Test wysiłkowy serca indukowany przez dobutaminę i monitorowany przez cewnikowanie serca u myszy

Sebastián Dante Calligaris; Micaela Ricca; Paulette Conget

doi:10.3791/50050

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test wysiłkowy serca indukowany przez dobutaminę i monitorowany przez cewnikowanie serca u myszy

17.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50050

⸱

10 lutego 2013

Sebastián Dante Calligaris¹ , Micaela Ricca¹ , Paulette Conget¹

¹Instituto de Ciencias, Facultad de Medicina, Clínica Alemana Universidad del Desarrollo

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół przeprowadzania testu wysiłkowego serca wywołanego przez dobutaminę i monitorowanego przez cewnikowanie serca u normalnych myszy. Pokazujemy również jego zastosowanie do demaskowania subklinicznej choroby serca u otyłych myszy wywołanych dietą wysokotłuszczową.

Streszczenie

Dobutamina jest agonistą β-adrenergicznym o wyższym powinowactwie do receptora wyrażonego w sercu (β₁) niż do receptorów wyrażonych w tętnicach (β₂). Podawany ogólnoustrojowo zwiększa zapotrzebowanie na pracę serca. W ten sposób dobutamina demaskuje nieprawidłowy rytm lub obszary niedokrwienne potencjalnie zagrożone zawałem.

Monitorowanie czynności serca podczas testu wysiłkowego serca może być przeprowadzone za pomocą ekokardografii lub cewnikowania serca. Ta ostatnia jest inwazyjną, ale dokładniejszą i bardziej pouczającą techniką niż pierwsza.

Test stresu serca wywołany dobutaminą i monitorowany przez cewnikowanie serca przeprowadzone w sposób opisany tutaj pozwala w jednym eksperymencie na pomiar następujących parametrów hemodynamicznych: tętno (HR), ciśnienie skurczowe, ciśnienie rozkurczowe, ciśnienie końcoworozkurczowe, maksymalny wzrost nadciśnienia (dP/dtmax) i maksymalny rozwój podciśnienia (dP/dt_min), w warunkach wyjściowych i przy rosnących dawkach dobutaminy.

Zgodnie z oczekiwaniami, u normalnych myszy zaobserwowaliśmy zależny od dawki dobutaminy wzrost HR, dP/dt_max i dP/dt_min. Co więcej, przy najwyższej badanej dawce (12 ng / g / min) dekompensacja serca u otyłych myszy wywołanych dietą wysokotłuszczową została zdemaskowana.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Facultad de Medicina Clinica Alemana-Universidad del Desarrollo.

I. Przygotowanie naparu z dobutaminy

Rozpuścić 10 mg dobutaminy w 20 ml sterylnej wody destylowanej, w celu otrzymania roztworu podstawowego 500 μg/ml dobutaminy. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. To rozwiązanie może być używane przez co najmniej 3 miesiące.
Rozmrozić podwielokrotność roztworu podstawowego dobutaminy w temperaturze pokojowej.
Rozcieńczyć roztwór podstawowy dobutaminy w sterylnym 0,9% NaCl, w celu otrzymania roztworu roboczego dobutaminy, którego stężenie oblicza się za pomocą wzoru: dobutamina (μg/ml) = masa ciała x 0,2.
Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 29Gx1/2" roztworem roboczym dobutaminy.
Wprowadzić igłę strzykawki do rurki PE-10 o średnicy 20 cm.
Wyregulować strzykawkę w pompie infuzyjnej zgodnie z instrukcjami producenta.
Ustaw napar rampowy w formacie krok po kroku ze wzrostem o 10 μl/min na każdy krok, dla 6 kroków.

II. Przygotowanie czujnika ciśnienia

Aby zminimalizować dryft sygnału, zanurz czujnik ciśnienia w sterylnej wodzie o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut. Nie zanurzaj cewnika na głębokość większą niż 0.5 cm, aby zapobiec wpływowi ciśnienia hydrostatycznego na czujnik ciśnienia.
Elektronicznie skalibruj czujnik ciśnienia przy 25 i 100 mmHg. Wejście elektryczne (Volt) jest przekształcane na sygnał ciśnienia (mmHg).
Ustaw częstotliwość próbkowania na 2 k/s i użyj dolnoprzepustowego filtra z odcięciem przy 100 Hz. Ustaw sygnał ciśnienia na zero mmHg.
Zaznacz cewnik w odległości 15 mm od końcówki. Odległość do dotarcia do serca od punktu wprowadzenia oszacowano za pomocą echokardiografii, wykrywając obecność cewnika w lewej komorze.

III. Przygotowanie myszy do cewnikowania

Waga C57BL/6 samców myszy, 30-32 tygodnie.
Wstrzyknąć dootrzewnowo 60 μg/kg ketaminy i 4 μg/kg ksylazyny¹. Uwaga: Można zastosować inne środki znieczulające, na przykład: 350 - 450 μg/kg avertyny, 50 μg/kg pentobarbitalu lub 1,5 - 2% izofluranu^2-3.
Ogol szyję elektryczną maszynką do golenia.
Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na ogrzanej izotermicznej płycie grzewczej. Zabezpiecz jego kończyny taśmą papierową.
Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić całkowitą sedację.
Delikatnie włóż sondę doodbytniczą, aby monitorować temperaturę ciała. Zaleca się stosowanie sondy wazelinizowanej.
Jeśli temperatura ciała waha się od 37 °C ± 0.5 °C, wyreguluj ją za pomocą płyty grzewczej.
Umieść pysk myszy w pobliżu źródła tlenu.
Umieść obszar szyi myszy pod mikroskopem stereoskopowym.

IV. Akwizycja danych

W oprogramowaniu LabChartPro 7 wybierz jeden kanał do rejestracji ciśnienia i jeden kanał do rejestracji tętna (HR). W przypadku tych ostatnich wybierz opcję "Pomiary cykliczne" i ustaw pomiar jako stawkę.
Dla kanału ciśnieniowego ustaw zakres skali: od 0 do 150 mmHg.
Dla kanału tętna ustaw zakres skali: od 200 do 600 uderzeń na minutę.
Naciśnij Start, aby rozpocząć rejestrację.
Wstaw uwagi wskazujące na wykonane zabiegi, na przykład: podanie znieczulenia, rozpoczęcie infuzji dobutaminy, stężenie dobutaminy, zmiany w oddychaniu.

V. Cewnikowanie serca^4,5

Wykonaj małe nacięcie po prawej stronie w pobliżu szczęki. Nożyczkami oddziel tkankę łączną skórno-mięśniową.
Wykonaj rozwarstwienie podłużne (1,5 - 2 cm) po prawej stronie tchawicy. Oddziel tkankę łączną, tłuszcz i mięśnie za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną w pobliżu tchawicy.
Umieść ekspander po prawej stronie zwierzęcia, aby odsłonić tętnicę szyjną. Pulsacyjne ciśnienie generowane przez serce ułatwia identyfikację tętnicy. Żyła szyjna, która jest ciemnoczerwona, znajduje się po prawej stronie.
Oddziel tętnicę od sąsiednich tkanek za pomocą zakrzywionych kleszczy. Nerw błędny, który przypomina białą nić, leży wzdłuż tętnicy.
Wytnij 20 cm kawałek jedwabnej nici 6/0 i "podwój" go.
Przełóż "podwójną" nić pod tętnicą od lewej do prawej. Odetnij nić, aby uzyskać oddzielne końce.
Przełóż trzecią nić (10 cm) poniżej tętnicy.
Zawiąż ciasny węzeł w nici umieszczonej blisko głowy, a luźny w bardziej dystalnej nici.
Zawiąż luźny węzeł w środkowej nici i przymocuj prawy koniec środkowej nici do poduszki grzewczej za pomocą taśmy papierowej.
Utrzymuj wilgotną tętnicę szyjną, upuszczając sterylne 0,9% NaCl. Osusz nadmiar płynu patyczkami kosmetycznymi.
Rozciągnij dolną nić za pomocą zacisku hemostatu.
Ustal pozycję nożyczek hemostatu, ściskając skórę brzucha, rozciągając górną nić, aby zablokować przepływ krwi. Sprawdź, czy tkanka łączna wokół tętnicy została usunięta. Tętnica powinna być pełna krwi i pozbawiona pulsu. Zapobiegaj wytwarzaniu przez gwinty siły momentu obrotowego na tętnicy.
Wykonaj nacięcie przekroju poprzecznego w pobliżu dna tętnicy za pomocą mikronożyczek Vannas. Krople krwi zostaną rozlane.
Wprowadzić cewnik do tętnicy szyjnej. Pamiętaj, aby przedstawić cały czujnik ciśnienia. Sprawdź, czy nie ma utraty krwi.
Delikatnie wyreguluj środkowy węzeł nici, aby utrzymać cewnik na miejscu. Nie ściskaj zbyt mocno, czujnik ciśnienia jest bardzo delikatny.
Uwolnij nożyczki hemostatu z brzucha zwierzęcia.
Przytrzymaj cewnik ręką i naciśnij środkową nić, aby uniknąć utraty krwi. Uwaga: tętnica powinna być pełna krwi.
Rozpocznij rejestrowanie sygnałów ciśnienia.
Gdy cewnik znajduje się w środku, sygnał ciśnienia tętniczego waha się od 60-70 do 100-120 mmHg. Kształt sygnału ciśnienia pokazano na rysunku 1.A. Uwaga: jeśli jesteś zainteresowany, w tym punkcie czasowym możesz zarejestrować ciśnienie tętnicze, jeśli sygnał jest stabilny przez co najmniej 5 minut. Wartości HR uzyskano z przebiegów ciśnienia z uwzględnieniem interwału 30 sekund nagrywania sygnału. Możliwe jest również zastosowanie metody EKG do bezpośredniego pomiaru tętna, zgodnie z celami badania.
Delikatnie popchnij cewnik do góry, aby zaobserwować zmianę kształtu sygnału ciśnienia (rysunek 1.B). Gdy cewnik znajdzie się w lewej komorze, sygnał ciśnienia waha się od 0 do 100-120 mmHg. Jeśli trudno jest przesunąć cewnik, ściśnij klatkę piersiową zwierzęcia dwoma palcami.
Stale kontroluj częstość oddechów, temperaturę ciała, poziom znieczulenia i sygnał ciśnienia. Wszystkie z nich powinny pozostać stabilne.

VI. Napar z dobutaminy

W przypadku kaniulacji żyły szyjnej należy pamiętać o odklejeniu tkanki tłuszczowej wokół żyły, aby zapobiec jej perforacji. Zabieg chirurgiczny niedrożności żył jest podobny do zabiegu pokazanego w przypadku tętnicy szyjnej.
Wprowadzić rurkę PE-10 do żyły. Upewnij się, że przepływ krwi nie jest zablokowany, przesuwając tłok strzykawki do tyłu.
Wlew dobutaminy zaczyna się od 10 μl/min, a kończy 60 μl/min. Na każdym etapie szybkość infuzji jest utrzymywana przez 2 minuty⁶.
Po ostatniej dawce dobutaminy należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania znieczulenia.

VII. Analiza danych

Do analizy danych wybierz sekcję zarejestrowanych danych, która Cię interesuje. Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę przedział czasu, w którym sygnał ciśnienia jest stabilny.
Wybierz ikonę Setup (Konfiguracja) w module Blood Pressure (Ciśnienie krwi). Wskaż wybrany typ sygnału ciśnienia.
Oprogramowanie LabChartPro 7 automatycznie wyświetla średnie, maksymalne i minimalne wartości tętna, ciśnienia skurczowego (P_max), ciśnienia rozkurczowego (P_min), ciśnienia końcoworozkurczowego (EDP), maksymalnego rozwoju nadciśnienia (dP/dtmax) i maksymalnego rozwoju podciśnienia (dP/dt_min). Ponadto parametry serca mogą być przedstawione na śladzie ciśnienia.