożywkę, umyć naczynie o średnicy 60 mm 1-2 ml STE, dodać 0,5 ml świeżego STE do naczynia. Obserwuj odrywanie komórek pod mikroskopem w temperaturze pokojowej przez 1-5 minut, delikatnie stukając w naczynie, aby przyspieszyć odwarstwienie komórek. Trypsynizację należy przerwać, gdy ~50% komórek się odłączy. Wczesne PT zwykle mają szybkie odwarstwienie komórek. W przypadku późniejszych PT ogniwa można umieścić w temperaturze 37 °C w celu szybszego odłączenia, przy uważnym monitorowaniu, ponieważ wszystkie ogniwa mogą szybko odpadnąć.
  8. Dodać 2 ml pożywki zawierającej surowicę do naczynia, ponownie odpipetować do umycia i przenieść do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Powtórz 2x z kolejnym ~1-2 ml pożywki, dodając płyn do probówki. Nakarm ponownie naczynie pierwotne i wróć do inkubatora. Policz komórki w probówce za pomocą hemocytometru. PT można powtórzyć około 4 do 8 razy z dobrym odrostem komórek w podstawowych szalkach i równoważnym długotrwałym wzrostem z subhodowlanych lub zamrożonych wtórnych (komórki drugiego pasażu nazywane są wtórnymi; po subhodowli komórki nie są już pierwszorzędowe). Gdy materiał organoidowy nie jest już obecny w kulturach pierwotnych, subkulturowe rośliny wtórne wykazują spadek długoterminowego potencjału podwojenia populacji.
    1. W przypadku subkultur do wtórnych, komórki nasienne bezpośrednio z probówki do naczyń. Wysiew 1-2 x 105 komórek/100 mm szalki w wytrzymałym podłożu, takim jak M87A+X, doprowadzi do konfluencji w ciągu 4-7 dni. Dodajemy toksynę do pożywki przy drugim pasażu, aby zwiększyć potencjał proliferacyjny; Toksyna jest pomijana w hodowli pierwotnej, ponieważ prowadzi do wielowarstwowego wzrostu komórek z organoidów.
    2. Do zamrożenia jako substancje wtórne, probówkę z granulkami o pojemności 600 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w CPMII o końcowej gęstości 10-6 komórek/ml. Podwielokrotność zawieszonych komórek w ampułkach zamrażających typu Nunc, zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C, a następnie niezwłocznie przenieść do przechowywania w ciekłym azocie.
  10. Zaleca się zamrażanie komórek z pierwszego PT na przechowanie i używanie komórek z drugiego PT do subhodowli. Dodatkowe PT mogą być przechowywane w stanie zamrożonym do wykorzystania w przyszłości.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne liczby dla tkanek odpowiednio trawionych do organoidów i umieszczanych w hodowli są pokazane na rysunku 1. Niecałkowicie strawiona tkanka będzie wykazywać materiał nadal przyczepiony na zewnątrz tych struktur i prawdopodobnie będzie miała pewien wzrost komórek fibroblastycznych w hodowli pierwotnej, wymagając usunięcia DT. Nadmierna trawiona tkanka będzie wykazywać mniej gładkie granice zewnętrzne i może potrzebować więcej czasu, aby przyczepić się w hodowli pierwotnej. Rozrost nabłonka powinien rozpocząć się w ciągu 48-72 godzin (ryc. 1B,C). Małe fragmenty układu krwionośnego (ryc. 1D) mogą być źródłem rozrostu komórek mezenchymalnych. Wyrostki nabłonkowe wykazują morfologicznie niejednorodne populacje, z populacjami proliferacyjnymi, które zawierają mieszaniny komórek z markerami związanymi z liniami mioepitelialnymi, progenitorowymi i luminalnymi (Figura 1E, 3C-E). Wzrost w pożywkach o niskim poziomie stresu, takich jak M87A, uzupełniony toksyną i oksytocyną, będzie wspierał lepszy długoterminowy wzrost normalnego HMEC przed zastojem w porównaniu z poprzednimi preparatami pożywek (Figura 2). Pożywki typu M87A będą również wspierać wzrost komórek luminalnych i progenitorowych przez pasaże 4-8 (ryc. 3C-E, 4); Następnie większość komórek wykazuje tylko markery linii mięśniowo-epitelialnej. HMEC hodowany na plastiku może zachować zdolność do tworzenia prawidłowej samoorganizacji 3D w mikrostudzienkach 3D z mikrowzorami mikrowzorcowymi, z komórkami luminalnymi wewnątrz komórek mioepitelialnych (Figura 4A, B) oraz do tworzenia zorganizowanych struktur po posianiu w Matrigel (Rysunek 4C, D).

figure-results-1
Rysunek 1. Organoidy HMEC i hodowla pierwotna. (A) Organoid wykazujący strukturę przewodowo-pęcherzykową po trawieniu i filtracji. (B,C) Organoidy wykazujące strukturę przewodową i pęcherzykową 2 dni po umieszczeniu w hodowli pierwotnej; Zwróć uwagę na początkowy wyrost komórki (białe strzałki). (D) Małe naczynie krwionośne połączone i z początkowym wzrostem fibroblastów z tych samych kultur co B,C. (E) Przerost komórek nabłonkowych z pierwotnej hodowli organoidów po 4 dniach. Linie są identyfikowane przez barwienie przeciwciałami przeciwko K14 (czerwony) i K19 (zielony); jądra barwiono DAPI (na niebiesko). Widoczne są komórki luminalne (K14-/K19+, zielone), mioepitelialne (K14+/K19-, czerwone) i progenitorowe (K14+/K19+, żółte). Niebarwione komórki obserwuje się w rdzeniu organoidu z powodu niepełnej penetracji przeciwciał.

figure-results-2
Rysunek 2. Wzrost kultur HMEC w różnych preparatach pożywek. Organoidy uzyskane od jednego osobnika, okazu 184, zainicjowano w hodowli pierwotnej przy użyciu różnych preparatów pożywki. Najlepszy długoterminowy wzrost uzyskuje się przy użyciu naszego najnowszego preparatu, M87A+oksytocyna(X)4. Pożywka ta wspiera również wzrost wielu linii HMEC (patrz rys. 1E). Wcześniejsza pożywka, MM3, zapewniała mniej silny wzrost, podczas gdy pożywka bez surowicy, MCDB170 (komercyjny MEGM)17 prowadzi do szybkiej indukcji inhibitora kinazy cyklinowejp16 INK4A i selekcji do nieprawidłowych komórek7,11,13.

figure-results-3
Rysunek 3. Porównanie różnorodności linii w organoidach niehodowlanych i hodowanych HMEC w 4pasażu. (A,B) analiza FAC niehodowlanego, enzymatycznie zdysocjowanego organoidu pod kątem (A) ekspresji EpCAM i integryny CD49f/alfa 6 oraz (B) CD227/Muc1 i CD10/CALLA. (C,D) Analiza FACS4-tego pasażu przed stazą HMEC pod kątem ekspresji (C) EpCAM i integryny CD49f/alfa 6 oraz (D) CD227/Muc1 i CD10/CALLA. Możliwe do zidentyfikowania populacje są oznaczone jako LEP (wyrażające markery luminalne EPCAM lub CD227), MEP (wyrażające markery mioepitelialne CD49f lub CD10) lub PROG (wzbogacone w populacji CD49f+/EPCAM+). Należy zauważyć, że podczas adaptacji do hodowli regulacja EpCAM i CD49f zmienia się w porównaniu z organoidami niehodowanymi. (E) Niesortowane LEP i MEP wzbogacone HMEC i FACS w 4przejściu barwione do analizy immunofluorescencyjnej keratyny K14 (marker MEP) i K19 (marker LEP) w celu weryfikacji identyfikacji linii. Jądra wybarwione DAPI stają się niebieskie.

figure-results-4
Rysunek 4. Hodowane HMEC są zdolne do tworzenia zorganizowanych struktur z relacjami rodowymi podobnymi do in vivo, gdy zostaną umieszczone w odpowiednich mikrośrodowiskach. (A) HMEC4 przejścia Pre-stasis zostały wzbogacone FACS o luminalne linie LEP i mioepitelialne MEP przy użyciu markerów dla CD227 i CD10, przy czym te linie zostały zweryfikowane przez ekspresję K14 i K19 (nie pokazano). (B) Po zmieszaniu ze sobą w mikrostudzienkach z mikrowzorami, hodowane komórki były zdolne do samoorganizacji w dwuwarstwy z MEP na zewnątrz i LEP wewnętrznym [zaadaptowane z Chanson et al.5]. Fluorescencyjnie oznaczone LEP (zielony) i MEP (czerwony) obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego po 0 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach po dodaniu do mikrostudzienek (górnych). HMEC kontrolny został arbitralnie oznaczony czerwonymi lub zielonymi znacznikami fluorescencyjnymi (poniżej). (C) Obraz w jasnym polu komórek progenitorowych wzbogaconych w FACS (cKit +) posianych w kulturze 3D (Matrigel) i hodowanych przez 18 dni. Powstałe struktury mogą wykazywać morfogenezę pęcherzyków płucnych. (D) Struktury wyekstrahowano z Matrigel i wybarwiono w celu wykrycia K14 i K19; jądra podbarwiono przeciwstawnie DAPI. Analiza immunofluorescencyjna pokazuje zorganizowane struktury z prawidłową polaryzacją luminalną i podstawową.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tu metoda przetwarzania tkanki sutka ludzkiego umożliwia uzyskanie czystych komórek nabłonka sutka z heterogenicznej domieszki typów komórek w ludzkiej piersi. Filtracja przez pory o stałej wielkości pozwala na oddzielenie różnych frakcji gruczołu sutkowego (np. przewodowej i przednio-pęcherzykowej vs. pęcherzykowej) od trawionej macierzy zrębu. Izogenne fibroblasty sutka można uzyskać w celu dopasowania do komórek nabłonka. Zamrożony przefermentowany materiał zachowuje dobrą żywotność przez ponad 30 lat. Ta metoda sprawdziła się we wszystkich tkankach sutka z wyjątkiem bardzo włóknistych i jest prosta do wykonania. Istnieją inne odmiany przetwarzania tkanki sutka, które nie zapewniają frakcji nabłonka, które są tak żywotne, czyste lub oddzielone. Umieszczenie przetworzonych organoidów w hodowli z pożywkami o niskim poziomie wywołującymi stres, takimi jak M87A, umożliwia długoterminowy wzrost HMEC z wieloma markerami liniowymi. HMEC, które zostały wyhodowane na plastiku, nadal zachowują zdolność do generowania struktur 3D z normalnymi relacjami rodowymi podobnymi do in vivo. Te kultury HMEC nadają się do szeroko zakrojonych badań eksperymentalnych, w tym wysokiej przepustowości, normalnego zachowania HMEC i czynników, które mogą napędzać lub hamować starzenie się i transformację.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAL, JCG i MRS są wspierane przez NIA (R00AG033176 i R01AG040081) oraz przez Laboratory Directed Research and Development, kontrakt Departamentu Energii USA# DE-AC02-05CH11231.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szklana szalka Petriego 15 cmVWR89000-308
Nożyczki 6,5"VWR82027-594
Kleszcze 8"VWR82027-436
Skalpele jednorazoweMiltex4-411
KolagenazaSIGMAC0130
HialuronidazaSIGMAH3506
InsulinaSIGMAI5500
DMSOSIGMAD8418
Pennicylina/StreptomycynaLife Technologies15140-122
FungizoneLife Technologies15290-018
Siarczan polimixyny BLife Technologies21850-029
Surowica bydlęca płoduLife Technologies26140-087
Trypsyna 0,05% 100 mlLife Technologies25300-054
DMEM/F12Life Technologies11039-021
HulaMixerLife Technologies159-20D
Sitko do komórek 100 μ mBD Falcon352360
Sitko do komórek 40 μ mBD Falcon352340
Tubki 15 mlGreiner bio-one188-261
Tubki 50 mlGreiner bio-one227-261
Naczynia TC 10 cmGreiner bio-one664-160
TC Naczynia 6 cmGreiner bio-one628-160
Fiolki kriogeniczneNalgene5000-1020
HeamocytometrHauser Scientific1490
WirówkaEppendorf model5702

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prowse, K. R., Greider, C. W. Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).
  2. Gil, J., Peters, G. Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).
  3. Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture. In Vitro. 16, 415-425 (1980).
  4. Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells. Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).
  5. Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).
  6. Stampfer, M. R., Bartley, J. C. Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).
  7. Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation. Oncogene. 17, 199-205 (1998).
  8. Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion. Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).
  9. Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines. Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).
  10. Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -L., Ljung, B. -M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. In situ analysis of genome instability in breast cancer. Nat Gene. 36, 984-988 (2004).
  11. Li, Y., Pan, J., Li, J. -L., Lee, J. -H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized. Mol. Cancer. 6, (2007).
  12. Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis. Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).
  13. Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization. Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).
  14. Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs. Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).
  15. LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).
  16. Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia. Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).
  17. Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ludzkie kom rki nab onka gruczo u mlekowegoprzetwarzanie tkanektrawienie enzymatyczneizolacja organoid wfiltracja przez sitko kom rkowepierwotna hodowla kom rekusuwanie zr buwzbogacanie frakcji nab onkowejdyssekcja gruczo u mlekowegopo ywka niskostresowa

Powiązane artykuły