Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Podsumowanie

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Streszczenie

Siła działania klinicznych limfocytów T może być zwiększona poprzez połączenie terapii genowej z immunoterapią w celu opracowania produktu biologicznego, który ma potencjał do lepszego (i) rozpoznawania antygenów związanych z nowotworem (TAA), (ii) trwałości po infuzji, (iii) potencjału migracji do miejsc nowotworowych oraz (iv) zdolności do recyklingu funkcji efektorowych w mikrośrodowisku guza. Większość podejść do manipulacji genetycznej limfocytów T zmodyfikowanych do stosowania u ludzi wykorzystuje retrowirusa i lentiwirusa do stabilnej ekspresji CAR^1-3. Takie podejście, choć zgodne z obecną dobrą praktyką wytwarzania (GMP), może być kosztowne, ponieważ opiera się na wytwarzaniu i uwalnianiu rekombinowanego wirusa klasy klinicznej z ograniczonej liczby zakładów produkcyjnych. Elektrotransfer plazmidów niewirusowych jest atrakcyjną alternatywą dla transdukcji, ponieważ gatunki DNA mogą być wytwarzane do klasy klinicznej przy około 1/10 kosztu rekombinowanego wirusa klasy GMP. Aby poprawić efektywność integracji, dostosowaliśmy transpozon Śpiącej Królewny (SB) i transpozazę do stosowania u ludzi^4-8. Nasz system SB wykorzystuje dwa plazmidy DNA, które składają się z transpozonu kodującego dla interesującego nas genu (np. transgenu CAR specyficznego dla CD19^{drugiej generacji,} oznaczonego CD19RCD28) i transpozazy (np. SB11), która wprowadza transgen do powtórzeń dinukleotydu TA^9-11. Aby wygenerować klinicznie wystarczającą liczbę genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T, używamy sztucznych komórek prezentujących antygen pochodzących z K562 (aAPC) (klon #4) zmodyfikowanych do ekspresji TAA (np. CD19), a także cząsteczek kostymulujących limfocyty T CD86, CD137L, związanej z błoną wersji interleukiny (IL)-15 (peptyd połączony ze zmodyfikowanym regionem IgG4 Fc) i CD64 (receptor Fc-γ 1) do ładowania przeciwciał monoklonalnych (mAb)¹². W tym raporcie pokazujemy procedury, które można podjąć zgodnie z cGMP w celu wygenerowania limfocytów T CAR⁺ specyficznych dla CD19 odpowiednich do stosowania u ludzi. Osiągnięto to poprzez synchroniczny elektrotransfer dwóch plazmidów DNA, transpozonu SB (CD19RCD28) i transpozazy SB (SB11), a następnie pobranie stabilnych integrantów przez codzienne 7-dniowe dodatki (cykl stymulacji) napromieniowanego γ aAPC (klon #4) w obecności rozpuszczalnej rekombinowanej ludzkiej IL-2 i IL-21¹³. Zazwyczaj podejmowane są 4 cykle (28 dni ciągłej hodowli) w celu wygenerowania klinicznie atrakcyjnej liczby limfocytów T, które stabilnie wyrażają CAR. Ta metodologia wytwarzania limfocytów T specyficznych dla CD19 klasy klinicznej może być stosowana do limfocytów T pochodzących z krwi obwodowej (PB) lub krwi pępowinowej (UCB). Co więcej, podejście to można wykorzystać do generowania limfocytów T do różnych typów nowotworów poprzez sparowanie specyficzności wprowadzonego CAR z ekspresją TAA, rozpoznawanego przez CAR, na aAPC.

Protokół

Dzień 0 lub przed

1. Izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) od PB i UCB

1. Rozcieńczyć PB równą objętością, a UCB czterema objętościami PBS-EDTA.
2. Powoli nanieść rozcieńczoną krew (25 ml) na Ficoll (12 ml) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 400 x g przez 30 - 40 minut (bez hamulca).
3. Zebrać i przenieść frakcję komórek jednojądrzastych (granicę faz) za pomocą pipety transferowej do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
4. Zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą PBS-EDTA i odwirować przy 450 x g przez 10 minut.
5. Odessać supernatant, delikatnie zawiesić osad(y) komórkowy (osady) w 50 ml kompletnej pożywki hodowlanej (CCM) i odwirować przy 400 x g przez 10 minut.
6. Delikatnie ponownie zawiesić i zebrać granulki komórek w CCM i przeprowadzić zliczanie komórek przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego (wiolometr, program PBMC).
7. MNC może być teraz używany do elektroporacji (Nucleofection) lub kriokonserwacji do wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie limfocytów T do elektroporacji w dniu 0

1. W przypadku korzystania z kriokonserwowanego MNC należy szybko rozmrozić wystarczającą ilość komórek do elektroporacji na pełną skalę (2 x 10⁸ dodając ~ 20%, aby uwzględnić utratę komórek podczas wirowania i inkubacji trwającej 2 godziny) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Jeśli używasz świeżo odizolowanego MNC, przejdź do kroku 2.3.
2. Delikatnie zawiesić i przenieść komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości zawierającej wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną RPMI bez fenolu (PF-RPMI) i odwirować przy 200 x g przez 10 minut (bez hamulca), odsysać supernatant.
3. Ponownie zawiesić MNC w PF-RPMI, przeprowadzić zliczanie komórek (celometr) i przenieść komórki do naczynia (naczyń) do hodowli komórkowej o odpowiedniej wielkości w stężeniu^10-6 komórek/ml.
4. Inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 2 godziny ± 30 minut.
5. Przenieść MNC do sterylnej probówki (probówek) wirówkowej, wirować z prędkością 200 x g przez 5 minut (bez hamulców), odessać supernatant i delikatnie ponownie zawiesić i połączyć osad(y) komórek w PF-RPMI.
6. Wykonaj liczenie komórek (Cellometer) i oblicz wymaganą objętość zawiesiny komórek (2 x 10⁸ MNC).
7. Przenieść obliczoną objętość do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować z prędkością 200 x g przez 10 minut (bez hamulca).
8. Odessać supernatant tak, aby nie pozostały żadne resztki pożywki i delikatnie zawiesić ponownie, stukając w bok probówki.

3. Elektroporacja (nukleofekcja) MNC (proces na pełną skalę przy użyciu 10 kuwet) w dniu 0

1. Wstępnie inkubować sterylną 12-dołkową płytkę z 10 dołkami zawierającymi 4 ml ciepłego PF-RPMI w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO₂ .
2. Przygotuj i wstępnie podgrzej zestaw ludzkich komórek T Lonza Nucleofector Solution (odtworzony zgodnie z instrukcjami producenta, www.lonza.com) do temperatury otoczenia w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
3. Przygotować roztwór Nucleofector / główną mieszankę DNA, dodając 100 μl uzupełnionego roztworu Nucleofectora, 15 μg transpozonu (superskręcony plazmid DNA oznaczony jako CD19RCD28/pSBSO) i 5 μg transpozazy (superskręcony plazmid DNA oznaczony jako pCMV-SB11) na reakcję/kuwetę.
4. Rozproszyć osad komórkowy (od kroku 2.8), delikatnie stukając w bok probówki wirówkowej i ponownie zawiesić w roztworze Nucleofection/główna mieszanina DNA (końcowe stężenie komórek: 2 x 10⁷ komórek/100 μl).
5. Ostrożnie przenieś 100 μl zawiesiny komórek (z kroku 3.4) do każdej z dziesięciu (10) kuwet Lonza Nucleofection, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.
6. Postukaj raz w kuwetę i wykonaj elektroporację za pomocą programu U-014 (dla niestymulowanych limfocytów T).
7. Przenieść kuwety i płytkę 12-dołkową (krok 3.1) do BSC.
8. Pobrać elektroporowane komórki z każdej kuwety za pomocą pipety transferowej Amaxa z cienką końcówką, dodając ~500 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej z odpowiedniego dołka (12-dołkowa płytka przygotowana w kroku 3.1) i umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO₂ na 2 godziny ± 30 minut.
9. Po 2-godzinnej inkubacji zbierz i przenieś komórki ze wszystkich studzienek do sterylnej probówki wirówkowej.
10. Przemywać komórki przez odwirowanie przy 140 x g przez 8 minut, w temperaturze otoczenia, bez hamulca, zassać i wyrzucić supernatant tak, aby żadne pozostałości pożywki nie pokryły osadu komórkowego.
11. Rozproszyć osad komórkowy, delikatnie stukając w bok probówki wirówkowej i delikatnie ponownie zawiesić w CCM, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
12. Wykonaj zliczanie komórek i dostosuj stężenie komórek do 10⁶ komórek/ml w CCM.
13. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby (kolb) do hodowli komórkowych i umieścić na noc w inkubatorze.
14. Kroki procesu od 2.1 do 3.8 powtórzono dla kontroli: komórki transfekowane EGFP (5 x 10⁶ komórek/kuweta z 5 μg kontrolnym plazmidem superskręconym EGFP, pmaxGFP).

Dzień 1^{z 1 i} kolejne cykle stymulacji

4. Analiza ekspresji CAR za pomocą cytometrii przepływowej w dniu 1

1. Zbierz elektroporowane ogniwa i przeprowadź liczenie komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego (hemocytometr).
2. Komórki barwione (1 do 2 x 10⁶) przeciwciałem specyficznym dla CD3, CD4, CD8 i ludzkiej IgG Fcγ (jako pomiar ekspresji CAR).
3. Pozyskaj komórki w FACS Calibur i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania FCS Express, aby obliczyć ekspresję CAR.
   1. Oblicz komórki CAR⁺ w hodowli według wzoru:
      (Liczba komórek zdolnych do życia) x (% komórek CAR⁺) = Liczba komórek CAR⁺

5. Przygotowanie aAPC (klon #4) w dniu 1. aAPC (klon #4) pochodziły z komórek K562 (linia rodzicielska uzyskana z kolekcji kultur typu amerykańskiego) w celu koekspresji pożądanej cząsteczki kostymulującej limfocyty T

1. Rozmrozić podwielokrotność zamrożonego napromieniowanego aAPC o stężeniu 100 Gy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Komórki przemywać się dwukrotnie przez odwirowanie w stężeniu 400 x g, przez 10 minut w CCM i zliczać za pomocą celometru (wykluczenie błękitu trypanowego).
3. Obliczać liczbę żywotnych aAPC wymaganych do stymulacji:
   (Liczba komórek CAR⁺) x 2 = wymagana liczba napromieniowanych aAPC

6. Stymulacja limfocytów T CAR⁺ za pośrednictwem APC w dniu 1 Początek pierwszego i kolejnych cykli stymulacji

1. Wymieszaj elektroporowane ogniwa (wykazujące ekspresję CAR) i napromieniowany γ aAPC (klon #4) w sterylnym pojemniku w stosunku 1:2 (ogniwo CAR⁺: żywotne aAPC) w CCM.
   1. Należy zauważyć, że współczynnik aAPC jest dostosowywany do ekspresji CAR na podstawie cytometrii przepływowej następnego dnia po elektroporacji.
2. Dodać IL-21 (30 ng/ml) do zawiesiny komórek.
3. Podwielokrotność porcji umieścić w kolbie(-ach) T-75 cm² i/lub workach Vue Life Culture o stężeniu 10-6 komórek/ml i ponownie umieścić w inkubatorze.

dni 3, 5

7. Kontynuacja hodowli limfocytów T CAR⁺

1. Wykonaj zmianę półpożywki, uzupełnij IL-21 i utrzymuj limfocyty T w stężeniu^10-6 komórek/ml.

Dzień 7

8. Koniec pierwszego cyklu stymulacji za pośrednictwem APC

1. Zbierz komórki, policz i wybarwij pod kątem CD3, CD4, CD8 i Fcγ (CAR) i przejdź do kroku 10.1.

9. Wyczerpanie komórek CD56⁺ (zwykle między 7 a 14 dniem po elektroporacji)

1. Wykonaj zubożenie CD56 za pomocą kulek paramagnetycznych, jeśli limfocyty^neg CD56 + CD3 ≥ 10%.

Cykle stymulacji #2, #3, & #4 odpowiadające dniom 8 → 14, dniom 15 → 21 oraz dniom 22 → 28

10. Rekurencyjne dodawanie aAPC do propagacji limfocytów T do klinicznie wystarczającej liczby

1. Powtórz proces stymulacji (4 razy) zgodnie z opisem w krokach 4.3-8.1.
2. Dodaj IL-2 (50U/ml) do kultur, zaczynając w dniach 7, 14 i 21, a następnie przy każdej zmianie pożywki (trzy razy w tygodniu, według harmonogramu poniedziałek-środa-piątek).
3. W razie potrzeby należy dokonać kriokonserwacji (archiwum) nadmiaru limfocytów T.
   1. Limfocyty T zamrożone przy użyciu zamrażarki o kontrolowanej szybkości.

Dzień 28

11. Koniec ostatniego cyklu stymulacji za pośrednictwem aAPC: Pobieranie limfocytów T

1. Kriokonserwowane limfocyty T do testowania uwalniania i infuzji.

Wyniki

Raportujemy, że elektrotransfer plazmidów DNA oraz propagacja limfocytów T na sztucznych komórkach prezentujących antygen (aAPC) naświetlanych promieniami γ mogą być wykorzystane do generowania klinicznie istotnej liczby limfocytów T pochodzących z krwi obwodowej (PB) i krwi pępowinowej (UCB) do zastosowań u ludzi. Te genetycznie zmodyfikowane limfocyty T wykazują ekspresję wprowadzonego CAR, który rozpoznaje antygen związany z nowotworem (TAA) CD19, niezależnie od głównego kompleksu zgodności tkankowej. Pochodne od SB plazmidy DNA służące do ekspresji (i) transpozonu, 2^nd generacja CAR (CD19RCD28), która sygnalizuje poprzez CD28 i CD3-ε¹⁴oraz (ii) transpozazę SB11¹⁵zostały wcześniej opisane¹³,^16,17Plazmidy wykorzystane w niniejszym badaniu zostały dostarczone komercyjnie przez Waisman Clinical Biomanufacturing Facility (Madison, WI). aAPC (klon nr 4), pochodzące z komórek K562 (linia rodzicielska pozyskana z American Type Culture Collection), koekspresują pożądane cząsteczki kostymulujące limfocytów T (każda wprowadzona cząsteczka w poziomie ³90% na powierzchni komórkowej aAPC), zgodnie z wcześniejszym opisem¹²W niniejszym opracowaniu wykazujemy, że CD19-specyficzne limfocyty T mogą zostać wygenerowane z mononuklearnych komórek krwi (MNC) pochodzących z krwi obwodowej (PB) lub krwi pępowinowej (UCB), wykorzystując transpozycję SB do wprowadzenia CAR, a następnie dodając aAPC w celu numerycznej ekspansji limfocytów T w sposób zależny od CAR (Ryciny 1, 4)^13,18Dziesięć kuwet (2x10⁷ MNC/kuwety) są poddawane elektroporacji dla każdego biorcy przy użyciu 15 μg plazmidu DNA (CD19RCD28/pSBSO) kodującego transpozon (CAR) oraz 5 μg plazmidu DNA (pCMV-SB11) kodującego transpozazę (SB11). Liczbę kuwet można zmniejszyć w przypadku ograniczonej dostępności MNC lub w celu dostosowania skali do pracy laboratoryjnej. Dzień elektroporacji definiuje się jako „Dzień 0” pierwszego cyklu stymulacji. Jako kontrole dla cytometrii przepływowej i warunków hodowli, autologiczne limfocyty T poddawane są elektroporacji pozornej (bez plazmidu DNA) i namnażane numerycznie na γ-naświetlonych aAPC (klon #4), które uprzednio załadowano przeciwciałem OKT3 w celu sieciowania CD3 i podtrzymania proliferacji limfocytów T. Rutynowo oceniamy wydajność elektrotransferu oraz żywotność limfocytów T dzień po elektroporacji (Rycina 2B). Ekspresja EGFP z kontrolnego plazmidu DNA (oznaczonego jako pmaxGFP) oraz CAR w tym początkowym punkcie czasowym odzwierciedla ekspresję białek z plazmidu zintegrowanego i episomalnego. Zazwyczaj dzień po elektroporacji mierzymy ekspresję EGFP na poziomie ~60% oraz ekspresję CAR na poziomie ~40% (Rysunek 2A) przy żywotności limfocytów T na poziomie 40-50%. Rekurencyjne dodawanie naświetlanych promieniami γ aAPC w obecności rozpuszczalnej rekombinowanej ludzkiej IL-2 i IL-21 pozwala na odzyskanie limfocytów T stabilnie ekspresjonujących CAR (CD19RCD28). CD3^negatywnyCD56⁺ Komórki NK są usuwane z hodowli przy użyciu paramagnetycznych kulek specyficznych dla CD56, jeśli ich odsetek wynosi ≥10%, a w szczególności wtedy, gdy odsetek CAR ekspresyjne na komórkach T jest niski. Deplecja ta zapobiega szybkiemu przerostowi komórek NK, który utrudnia zdolność aAPC do podtrzymania proliferacji CAR.⁺ limfocyty T. Okazyjnie, eliminacja komórek NK z CAR⁺ izolację limfocytów T przeprowadza się podczas dwóch ostatnich cykli stymulacji, jednak powoduje to utratę pożądanych komórek ze względu na koekspresję CD56 na niektórych CAR⁺ Limfocyty T. Limfocyty T były hodowane w funkcjonalnie zamkniętym systemie z wykorzystaniem worków hodowlanych Vue Life po 14. dniu. Podzbiór genetycznie zmodyfikowanych i propagowanych limfocytów T jest zazwyczaj krio konserwowany w 14. lub 21. dniu (koniec 2. lub 3. cyklu stymulacji) kokultury na aAPC, aby służyć jako archiwizowane materiały do przyszłych analiz oraz w celu rozmrożenia w przypadku wystąpienia nieprzewidzianych problemów podczas procesu wytwarzania. Limfocyty T są zazwyczaj zbierane w 28. dniu hodowli lub w okolicy tego terminu (Rysunek 3), które rutynowo wykazują ekspresję >90% CAR i są >80% żywotności (Rysunek 2C, D). Wykazaliśmy wcześniej, że po czterech tygodniach kokultury na aAPC średni stopień ekspansji limfocytów T CD3+ wynosi 19 800 ± 11 313 w przypadku CAR⁺ ekspresja wynosząca 90%±7,5 ¹³Limfocyty T te są kriokonserwowane i poddawane badaniom w trakcie procesu oraz badaniom zwolnieniowym, które dostarczają informacji o bezpieczeństwie i potencjale terapeutycznym wytworzonego produktu. Badania zwolnieniowe są przeprowadzane zgodnie z poprawkami dotyczącymi ulepszenia laboratoriów klinicznych (CLIA) w celu wygenerowania certyfikatu analizy przed infuzją do biorców w ramach badań klinicznych.

Rysunek 1. Kroki opisujące proces elektroporacji i propagacji komórek CAR+ T z PB i UCB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 2. Charakterystyka genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T z krwi obwodowej (PB). (A) Ekspresja EGFP w dniu 0 pierwszego cyklu stymulacji w celu oceny wydajności transferu genów. Ekspresja swoistego dla CD19 CAR (CD19RCD28) oceniana metodą cytometrii przepływowej w limfocytach T CD3⁺, CD8⁺ i CD4⁺ (B) około 24 h po elektroporacji oraz (C) 28 dni po kokulturze z aAPC. Podobną ekspresję CAR zaobserwowano w limfocytach T pochodzących z krwi pępowinowej (UCB). (D) Kinetyka ekspresji CAR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 3. Propagacja komórek CAR⁺ T pochodzących z PB. Szybkość ekspansji liczbowej komórek CD3⁺ i CAR⁺ T pochodzących z PB poprzez powtarzającą się współhodowlę na aAPC naświetlonych promieniami γ w obecności rekombinowanych ludzkich rozpuszczalnych IL-2 i IL-21. Strzałki skierowane w górę wskazują momenty dodawania naświetlonych promieniami γ aAPC, które wyznaczają początek każdego cyklu stymulacji. Komórki CAR⁺ T pochodzące z UCB wykazują podobną szybkość ekspansji liczbowej.

Rycina 4. Schemat procesu wytwarzania z wykorzystaniem systemów SB i aAPC do modyfikacji genetycznej i propagacji komórek CAR⁺ T pochodzących z PB i UCB. Komórki CAR⁺ T specyficzne dla CD19 zostały wygenerowane poprzez elektrotransfer superzwiniętych plazmidów DNA pochodzących z SB i późniejszą ko-kulturę na aAPC pochodzących z K562 (klon #4) w obecności rekombinowanych ludzkich rozpuszczalnych IL-2 i IL-21. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Źródło limfocytów T	Transpozon*	Transpozaza	Infuzja limfocytów T	Nr IRB	Nr NIH-OBA	Nr IND
Autologiczne (pochodzące od pacjenta)**	CD19RCD28	SB11	Po autologicznym przeszczepieniu komórek macierzystych krwiotwórczych	2007-0635	0804-922	14193
Allogeniczne (pochodzące od dawcy)	CD19RCD28	SB11	Po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych krwiotwórczych	2009-0525	0910-1003	14577
Allogeniczne (pochodzące od dawcy)	CD19RCD28	SB11	Po allogenicznym przeszczepieniu krwi pępowinowej	2010-0835	1001-1022	14739

Tabela 1. Badania kliniczne pod auspicjami FDA w MDACC dotyczące infuzji CD19-specyficznych komórek CAR+ T namnażanych na aAPC. *Komórki T zostają uczynione specyficznymi dla CD19 poprzez wymuszoną ekspresję transpozonu SB kodującego CAR 2^nd generacji, oznaczonego jako CD19RCD28, który sygnalizuje poprzez CD28 i CD3-z. **Badanie opisane w referencji nr 7

Dyskusja

Transpozon i systemy transpozazy, takie jak piggyBac^12,19 i SB^18,20-22, są niewirusowymi podejściami do terapii genowej, które stanowią alternatywę dla transdukcji za pośrednictwem wirusa limfocytów T CAR⁺ klasy klinicznej. SB został wybrany jako system transferu genów na podstawie jego potencjału w terapii genowej u ludzi^1,6,23. Opracowaliśmy podwójne technologie transpozycji SB (w celu wprowadzenia CAR) i rekurencyjnego dodawania napromieniowanego γ aAPC (w celu odzyskania genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T stabilnie eksprymujących CAR), aby służyły jako technologie platformowe w produkcji limfocytów T specyficznych dla TAA zgodnie z cGMP dla badań fazy I / II (Figura 4). Po 28 dniach (cztery 7-dniowe cykle stymulacji) wspólnej hodowli na napromieniowanym γ aAPC, zazwyczaj jesteśmy w stanie wygenerować co najmniej ~^{10 10} genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T nadających się do zastosowań u ludzi. W razie potrzeby można podjąć dodatkowe cykle stymulacji w celu wygenerowania większej liczby genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T. Ponadto, jeśli potrzeba mniej limfocytów T ^CAR+ , podejście do elektroporacji i propagacji można ograniczyć, stosując mniej kuwet i przenosząc tylko podzbiór numerycznie rozszerzonych limfocytów T do kolejnych rund proliferacji na aAPC na początku każdego cyklu stymulacji. Większość elektroporowanych i rozmnożonych limfocytów T pobranych do infuzji stabilnie wyraża CAR. Wzrost limfocytów T CD4 ⁺ i CD8 ⁺ wyrażających nasz CAR 2^{. generacji obejmuje} komórki o fenotypie pamięciowym / naiwnym i wykazuje trzy cechy charakterystyczne dla przekierowanej specyficzności. Po pierwsze, genetycznie zmodyfikowane limfocyty T specyficznie lizują cele CD19 ⁺ , po drugie, wytwarzają IFN-γ w odpowiedzi na komórki stymulujące CD19 ⁺ , a po trzecie, proliferują w odpowiedzi na komórki karmiące CD19 ⁺ , a wszystko to w sposób zależny od CAR^13,18. Nasze podejście do integracji transgenu CAR poprzez elektrotransfer niewirusowych plazmidów DNA z systemu SB można zastosować w spoczynkowych pierwotnych limfocytach T pochodzących z PB i UCB. My i inni mamy genetycznie zmodyfikowane komórki K562, aby służyły jako aAPC do efektywnej propagacji klinicznie wystarczającej liczby limfocytów T do infuzji^24,25. Środowisko aAPC i hodowli tkankowej (np. dodanie IL-21) zostały zmodyfikowane w celu wytworzenia limfocytów T CD19 specyficznych dla pacjenta i dawcy do infuzji po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (Tabela 1)^13,18. Możemy wyprodukować limfocyty T CAR + z PB po prostu uzyskane przez nakłucie żyły, co pozwala uniknąć kosztów, dyskomfortu i niedogodności związanych z uzyskaniem MNC z PB przez aferezę. Zdolność do pozyskiwania dużej liczby limfocytów T CAR⁺ z niewielkiej liczby MNC jest szczególnie atrakcyjna do podawania limfocytów T po allogenicznym przeszczepie UCB. Niewielki rozmiar i anonimowość dawcy noworodka wykluczają ponowny dostęp do tego osobnika w późniejszym czasie, a tylko ograniczona liczba pobranych MNC jest dostępna jako materiał wyjściowy do produkcji limfocytów T, aby uniknąć ingerencji w hematopoezę. Obecnie trwają dalsze postępy w procesie produkcyjnym, w tym wysokowydajne urządzenie do elektroporacji w połączeniu z całkowicie zamkniętym bioreaktorem WAVE, aby zminimalizować obsługę. Podsumowując, SB i aAPC są atrakcyjnymi platformami do generowania limfocytów T CAR⁺ specyficznych dla CD19, które można przystosować do generowania dużej liczby genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T, które mogą rozpoznawać alternatywne TAA na powierzchni komórki zgodnie z cGMP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
DNA plazmid eksprymujący GFP (pmaxGFP)	Lonza	VPA-1002 (zestaw)
PBS	Sigma	D8537
CliniMACS PBS-EDTA	Miltenyi Biotec	70026
HyQ RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30096.01
Bez fenolu RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30605.01
Hyclone Płodowa surowica bydlęca	Thermo Scientific	SH3007003HI
GlutaMAX (100x)	Gibco	3505-061
Ficoll-Paque	GE Healthcare Biosciences	17-1440-02
Rekombinowana ludzka IL-21	PeproTech	AF-200-21
Rekombinowana ludzka IL-2 (Proleukina)	Novartis	NDC 65483-116-07
Zestaw ludzkich limfocytów T (roztwór Nucleofectora)	Lonza	VPA-1002
Odczynnik CliniMACS CD56	Miltenyi	70206
FITC-sprzężony z mysim mAb specyficznym dla ludzkiego CD3	BD Biosciences	349201
sprzężony z mysim mAb specyficznym dla ludzkiego CD4	BD Biosciences	340443
PerCPCy5.5 skoniugowany z mysim mAb specyficznym dla ludzkiego CD8	BD Biosciences	341051
PE sprzężony z F(ab')2 fragmentem koziego przeciwciała specyficznego dla ludzkiego Fcγ	Invitrogen	H10104
Azydek sodu	Sigma	S2002
Jednorazowe
12-dołkowa płytka	Corning	3513
T-75 cm2	Corning	430641
Worki do hodowli	Vue Life	290C; 750C
50 ml probówka wirówkowa	BD Biosciences	352098
Equipment
Amaxa Nuceleofector II	Lonza	AAB-1001
Celometr	Nexcelom Bioscience	Wirówka Vision
Sorvall Legend RT	Sorvall	75004377
BD FACS Calibur	BD Biosciences	342975
Zamrażarka z kontrolowaną szybkością	Strugarka	Kryo 750
Irradiator	CIS bio International	IBL-437 C#09433
Ekspresja cząsteczek (endogennych i wprowadzonych) Cell Line Nazwa zwyczajowa Typ komórki Molecules Expressed CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Klon 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP ulegające jednoczesnej ekspresji z IL-15 związanym z błoną IL-15 Complete Culture Medium (CCM) (przechowywane w temperaturze 4 & deg; C do 30 dni) HyQ RPMI-1640/Bez fenolu RPMI-1640 10% FBS 1% GlutaMAX Flow Cytometry Buffer (przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C do 30 dni) PBS 2% FBS 0,1% Azek sodu