Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Podsumowanie

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Streszczenie

Ta metoda opiera się na dożylnym wstrzyknięciu Evans Blue myszom jako testowemu modelowi zwierzęcemu. Błękit Evansa to barwnik wiążący albuminę. W warunkach fizjologicznych śródbłonek jest nieprzepuszczalny dla albuminy, więc albumina Evansa związana z błękitem pozostaje ograniczona w naczyniach krwionośnych. W stanach patologicznych, które sprzyjają zwiększonej przepuszczalności naczyń krwionośnych, komórki śródbłonka częściowo tracą bliskie kontakty, a śródbłonek staje się przepuszczalny dla małych białek, takich jak albumina. Ten warunek pozwala na wynaczynienie błękitu Evansa w tkankach. Zdrowy śródbłonek zapobiega wynaczynieniu barwnika w sąsiednich unaczynionych tkankach. Narządy o zwiększonej przepuszczalności będą wykazywały znacznie zwiększone niebieskie zabarwienie w porównaniu z narządami z nienaruszonym śródbłonkiem. Poziom przepuszczalności naczyń krwionośnych można ocenić za pomocą prostej wizualizacji lub ilościowego pomiaru barwnika na miligram tkanki kontrolnej w porównaniu ze zwierzęciem/tkanką doświadczalną. Dwa potężne aspekty tego testu to jego prostota i cechy ilościowe. Barwnik Evans Blue można ekstrahować z tkanek poprzez inkubację określonej ilości tkanki w formamidzie. Maksimum absorbancji Evans Blue wynosi 620 nm, a minimum absorbancji 740 nm. Korzystając ze standardowej krzywej dla Evans Blue, pomiary gęstości optycznej można przekształcić w miligram barwnika wychwycony na miligram tkanki. W celu oceny istotnych różnic w przepuszczalności naczyń krwionośnych należy zastosować analizę statystyczną.

Wprowadzenie

Tworzenie i utrzymywanie selektywnych barier przepuszczalnych jest niezbędne dla prawidłowego rozwoju i wydajności organów ^1,2. Komórki śródbłonka wyściełają światło naczynia krwionośnego i tworzą półprzepuszczalną barierę, która jest niezbędna w selektywnym transporcie między krwią a przestrzenią śródmiąższową wszystkich narządów. Odpowiednia bariera przepuszczalności jest utrzymywana dzięki ścisłym połączeniom komórka-komórka, które są ściśle kontrolowane przez czynniki wzrostu, cytokiny i inne cząsteczki związane ze stresem ³. Przerwanie bariery komórkowej śródbłonka może skutkować zwiększoną przepuszczalnością i nieszczelnością naczyń krwiono....

Protokół

1. Dożylne wstrzyknięcie błękitu Evansa w boczną żyłę ogonową myszy

1. Przygotuj 0,5% sterylny roztwór błękitu Evansa w PBS. W razie potrzeby przesterylizuj roztwór metodą filtra, aby usunąć wszelkie cząstki stałe, które nie uległy rozpuszczeniu.
2. Odessać 200 μl roztworu Evans Blue do strzykawki. Należy unikać wszelkich pęcherzyków powietrza, które mogły wydostać się do strzykawki.
3. Umieść myszy w wieku 8-12 tygodni w urządzeniu krępującym, aby zwierzę nie było swobodnie mobilne, ale można było dotykać jego ogona.
4. Umieść urządzenie przytrzymujące mysz na boku, tak aby boczna żyła ogonowa była dobrze widoczn....

Wyniki

Wykorzystaliśmy test przepuszczalności in vivo do oceny przeciekania naczyń u myszy w wieku od 8 do 12 tygodni. Test ten jest użyteczny przy porównywaniu względnej przepuszczalności naczyniowej między zwierzętami o różnym podłożu genetycznym lub u osobników jednego szczepu myszy poddanych zabiegom wpływającym na układ naczyniowy. Nasze wyniki pokazują, że szczep myszy modyfikowanych genetycznie, stworzony w naszym laboratorium, wykazuje większą przepuszczalność śródbłonka w porównaniu z myszami typu dzikiego. Zm.......

Dyskusja

Przepuszczalność naczyń krwionośnych jest krytycznym markerem stanu naczyń krwionośnych. Wykazano, że zwiększona przepuszczalność naczyń krwionośnych jest obecna w kilku chorobach ogólnoustrojowych, w tym cukrzycy, nadciśnieniu tętniczym i chorobach autoimmunologicznych ^6,7,8. Wykazano, że zwiększona przepuszczalność naczyń krwionośnych jest spowodowana stresem ścinającym, czynnikami wzrostu, takimi jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych i czynnik wzrostu fibroblastów, mediatorami stanu zapalnego, .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODAGENT
EVANS BLUE	SIGMA	E2129
FORMAMID	INVITROGEN	15515-026
PBS			0.2M Fosforan 1.5M NaCl pH 7.4
EQUIPMENT
SPECTROPHOTOMETER	EPPENDORF	952000006
URZĄDZENIE PRZYTRZYMUJĄCE MYSZ	HARVARD APPARATUS
STRZYKAWKA	BD	309659
IGŁY	BD	305106	Rozstaw igły zależy od wielkości zwierzęcia.
PRZYRZĄD DO POMIARU WAGI	DENVER	TP-64

340012