Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Podsumowanie

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki. Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca i przepony do testów funkcjonalnych. Pokazane zostaną protokoły skurczów izometrycznych i ekscentrycznych, a także różnice w wynikach między mięśniami dystroficznymi, reprezentującymi stan patologiczny, a mięśniami typu dzikiego.

Streszczenie

Kluczowe dla oceny potencjalnych terapii chorób mięśniowych są czułe i powtarzalne fizjologiczne oceny funkcji mięśni. Ponieważ wiele badań przedklinicznych opiera się na mysich modelach tych chorób, izolowana funkcja mięśni stała się jednym ze standardów przy podejmowaniu decyzji o Go/NoGo w przekazywaniu kandydatów na leki pacjentom. Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca (EDL) i przepony do testów funkcjonalnych, które są dominującymi mięśniami wykorzystywanymi w tych badaniach. Geometria mięśni EDL jest idealna do izolowanych preparatów mięśniowych, z dwoma łatwo dostępnymi ścięgnami i niewielkimi rozmiarami, które można wspomóc superfuzją w kąpieli. Przepona wykazuje głęboką postępującą patologię u zwierząt dystroficznych i może służyć jako platforma do oceny wielu potencjalnych terapii przeciwdziałających zwłóknieniu i promujących stabilność włókien mięśniowych. Pokazane zostaną protokoły rutynowych testów, w tym skurcze izometryczne i mimośrodowe. Siła izometryczna zapewnia ocenę siły, a skurcze ekscentryczne pomagają ocenić stabilność sarkolemmy, która jest zaburzona w wielu typach dystrofii mięśniowych. Przedstawione zostaną również porównania oczekiwanych wyników między mięśniami z mięśni typu dzikiego a mięśniami dystroficznymi. Pomiary te mogą uzupełniać morfologiczne i biochemiczne pomiary homeostazy tkanek, a także oceny funkcji mięśni na całych zwierzętach.

Wprowadzenie

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki. W przypadku chorób mięśni wykorzystanie modeli mysich stało się kluczowym elementem zrozumienia powiązań między genotypem a fenotypem oraz rozszerzenia tej wiedzy na projektowanie i testowanie potencjalnych środków terapeutycznych. W szczególności dystrofie mięśniowe polegały na myszach w celu oceny tych czynników i ustalenia danych przedklinicznych wymaganych do przejścia do badań na pacjentach. Częsta miara wyniku wykorzystuje izolowaną funkcję mięśni do określenia siły, co ma zastosowanie w szerokim zakresie badań. Inną miarą jest zastosowanie skurczów ekscentrycznych lub wydłużających się w celu określenia zmian w integralności błony mięśniowej, która jest niewystarczająca w dystrofii mięśniowej Duchenne'a, oraz mysiego modelu tej choroby (mdx). Dlatego ważne jest, aby tego typu pomiary były czułe i powtarzalne.

Mięsień EDL (prostownik palca długiego) myszy był szeroko stosowany do izolowanych funkcji mięśni ze względu na jego idealną geometrię i rozmiar, w tym jednolitą orientację włókien i ostateczne ścięgna ^{2, 5, 6, 10, 12}. Metody izometrycznych pomiarów funkcjonalnych mięśni EDL zostały opisane w poprzedniej publikacji JoVE ⁸, a także w Treat-NMD SOP ¹. Rozszerzyliśmy opis tych metod o skurcze zarówno izometryczne, jak i mimośrodowe. Cechy charakterystyczne choroby są widoczne w EDL, w tym wzmożone cykle zwyrodnienia/regeneracji i zmniejszona moc wyjściowa.

Przepona myszy wykazuje najszybszy patologiczny postęp dystrofii mięśniowej w porównaniu do innych mięśni u myszy ¹¹. W wieku 6 miesięcy skumulowane zwłóknienie obejmuje około 50% mięśnia. Powoduje to znaczne osłabienie siły wyjściowej ¹¹. Dlatego środki terapeutyczne, które mogą zapobiegać infiltracji zwłóknienia, mogą być skutecznie oceniane w przeponie.

Utrata dystrofiny w mięśniach prowadzi do zwiększonej kruchości i zwiększonych uszkodzeń skurczowych we wszystkich mięśniach ⁹. Dlatego wiele terapii dystrofii mięśniowej Duchenne'a jest ukierunkowanych na zastąpienie dystrofiny. W związku z tym testem, który stał się niezbędny do oceny tych strategii, jest skurcz ekscentryczny, który może rozróżnić mięsień normalny i dystroficzny, a także określić, jakie korzyści ma dana strategia dla ochrony mięśnia dystroficznego przed uszkodzeniem skurczowym ^{2, 3, 4, 12}. Ta procedura wymaga albo serwomotoru dwutrybowego, który może modulować/rejestrować długość i siłę, albo metody szybkiej regulacji długości oddzielonej od przetwornika siły.

Protokół

Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Pensylwanii.

1. Sekcja i przygotowanie EDL (około 30 min)

1. Znieczulenie myszy należy upewnić się, że podczas zabiegu nie odczuwają bólu ani niepokoju, ale mięśnie pozostają dobrze dotlenione przez krążenie. Rutynowo używamy koktajlu ketamina/ksylazyna (100/10 mg/kg) wstrzykiwanego przez IP. Operacyjna płaszczyzna znieczulenia jest określana przez całkowity brak odruchów odstawienia pedału lub podpalenia lub brak reakcji skurczowej ucha.
2. Unieruchomij tylne kończyny za pomocą taśmy medycznej i usuń skórę dolnej przedniej kończyny tylnej, aby odsłonić mięśnie tego obszaru. Utrzymuj mięśnie wilgotne, stosując PBS w regularnych odstępach czasu.
3. Pod lunetą sekcyjną wykonaj małe nacięcie boczne do kolana, aby odsłonić ścięgno proksymalne mięśnia EDL. W tym obszarze znajdują się dwa ścięgna i oba powinny zostać przecięte, aby umożliwić usunięcie EDL.
4. W kostce przyśrodkowej przetnij ścięgno mięśnia TA, aby odsłonić dystalne ścięgna EDL, które rozciągają się wzdłuż śródstępu. Unieś mięsień TA z drogi, uważając, aby nie przeciąć ani nie dotknąć EDL pod spodem. Wróć do dystalnych ścięgien EDL, odetnij każde z nich i przeciągnij je przez kostkę, a następnie chwytając ścięgna, delikatnie odciągnij EDL od reszty kończyny. Powinien swobodnie uwolnić się od bliższego końca, ale jeśli nie, wróć do bocznego nacięcia, aby upewnić się, że ścięgno zostało przecięte. Usuń mięsień i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym schłodzonymi, natlenionymi Ringerami. Przypnij mięsień przez ścięgna na mniej więcej długości spoczynkowej, która jest długością występującą in vivo. Długość jest zbyt krótka, gdy mięsień jest zwiotczały w naczyniu i zbyt długa, jeśli mięsień ciągnie za szpilki preparacyjne.
5. Poddaj mysz eutanazji natychmiast po usunięciu mięśni przez zwichnięcie szyjki macicy.
6. Przywiąż szwy do ścięgien, jak najbliżej mięśnia, ale nie dotykając mięśnia. Przypnij mięsień na mniej więcej długości spoczynkowej za pomocą szwów.

2. Sekcja i przygotowanie membrany (około 30 min)

1. Eutanazja myszy przed tą procedurą przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu, jeśli ta sama mysz jest poddana obu sekcji, lub przez CO₂, a następnie potwierdzenie zwichnięcia szyjki macicy.
2. Wykonaj nacięcie w skórze, aby odsłonić jamę brzuszną i klatkę piersiową. Otwórz jamę brzuszną i przetnij ścianę ciała tuż pod żebrami. Za pomocą nożyczek do kości i zaczynając od przyczepu przepony, przeciąć wokół całej klatki piersiowej zgodnie z linią żeber i przeciąć kręgosłup. Przeciąć naczynia krwionośne biegnące przez środek przepony, aby można było łatwo usunąć przeponę.
3. Zdejmij membranę z myszy i umieść w naczyniu preparacyjnym wypełnionym natlenionymi Dzwonkami. Delikatnie porusz membranę w naczyniu, aby zmyć krew. W razie potrzeby odśwież rozwiązanie Ringers.
4. Wytnij mały pasek przepony od środkowego ścięgna do żeber wzdłuż orientacji włókien w środkowej części bocznych półprzepony. Pasek powinien mieć szerokość od 2 do 4 mm. Za pomocą nożyczek do kości odetnij żebro po obu stronach paska, pozostawiając około 1-2 mm zwisu żebra po obu stronach paska przepony.
5. Przywiąż szwy do środkowego ścięgna. Przywiąż szew do każdego z bocznie wystających końców żeber, a następnie zwiąż je ze sobą, aby utworzyć dużą pętlę.
6. Z każdej membrany można uzyskać dwa paski (po jednym z każdej strony).

3. Trening mięśni w kąpieli mechanicznej

1. Chwyć szwy i użyj ich, aby przymocować mięsień do sztywnego słupka na jednym końcu i do przetwornika siły na drugim końcu.
2. Dostosuj długość, aby upewnić się, że mięsień nie jest luźny, ale nie jest napięty. Dobrym przybliżeniem jest spoczynkowa długość mięśnia, jak w 1,4 - 1,5.
3. Kąpiel powinna być wypełniona natlenionym roztworem Ringera utrzymywanym w temperaturze 22 °C, aby przedłużyć stabilność mięśni do testów. Mięśnie powinny odpoczywać w tej kąpieli przez 5 minut przed testami funkcjonalnymi, tak aby temperatura mięśni była zrównoważona do 22 °C.

4. Skurcze izometryczne

1. Ustal supramaksymalne warunki stymulacji. Po umieszczeniu mięśnia w kąpieli użyj pojedynczych impulsów stymulacyjnych o długości 0,5 ms, aby wygenerować drganie i monitorować moc wyjściową. Stopniowo zwiększaj prąd, aż siła osiągnie maksymalny, ale stały poziom. Zwiększ prąd do 10% więcej niż ten poziom dla pozostałych eksperymentów.
2. Ustal optymalną długość. Za pomocą izometrycznych stymulacji drgawek stopniowo reguluj długość mięśnia, aż do uzyskania maksymalnej siły. Odpocznij mięsień ~10 sekund między każdym skurczem. Optymalna długość mięśnia (L_o) jest osiągana, gdy siła skurczu jest maksymalna. Rejestruj długość mięśnia (długość między połączeniami mięśniowo-ścięgnistymi w przypadku EDL oraz między centralnym połączeniem mięśniowo-ścięgnistym a przyczepem mięśnia do żebra) za pomocą suwmiarki z noniuszem.
3. Maksymalna izometryczna siła tężcowa. Stymulować mięśnie ustawione w L_o przez okres 500 ms, z serią impulsów 0,5 ms przy supramaksymalnej stymulacji i przy częstotliwości fuzji (od plateau zależności częstotliwość-siła (np. Ref: ⁸). Plateau dla mięśni EDL jest zwykle osiągane przy 120 Hz, a dla mięśni przepony przy 100 Hz. Stymuluj 3 razy z odpowiednią częstotliwością z okresami odpoczynku wynoszącymi 5 minut między atakami stymulacji dla każdego mięśnia.

5. Skurcze ekscentryczne

1. Pozwól mięśniom odpocząć 5 minut między wykonywaniem skurczów izometrycznych i ekscentrycznych.
2. Stymuluj mięśnie przy 80 Hz izometrycznie przez początkowe 500 ms, a następnie rozciągaj się o 10% w końcowej stymulacji 200 ms (szybkość rozciągania 0,5 l_o / s).
3. Powtórz schemat stymulacji z 5-minutowymi przerwami między nimi, aby uzyskać pożądaną liczbę skurczów ekscentrycznych.
4. Zmierz siłę dla każdego skurczu w okresie poprzedzającym rozciąganie. Oblicz spadek siły między pierwszym a ostatnim skurczem.

6. Usuwanie mięśni z aparatu

1. Skróć długość mięśnia, aby umożliwić delikatne usunięcie mięśnia z przetwornika i wkładu z powrotem do naczynia preparacyjnego z Ringerem.
2. Usuń szwy z mięśni.
3. W przypadku mięśnia EDL należy dwukrotnie osuszyć mięsień, a następnie zważyć go przed dalszą obróbką (np. zamrożeniem, utrwaleniem itp.). Będzie to ważne przy obliczaniu pola przekroju poprzecznego i siły właściwej.
4. W przypadku mięśnia przepony namocz 0,1% prokion orange, barwnik nieprzepuszczalny dla błony przez 15-20 minut. Zapewni to wskaźnik uszkodzeń preparacji.
5. Wypreparuj mięsień z dala od przyczepu kostnego, a także ścięgno centralne. Jest to konieczne, aby zapewnić dokładną wagę mięśnia. Osuszyć jak powyżej przed ważeniem i późniejszym przygotowaniem.
6. Obliczać Pole przekroju poprzecznego (CSA):
   CSA (mm²) = masa (mg) / [(L_o mm) * (L/L_o) * (1,06 mg/mm³)],
   gdzie L/L_o to stosunek długości włókna do długości mięśni (0,45 dla EDL, 1,0 dla przepony)⁵, a 1,06 to gęstość mięśnia.

Wyniki

Oczekiwane wartości sił izometrycznych mięśni EDL od 12-tygodniowych zwierząt są pokazane na rysunku 1. Ponieważ mięśnie mdx wykazują hipertrofię kompensacyjną, całkowita siła tężca może być wyższa w mięśniach mdx w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego dopasowaną do wieku. Jednak bardziej odpowiednią miarą funkcjonalnej mocy wyjściowej jest siła właściwa (rysunek 2), gdzie siła jest normalizowana dla pola przekroju poprzecznego w celu obliczenia tej wartości. Siła właściwa zależy od wrodzonej zdolności funkcjonalnej mięśnia, przy czym osłabienie mięśni dystroficznych jest bardziej widoczne, gdy weźmie się pod uwagę zarówno siłę bezwzględną, jak i pole przekroju poprzecznego. W naszych rękach mięśnie EDL myszy mdx generują około 20 - 25% mniejsze siły właściwe niż u myszy typu dzikiego w dopasowanym wieku od 10 do 26 tygodnia życia.

Dla przepony, tylko określona siła jest istotna dla porównań, ponieważ preparat jest częścią mięśnia zależną od sekcji. Porównanie siły właściwej między mięśniami przepony typu dzikiego i mdx odzwierciedla postępującą patologię w tej tkance. Moc wyjściowa siły izometrycznej zmniejsza się wraz z wiekiem (ryc. 3), tak że w wieku 6 miesięcy mięśnie przepony myszy mdx wytwarzają nie więcej niż połowę funkcjonalnej mocy wyjściowej pasków przepony z kontroli typu dzikiego w dopasowanym wieku.

Przykład skurczów mimośrodowych z testów membrany pokazano na rysunku 4. Z każdym kolejnym skurczem ekscentrycznym siła wyjściowa zmniejsza się w paskach przepony zarówno u myszy typu dzikiego (C57), jak i mdx. Jednak utrata siły jest bardziej dramatyczna w próbkach mięśni myszy mdx, prawdopodobnie z powodu braku dystrofiny i powiązanych z nią białek.

Rysunek 1. Izometryczna siła tężcowa w mięśniach wildtype i mdx EDL od 12-tygodniowych myszy. Siła bezwzględna może być wyższa w dopasowanych do wieku mięśniach mdx EDL ze względu na hipertrofię kompensacyjną.

Rysunek 2. Izometryczna siła tężcowa znormalizowana przez pole przekroju poprzecznego mięśni to siła właściwa i ujawnia obniżoną zdolność funkcjonalną mięśni EDL myszy mdx w porównaniu z myszami typu dzikiego. Ślady pochodzą od tych samych myszy, co na rysunku 1.

Rysunek 3. Postępująca utrata zdolności generowania siły oceniana siłą właściwą jest najbardziej widoczna w membranie myszy mdx (czerwone paski) w porównaniu z typem dzikim (C57 w niebieskiej linii).

Rysunek 4. Utrata siły w funkcji liczby skurczu ekscentrycznego mięśni przepony od 12-tygodniowych myszy C57 i mdx. Dane są średnie± SEM dla N=4 mięśni na genotyp.

Dyskusja

Celem tego artykułu jest dostarczenie wskazówek dotyczących wykonywania izolowanych funkcji mięśni na dwóch mięśniach myszy - EDL i przeponie. Ocena tych mięśni może dostarczyć informacji na temat tego, czy kandydaci terapeutyczni na choroby mięśni są korzystne. W przypadku obu mięśni głównym czynnikiem w uzyskaniu solidnych danych jest czysta sekcja. Dlatego przećwiczenie i doskonalenie początkowego etapu izolacji jest niezbędne przed przejściem do testów funkcjonalnych. Ponadto ustalenie funkcjonalnych punktów odniesienia dla prawidłowych mięśni ma kluczowe znaczenie przed dokonaniem porównań z mięśniami dystroficznymi lub między zabiegami. Zapewni to, że wyniki badań nie będą podlegały dużej zmienności wynikającej z umiejętności osoby przeprowadzającej eksperymenty. Zastosowanie barwnika nieprzepuszczalnego dla membrany może pomóc w optymalizacji przygotowania do sekcji, ponieważ inkubacja dowolnego mięśnia w roztworze zawierającym taki barwnik oznaczy większość uszkodzonych włókien i może służyć jako wskaźnik sukcesu sekcji. Zminimalizowanie liczby włókien uszkodzonych w mięśniu pomoże zoptymalizować pomiar. Włókna uszkodzone przez rozwarstwienie fluoryzują znacznie jaśniej niż te uszkodzone przez skurcz ekscentryczny, a więc jeśli barwnik jest również używany podczas procesu mechanicznego, można użyć intensywności barwnika do rozróżnienia tych dwóch rodzajów uszkodzeń.

Rozwarstwienie pasków membrany prawie zawsze spowoduje uszkodzenie włókien, po prostu dlatego, że przecinając wzdłuż włókien, niektóre nieuchronnie ulegają zniszczeniu. Absorpcja barwnika jest silna w tych uszkodzonych włóknach i zwykle ogranicza się do zewnętrznych krawędzi preparatu. Średnio obserwujemy pasmo uszkodzonych włókien o szerokości ~3 włókien (~120 μm) po obu stronach paska mięśniowego. Jeśli uszkodzona opaska obejmuje więcej niż 15% mięśnia, dane są odrzucane. Preparat membrany ma również ograniczenia co do optymalnego rozmiaru dla środków funkcjonalnych. Odkryliśmy, że kawałki przepony szersze niż 5 mm zaczynają się składać, ponieważ centralne wiązanie ścięgna znajduje się tylko w jednym punkcie. Powoduje to zmniejszenie siły właściwej w preparacie. Odkryliśmy również, że węższe paski mają również mniejszą siłę właściwą, co naszym zdaniem wynika z tego, że liczba włókien uszkodzonych podczas preparacji stanowi większą część całkowitej liczby włókien. Na przykład, jeśli 0,1 mm z każdej strony jest uszkodzone, oznacza to, że 5% (pasek 2x0,1 mm / 4 mm) nie przyczynia się do działania siły, podczas gdy jeśli pasek ma tylko 1 mm, to 20% preparatu mięśniowego jest uszkodzone. Tak więc zarówno szerokość uszkodzonego obszaru, jak i szerokość całego preparatu są ważnymi czynnikami, które należy kontrolować.

Pomiary maksymalnego napięcia izometrycznego wymagają stymulacji wszystkich włókien mięśniowych w mięśniu. Ze względu na to, że istnieje ogromna zmienność w elementach składowych aparatu funkcyjnego, musi to być określone dla każdej indywidualnej konfiguracji. Na przykład wielkość wanny lub rodzaj stymulatora mogą wpływać na intensywność stymulacji. Stymulacja drgań jest rozsądnym sposobem na określenie warunków stymulacji supramaksymalnej. Po ustaleniu tego dla konkretnej konfiguracji i mięśni, można go wykorzystać do kolejnych badań.

W przeciwieństwie do tego, optymalna długość danego mięśnia musi być mierzona dla każdego preparatu przy użyciu procesu iteracyjnego opisanego powyżej. Gwarantuje to, że nakładanie się grubych i cienkich włókien jest optymalne i mierzona jest maksymalna zdolność generowania siły potencjalnej. Alternatywne procedury mogą opierać się na wzorcach dyfrakcyjnych związanych z prążkami mięśniowymi, ale wymaga to dodatkowego sprzętu, który nie został tutaj opisany.

Rutynowo stosujemy czas trwania stymulacji wynoszący 500 ms, co mieści się w środkowym zakresie tego parametru używanego przez innych badaczy w tej dziedzinie. Chociaż może to powodować pewne zmęczenie mięśnia podczas skurczu, co jest widoczne w "ugięciu" w produkcji maksymalnej siły, samo w sobie może to być pouczające. Na przykład różnicę w zmęczeniu można osiągnąć za pomocą różnych rodzajów terapii, w tym tych, które są ukierunkowane na obchodzenie się z wapniem, stąd ugięcie obowiązujące podczas aktywnego skurczu może służyć jako wskaźnik poprawy. Alternatywnie, utrata siły może wskazywać, że szwy na ścięgnach nie są wystarczająco napięte i że ślizgają się podczas skurczu. Mięsień musi zostać usunięty z kąpieli, a szwy muszą zostać ponownie zawiązane, jeśli tak się stanie. Stosujemy również serię 3 skurczów tężcowych, co pomaga ocenić stabilność preparatu. Ponownie, zsuwanie się szwów doprowadziłoby do utraty siły między skurczami, co wymagałoby ponownego wiązania szwów. Duże mięśnie mogą również generować niedotlenione rdzenie, co prowadzi do utraty siły podczas protokołu. Wielkość mięśni jest czynnikiem ograniczającym wykonywanie izolowanych testów funkcji mięśni, w których mięśnie EDL o masie większej niż 20 mg tracą siłę przy każdym skurczu i nie mogą być podtrzymywane przez superfuzję w kąpieli. Paski membranowe nie cierpią z powodu tych samych powikłań, ponieważ są wystarczająco cienkie, aby zapewnić przedłużoną żywotność w kąpieli.

Inne mięśnie mogą być wykorzystywane do izolowanych funkcji mięśni, w tym mięsień płaszczkowaty, który jest powszechnie używany, ale nie opisano tutaj. Wiele z tych samych procedur można zastosować w przypadku mięśnia płaszczkowatego w zakresie przygotowania i testów funkcjonalnych. Jednak główne różnice dotyczą częstotliwości stymulacji i parametrów skurczów ekscentrycznych. Wykorzystanie mięśnia płaszczkowatego do funkcji uzupełnia działanie pozostałych dwóch mięśni, dlatego należy je traktować jako część "standardowego pakietu" do oceny myszy dystroficznych ^{4, 7}.

Skurcz ekscentryczny zapewnia wskaźnik kruchości skurczu i ważne jest, aby stosować protokół, który powoduje umiarkowaną utratę siły w mięśniach u zwierząt typu dzikiego i znaczną utratę siły w nieleczonych mięśniach dystroficznych, tak aby istniał szeroki zakres dynamiki do porównań. Brak jakiejkolwiek utraty siły w normalnych mięśniach sugeruje, że skurcz ekscentryczny jest zbyt łagodny i nie będzie wystarczający do odróżnienia terapii, które nie są skuteczne, od tych, które są naprawdę korzystne. Jednak dramatyczna utrata siły w normalnych mięśniach poddanych ekscentrycznemu skurczowi może być zbyt duża, aby wydobyć różnice związane z chorobą. Nasz protokół dla EDL i membrany wykorzystuje szybkość rozciągania 0,5 Lo/s, aby uzyskać 10% zmianę długości. Zazwyczaj wykonujemy 5 skurczów ekscentrycznych, które skutkują niewielką utratą siły w normalnych mięśniach i znaczną utratą siły w mięśniach dystroficznych. Z pewnością wszystkie te parametry można zmieniać, aby zwiększyć ogólną zmianę długości, tempo rozciągania lub liczbę skurczów ekscentrycznych w celu rozróżnienia różnic między chorymi i zdrowymi mięśniami, a także na skutki określonego rodzaju mutacji lub leczenia, które jest badane. Tak długo, jak istnieje wyraźna różnica między normalnymi a chorymi mięśniami, istnieje złoty standard, po który można sięgnąć, jeśli chodzi o leczenie.

Podsumowując, protokół ten ustanawia wytyczne dotyczące wykonywania skurczów izometrycznych i ekscentrycznych i, miejmy nadzieję, identyfikuje potencjalne pułapki, których należy unikać podczas ustawiania tej techniki w laboratorium.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
in vitro System	testowania mięśni	1200A
	Źródło światła Leica	MZ6
ACE	Schott-Fostec	A20500
Nożyczki preparacyjne	Fine Science Tools	14060-11
Kątowe nożyczki preparacyjne	Fine Science Tools	15006-09
Rękojeść skalpela	Fine Science Tools	10003-12	alternatywne narzędzie preparacyjne
Zakrzywione ostrza skalpela #12	Fine Science Tools	10012-00	alternatywne narzędzie do preparowania
Nożyczki do kości	Fine Science Tools	16044-10
S& Kleszcze do wiązania szwów T	Fine Science Tools	00272-13
Kleszcze Dumont SS - kątowe	Fine Science Tools	11203-25
Pleciony jedwabny szew rozmiar 6-0	Teleflex Medical	07-30-10
Taśma medyczna	Transpore	3M
Chlorowodorek ketaminy 100 mg/ml	Hospira	NDC 0409-2051-05	Dawka końcowa wynosi 80 mg/kg
Uspokojone wstrzyknięcie (ksylazyna 100 mg / ml)	Vedco	NDC 50989-234-11	Dawka końcowa to 10 mg / kg
Reaktywny pomarańczowy 14	Sigma-Aldrich	R-8254
Ringers Składniki roztworu			Roztwór jest gazem zrównoważonym z 95% O2 i 5% CO2, końcowe pH 7,4
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S7653	Stężenie końcowe: 118 mM
Chlorek potasu	Fisher Scientific	P217-3	Stężenie końcowe: 4,7 mM
Dwuwodny chlorek wapnia	Fisher Scientific	C79-500	Stężenie końcowe: 2,5 mM
Fosforan potasu jednozasadowy	Fisher Scientific	P-285	Stężenie końcowe: 1,2 mM
Siarczan magnezu	J.T. Baker	2500-01	Finał Stężenie: 0,57 mM
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)	Fisher Scientific	BP310-500	Stężenie końcowe: 5,95 g/L
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270	Stężenie końcowe: 5,5 mM