Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ta metoda opiera się na dożylnym wstrzyknięciu Evans Blue myszom jako testowemu modelowi zwierzęcemu. Błękit Evansa to barwnik wiążący albuminę. W warunkach fizjologicznych śródbłonek jest nieprzepuszczalny dla albuminy, więc albumina Evansa związana z błękitem pozostaje ograniczona w naczyniach krwionośnych. W stanach patologicznych, które sprzyjają zwiększonej przepuszczalności naczyń krwionośnych, komórki śródbłonka częściowo tracą bliskie kontakty, a śródbłonek staje się przepuszczalny dla małych białek, takich jak albumina. Ten warunek pozwala na wynaczynienie błękitu Evansa w tkankach. Zdrowy śródbłonek zapobiega wynaczynieniu barwnika w sąsiednich unaczynionych tkankach. Narządy o zwiększonej przepuszczalności będą wykazywały znacznie zwiększone niebieskie zabarwienie w porównaniu z narządami z nienaruszonym śródbłonkiem. Poziom przepuszczalności naczyń krwionośnych można ocenić za pomocą prostej wizualizacji lub ilościowego pomiaru barwnika na miligram tkanki kontrolnej w porównaniu ze zwierzęciem/tkanką doświadczalną. Dwa potężne aspekty tego testu to jego prostota i cechy ilościowe. Barwnik Evans Blue można ekstrahować z tkanek poprzez inkubację określonej ilości tkanki w formamidzie. Maksimum absorbancji Evans Blue wynosi 620 nm, a minimum absorbancji 740 nm. Korzystając ze standardowej krzywej dla Evans Blue, pomiary gęstości optycznej można przekształcić w miligram barwnika wychwycony na miligram tkanki. W celu oceny istotnych różnic w przepuszczalności naczyń krwionośnych należy zastosować analizę statystyczną.
Wprowadzenie
Tworzenie i utrzymywanie selektywnych barier przepuszczalnych jest niezbędne dla prawidłowego rozwoju i wydajności organów 1,2. Komórki śródbłonka wyściełają światło naczynia krwionośnego i tworzą półprzepuszczalną barierę, która jest niezbędna w selektywnym transporcie między krwią a przestrzenią śródmiąższową wszystkich narządów. Odpowiednia bariera przepuszczalności jest utrzymywana dzięki ścisłym połączeniom komórka-komórka, które są ściśle kontrolowane przez czynniki wzrostu, cytokiny i inne cząsteczki związane ze stresem 3. Przerwanie bariery komórkowej śródbłonka może skutkować zwiększoną przepuszczalnością i nieszczelnością naczyń krwionośnych. Efekty te są widoczne w różnych stanach chorobowych, a zrozumienie leżącej u podstaw sygnalizacji molekularnej wymaga metod multidyscyplinarnych 4,5. W tym artykule opisujemy metodę pomiaru przepuszczalności naczyń in vivo za pomocą modelu mysiego.
Opisany przez nas test, znany również jako test Milesa, jest sprawdzoną metodą badania przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo. Test opiera się na fakcie, że w podstawowych warunkach fizjologicznych albumina nie przekracza bariery śródbłonka. Evans Blue, barwnik azowy o wysokim powinowactwie do albuminy, jest wstrzykiwany do krwiobiegu zwierzęcia doświadczalnego i w warunkach fizjologicznych oczekuje się, że zostanie ograniczony w naczyniach krwionośnych. Po dodaniu bodźca przepuszczalności naczyń krwionośnych, miejscowo lub ogólnoustrojowo, naczynia krwionośne zaczynają przeciekać białko, a tym samym także błękit Evansa, który jest związany z albuminą. Powoduje to szybkie niebieskawe zabarwienie tkanek, które mają przepuszczalne naczynia.
Udane wstrzyknięcie barwnika do żyły bocznej ogona myszy ma kluczowe znaczenie dla dobrego wyniku eksperymentu. Technika iniekcji do żyły ogonowej wymaga rozległej praktyki i powinna zostać opanowana przed rozpoczęciem eksperymentu.
Przepuszczalność naczyń jest wysoce zależna od wieku i wagi zwierzęcia, więc przy porównywaniu różnych szczepów myszy konieczne jest, aby myszy lub inne obiekty testowe miały prawie identyczne daty urodzenia i wagę. Innymi czynnikami wpływającymi na przepuszczalność bariery śródbłonkowej są warunki środowiskowe, takie jak temperatura, wilgotność i, co bardzo ważne, stres związany z obsługą myszy. Ze względu na mnogość czynników, które mogą mieć wpływ na wynik eksperymentu, zawsze zaleca się powtórzenie eksperymentu co najmniej trzy razy i przeprowadzenie analizy statystycznej.
Ten test może być używany lub do porównania przepuszczalności naczyń myszy, które zostały genetycznie zmodyfikowane, a także myszy o różnym pochodzeniu genetycznym. Przepuszczalność można ocenić w obecności lub braku bodźca, w zależności od funkcji genu, który jest modulowany. Test ten może być również stosowany lub do testowania wpływu różnych związków na przepuszczalność naczyń.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Dożylne wstrzyknięcie błękitu Evansa w boczną żyłę ogonową myszy
- Przygotuj 0,5% sterylny roztwór błękitu Evansa w PBS. W razie potrzeby przesterylizuj roztwór metodą filtra, aby usunąć wszelkie cząstki stałe, które nie uległy rozpuszczeniu.
- Odessać 200 μl roztworu Evans Blue do strzykawki. Należy unikać wszelkich pęcherzyków powietrza, które mogły wydostać się do strzykawki.
- Umieść myszy w wieku 8-12 tygodni w urządzeniu krępującym, aby zwierzę nie było swobodnie mobilne, ale można było dotykać jego ogona.
- Umieść urządzenie przytrzymujące mysz na boku, tak aby boczna żyła ogonowa była dobrze widoczna i skierowana do góry.
- Przytrzymaj ogon ręką niedominującą między kciukiem a palcem wskazującym.
- Włóż igłę (mały rozmiar, 27-30) pod kątem 10-15 stopni, skos do góry, wsuń się do bocznej żyły ogonowej w kierunku głowy. Trzymać igłę i strzykawkę równolegle do ogona.
- Nie wywieraj nacisku wstecznego, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się żyły.
- Powoli wstrzyknąć 200 μl roztworu Evans Blue do żyły ogonowej myszy.
- Zwróć uwagę na łatwość, z jaką tłok się do przodu, ponieważ jest to dowód prawidłowego umieszczenia igły w żyle.
- Włóż mysz z powrotem do klatki i obserwuj ją przez 30 minut.
2. Pobieranie organów i ekstrakcja niebieskiego barwnika Evansa z organów
- Poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Do celów testu Milesa zaleca się zwichnięcie szyjki macicy, ponieważ ogranicza ono znaczną ingerencję w przepuszczalność naczyń krwionośnych. Poświęć wszystkie myszy w tym samym czasie, tak szybko, jak to możliwe. Pracuj z kohortami składającymi się z 6 myszy lub mniej, ponieważ wkrótce po śmierci naczynia krwionośne stają się bardziej przepuszczalne.
- Połóż myszy na plecach i przypnij ich stopy do białej tablicy.
- Otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową, aby odsłonić narządy klatki piersiowej i jamy brzusznej.
- Zrób reprezentatywne zdjęcia, aby pokazać różnice w wynaczynieniu niebieskim Evansa. Uwzględnij wszystkie myszy w tym samym polu, aby uzyskać identyczne warunki oświetleniowe dla wszystkich myszy.
- Zbierz interesujące Cię narządy i umieść je w probówkach o pojemności 1,5 ml.
- Zważ pustą probówkę i sprowadź wartość wagi do zera.
- Przenieś próbkę tkanki i zważ ją. Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek tkanek. Tkanki można suszyć na powietrzu, aby wyeliminować zmienność zawartości wody między różnymi narządami.
- . Dodać 500 μl formamidu do każdej probówki z próbką tkanki.
- Przenieść wszystkie probówki do łaźni wodnej o temperaturze 55 °C lub bloku grzewczego. Inkubować przez 24-48 godzin, aby wyekstrahować błękit Evansa z tkanki.
3. Kwantyfikacja błękitu Evansa wynaczynionego w tkance śródmiąższowej
- Odwirować mieszaninę formamidu i błękitu Evansa, aby osadzać pozostałe fragmenty tkanek.
- Zmierzyć absorbancję przy 610 nm. Użyj 500 μl formamidu jako ślepej próby.
- Oblicz ng Evans Blue wynaczyniony na mg tkanki.
- Wykreśl wszystkie dane na wykresie.
- Wykonaj analizę statystyczną w celu określenia istotnych różnic.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystaliśmy test przepuszczalności in vivo do oceny przeciekania naczyń u myszy w wieku od 8 do 12 tygodni. Test ten jest użyteczny przy porównywaniu względnej przepuszczalności naczyniowej między zwierzętami o różnym podłożu genetycznym lub u osobników jednego szczepu myszy poddanych zabiegom wpływającym na układ naczyniowy. Nasze wyniki pokazują, że szczep myszy modyfikowanych genetycznie, stworzony w naszym laboratorium, wykazuje większą przepuszczalność śródbłonka w porównaniu z myszami typu dzikiego. Zm...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przepuszczalność naczyń krwionośnych jest krytycznym markerem stanu naczyń krwionośnych. Wykazano, że zwiększona przepuszczalność naczyń krwionośnych jest obecna w kilku chorobach ogólnoustrojowych, w tym cukrzycy, nadciśnieniu tętniczym i chorobach autoimmunologicznych 6,7,8. Wykazano, że zwiększona przepuszczalność naczyń krwionośnych jest spowodowana stresem ścinającym, czynnikami wzrostu, takimi jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych i czynnik wzrostu fibroblastów, mediatorami stanu zapalnego, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani konkurujących ze sobą.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem z National Institutes of Health, R01CA142928.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMID | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Fosforan 1.5M NaCl pH 7.4 | ||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| URZĄDZENIE PRZYTRZYMUJĄCE MYSZ | HARVARD APPARATUS | ||
| STRZYKAWKA | BD | 309659 | |
| IGŁY | BD | 305106 | Rozstaw igły zależy od wielkości zwierzęcia. |
| PRZYRZĄD DO POMIARU WAGI | DENVER | TP-64 |
Bibliografia
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
