Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Stephan Heermann; Kerstin Krieglstein

doi:10.3791/50016

Artykuł metodologiczny

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50016

⸱

21 listopada 2012

Stephan Heermann¹^,² , Kerstin Krieglstein¹^,³

¹Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , ²Department of Neuroanatomy, University of Heidelberg, ³FRIAS, University of Freiburg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Streszczenie

Rozwój nerwów obwodowych to intrygujący proces. Neurony wysyłają aksony, aby unerwić określone cele, które u ludzi często znajdują się w odległości większej niż 100 cm od somy neuronu. Przeżycie neuronów podczas rozwoju zależy od docelowych czynników wzrostu, ale także od wsparcia komórek Schwanna (SC). W tym celu SC otacza aksony z obszaru somy neuronalnej (lub przejścia z ośrodkowego do obwodowego układu nerwowego) do synapsy lub połączenia nerwowo-mięśniowego. Komórki Schwanna są pochodnymi grzebienia nerwowego i migrują jako prekursory wzdłuż wyłaniających się aksonów, aż cały akson zostanie pokryty SC. Pokazuje to znaczenie migracji SC dla rozwoju obwodowego układu nerwowego i podkreśla konieczność zbadania tego procesu. Aby przeanalizować rozwój SC, potrzebna jest konfiguracja, która oprócz SC zawiera również ich fizjologiczny substrat do migracji, akson. Ze względu na rozwój wewnątrzmaciczny in vivo, obrazowanie poklatkowe nie jest jednak możliwe u kręgowców łożyskowych, takich jak myszy (mus musculus). Aby obejść ten problem, dostosowaliśmy technikę eksplantatu zwoju szyjnego (SCG). Po leczeniu czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) eksplantaty SCG wydłużają aksony, a następnie prekursory SC migrują wzdłuż aksonów ze zwoju na obrzeża. Piękno tego systemu polega na tym, że SC pochodzą z puli endogennych SC i że migrują wzdłuż własnych fizjologicznych aksonów, które rosną w tym samym czasie. System ten jest szczególnie intrygujący, ponieważ rozwój SC wzdłuż aksonów może być analizowany za pomocą obrazowania poklatkowego, co otwiera dalsze możliwości uzyskania wglądu w migrację SC.

Protokół

1. Przygotowanie żeli kolagenowych

Przygotować podłoże podstawowe, zawierające 455 μl 10x MEM, 112 μl 7,5% NaHCO₃, 50 μl glutaminy i NaOH. Stężenie i ilość NaOH zależy od preparatu kolagenu z ogona szczura (patrz 1.2), przy czym końcowa objętość podłoża podstawowego wynosi 1000 μl.
Przygotuj kolagen ze szczurzego ogona zgodnie z Ebendal (1). Przechowywać roztwór kolagenu w temperaturze 4 °C. Nie można było zaobserwować degradacji roztworu kolagenu. Po przygotowaniu nowej partii oszacować stężenie NaOH potrzebne dla podłoża podstawowego (patrz ppkt 1.1). Użyć wskaźnika pH pożywki do miareczkowania ilości i stężenia NaOH. 800 μl kwaśnego kolagenu ze szczurzego ogona musi zmienić odcień na czerwony po zmieszaniu z 210 μl podłoża podstawowego. Jeśli stężenie NaOH jest zbyt niskie, roztwór kolagenu zmieni kolor na żółty ze względu na wskaźnik pH pożywki. Dodaj kolagen do podłoża i wymieszaj bez wytwarzania pęcherzyków. Wykonaj te czynności na lodzie. Polimeryzacja zachodzi w ciągu 2 godzin po zmieszaniu roztworu kolagenu i podłoża podstawowego, a nowy roztwór jest inkubowany w temperaturze 37 °C. Sprawdź to przed rozpoczęciem eksperymentu. 1.3) Zmieszać 800 μl roztworu kolagenu z 210 μl podłoża podstawowego (patrz 1.2). Umieścić 100 μl tego roztworu w studzienkach z 8-dołkowym szkiełkiem podstawowym. Szkiełka należy inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotnych warunkach w inkubatorze do hodowli komórkowych. Przygotuj żele kolagenowe pod stołem do hodowli komórkowych i sterylnych warunkach. Kolagen żeluje się w ciągu 2 godzin.

2. Sekcja embrionalnych SCG

Zbierz zarodki myszy w ciąży (E16-18) z macicy i przechowuj je w PBS do czasu, gdy będą dalej potrzebne.
Wypreparuj jeden zarodek z owodni. Odetnij głowę zarodka ogonowego na poziomie obojczyka. Przymocuj głowę do silikonowego dolnego naczynia za pomocą "igieł do owadów". Brzuszna strona głowy musi być skierowana w twoją stronę i musisz zobaczyć obszar podżuchwowy. Mocowanie umożliwia łatwiejsze przygotowanie.
Usuń skórę okolicy podżuchwowej po lewej i prawej stronie, a wraz z nią podskórną tkankę łączną.
Usuń gruczoły ślinowe podżuchwowe z ich lokalizacji, aby oczyścić widok na gnykówkę, mięśnie podgnykowe i mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy.
Usuń te mięśnie ostrożnie, aby oczyścić widok na krtań i tchawicę. Usuń tchawicę i krtań. Tętnice szyjne są wtedy widoczne po obu stronach mięśni przedkręgowych. SCG znajduje się w rozwidleniu tętnic szyjnych i ma owalny kształt. Ostrożnie usuń zwoje nerwowe i umieść je w PBS. Delikatnie usuń zwoje nerwowe z narzędzi do preparowania, jeśli się do nich przyklejają. Do usuwania SCG korzystne jest użycie kleszczy, a także uchwytu na igłę zamontowanego za pomocą "igły do owadów".
Po umieszczeniu w PBS przechowuj zwoje w temperaturze pokojowej w PBS, dopóki nie wypreparujesz wystarczającej liczby zwojów. Następnie oczyść zwoje z naczyń krwionośnych i tkanki łącznej. Wykonaj sekcję i czyszczenie SCG pod mikroskopem preparacyjnym umieszczonym pod ławką z przepływem laminarnym.
Na koniec umieść eksplantowane zwoje na żelowych żelach kolagenowych za pomocą igieł strzykawkowych zamontowanych na strzykawce w celu łatwiejszej obsługi.
Inkubować eksplantaty SCG na żelatynizowanym kolagenie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, z 5 % CO₂ i w wilgotnych warunkach.

3. Leczenie eksplantatów SCG

Po 1-2 godzinnej inkubacji przykryj eksplant SCG zawierający kolagen 100 μl pożywki do hodowli komórek neurobazalnych zawierającej suplement B27, glutaminę i antybiotyki. Teraz studzienki szkiełek komorowych zawierają objętość 200 μl (100 μl żelu i 100 μl pożywki). Dodaj kolejne 200 μl pożywki, jednak teraz zawierającej NGF (60 ng / ml), aby ułatwić wzrost aksonów. W związku z tym końcowe stężenie NGF wynosi 30 ng/ml.
1. Aby zbadać początek migracji SC, należy dodać dodatkowe czynniki bezpośrednio w dniu in vitro 0 (DIV0). Rozpuścić czynniki w pożywce zawierającej NGF w wymaganym podwójnym stężeniu (2).
2. Aby przeanalizować wpływ na SC, które już zaczęły migrować wzdłuż aksonów, dodaj dodatkowe czynniki w DIV3 aż do DIV4 (potencjalne zatrzymanie eksperymentu). W tym celu ostrożnie usunąć 180 μl roztworu w DIV3 i dodać 200 μl nowej pożywki zawierającej NGF i dodatkowe czynniki będące przedmiotem zainteresowania przy podwójnym stężeniu (2).

4. Obrazowanie poklatkowe

Użyj odwróconego mikroskopu do analiz. Można stosować różne obiektywy, określające pole widzenia i powiększenie. Ważnym aspektem jest jednak odległość robocza zastosowanego obiektywu, ponieważ obrazowanie eksplantatów SCG odbywa się przez szkiełko podstawowe i żel kolagenowy. Liczba klatek na sekundę podczas nagrywania 1/10-30 minut wykazała dobre wyniki (2). Aspekt ten musi być jednak dostosowany do kwestii naukowej. Do akwizycji obrazu można użyć zwykłej kamery CCD. W przypadku obrazowania poklatkowego komora inkubacji hodowli komórkowych musi być podłączona do stolika mikroskopu. Inkubować tkankę podczas obrazowania w temperaturze 37 °C, z 5% CO₂ i w wilgotnych warunkach. Uruchomić system inkubacji na godzinę przed rozpoczęciem obrazowania. Dzięki temu części mikroskopu (np. obiektyw), w tym szkiełko komory, dostosowują się do temperatury i zapobiegają dryftom wywołanym temperaturą. Definiowanie określonych obszarów analiz (w obrębie eksplantatu i pomiędzy różnymi eksplantatami) za pomocą oprogramowania mikroskopowego i sterowanego programowo zmotoryzowanego stolika (konfiguracja wielopozycyjna) do jednoczesnych analiz różnych warunków zastosowanych do eksplantatów SCG. Do obrazowania poklatkowego można wykorzystać tkanki typu dzikiego, a także tkanki pochodzące od zwierząt transgenicznych, oznaczając SC (s100b:GFP) (3). Do obrazowania fluoroforów należy zastosować fluorescencyjne źródło światła w konfiguracji mikroskopowej. Używaj standardowych filtrów.

5. Kwantyfikacja odległości migracji SC

W punkcie końcowym (na przykład DIV4) utrwal żele kolagenowe z 4% PFA w szkiełku komorowym na 3-4 godziny. Następnie myj żele kolagenowe 5 razy przez 10 minut za pomocą PBS. Zastosuj standardowe protokoły immunocytochemiczne (2). Jeśli jesteś nowy w przygotowywaniu SCG, zweryfikuj tożsamość ganglionu jako zwoju współczulnego za pomocą immunohistochemii przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH), powszechnemu markerowi komórek katecholaminergicznych. Podczas immunohistochemii (po przeciwciałie pierwotnym) przenieś eksplant zawierający żele kolagenowe do 24-dołkowych płytek, które mają większą objętość, co jest korzystne dla mycia żeli.
Po immunohistochemii ostrożnie umieść żele kolagenowe na szkiełkach podstawowych. Ostrożnie usuń pozostały roztwór i pozwól kolagenowi wyschnąć/skurczyć się do dwóch wymiarów. Pozwala to na łatwe pomiary odległości (2). Następnie zamontuj próbki.
Na koniec zmierz odległości migracji za pomocą oprogramowania Fidżi (NIH). W tym celu nie są potrzebne żadne specjalne wtyczki. Aby umożliwić prawidłowe pomiary w μm, sprawdź poprawne metadane obrazowania i ustawienia w obszarze Fidżi, obraz i skala. Użyj Fidżi również do ilościowego oznaczania komórek.