Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Podsumowanie

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek. W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9^ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Streszczenie

Jednym z kluczowych zadań każdej żywej komórki jest utrzymanie prawidłowego fałdowania nowo zsyntetyzowanych białek w obliczu ciągle zmieniających się warunków środowiskowych i środowiska wewnątrzkomórkowego, które jest ciasno upakowane, lepkie i niebezpieczne dla stabilności białka¹. Zdolność do dynamicznego równoważenia produkcji, fałdowania i degradacji białek wymaga wysoce wyspecjalizowanych maszyn kontroli jakości, których absolutna konieczność jest najlepiej obserwowana w przypadku awarii. Choroby takie jak ALS, choroba Alzheimera, Parkinsona i niektóre formy mukowiscydozy mają bezpośredni związek ze składnikami kontroli jakości fałdowania białek², a zatem przyszły rozwój terapeutyczny wymaga podstawowej wiedzy na temat procesów leżących u ich podstaw. Naszym eksperymentalnym wyzwaniem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki integrują sygnały uszkodzeń i montują odpowiedzi, które są dostosowane do różnych okoliczności.

Głównym powodem, dla którego nieprawidłowe fałdowanie białek stanowi egzystencjalne zagrożenie dla komórki, jest skłonność nieprawidłowo pofałdowanych białek do agregacji, powodując w ten sposób globalne zakłócenia w zatłoczonym i delikatnym środowisku fałdowania wewnątrzkomórkowego¹. Fałdowane zdrowie lub "proteostaza" proteomu komórkowego jest utrzymywane, nawet pod presją starzenia się, stresu i uszkodzeń oksydacyjnych, dzięki skoordynowanemu działaniu różnych jednostek mechanistycznych w skomplikowanym systemie kontroli jakości^3,4. Wyspecjalizowana maszyneria molekularnych białek opiekuńczych może wiązać nienatywne polipeptydy i promować ich fałdowanie do stanu natywnego¹, kierować je do degradacji przez układ ubikwityna-proteasom⁵ lub kierować je do ochronnych inkluzji^{agregacji 6-9}.

U eukariontów ładunek kontroli jakości agregacji cytozolowej jest podzielony między dwa przedziały^8-10: przedział kontroli jakości juxtanuclear (JUNQ) i nierozpuszczalny depozyt białkowy (IPOD) (Rysunek 1 - model). Białka, które są ubikwitynowane przez maszynerię kontroli jakości fałdowania białek, są dostarczane do JUNQ, gdzie są przetwarzane w celu degradacji przez proteasom. Nieprawidłowo sfałdowane białka, które nie są ubikwitynowane, są kierowane do IPOD, gdzie są aktywnie agregowane w komorze ochronnej.

Do tego momentu, metodologiczny paradygmat mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek polegał głównie na oznaczaniu białek i śledzeniu ich lokalizacji w komórce w określonych punktach czasowych i zazwyczaj w dwóch wymiarach. Ponieważ nowe technologie zaczęły zapewniać eksperymentatorom bezprecedensowy dostęp do skali submikronowej w żywych komórkach, dynamiczna architektura cytozolu stała się postrzegana jako nowa, wymagająca granica dla charakterystyki eksperymentalnej. Przedstawiamy metodę szybkiego monitorowania rozkładów przestrzennych 3D wielu białek znakowanych fluorescencyjnie w cytozolu drożdży w czasie. Timelapse 3D (obrazowanie 4D) to nie tylko wyzwanie techniczne; Przeciwnie, ułatwia również radykalną zmianę w ramach pojęciowych używanych do analizy struktury komórkowej.

Używamy cytozolowego białka czujnika fałdowania w żywych drożdżach, aby uwidocznić różne losy nieprawidłowo sfałdowanych białek w kontroli jakości agregacji komórkowej, używając szybkiego obrazowania fluorescencyjnego 4D. Wrażliwy na temperaturę mutant białka Ubc9^10-12 (Ubc9^ts) jest niezwykle skuteczny zarówno jako czujnik proteostazy komórkowej, jak i fizjologiczny model do śledzenia kontroli jakości agregacji. Podobnie jak w przypadku większości białek ts, Ubc9^ts jest w pełni sfałdowany i funkcjonalny w dopuszczalnych temperaturach dzięki aktywnym komórkowym białkom opiekuńczym. Powyżej 30 °C lub gdy komórka stoi w obliczu stresu związanego z nieprawidłowym fałdowaniem, Ubc9^ts ulega nieprawidłowemu fałdowaniu i podąża za losem natywnego białka globularnego, które zostało nieprawidłowo sfałdowane z powodu mutacji, denaturacji cieplnej lub uszkodzenia oksydacyjnego. Łącząc go z GFP lub innymi fluoroforami, można go śledzić w 3D, gdy tworzy ogniska naprężeń lub jest kierowany do JUNQ lub IPOD.

Protokół

1. Preparaty drożdżowe

1. Przekształć szczepy drożdży za pomocą plazmidu przenoszącego kasetę GAL1-GFP-Y68L (UBC9^ts).
2. Drożdże hodować w pożywkach syntetycznych zawierających 2% rafinozy przez 24 godziny i ponownie rozcieńczać do 2% pożywki zawierającej galaktozę przez 16 godzin lub O/N. Inkubować komórki w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.
3. Następnego ranka rozcieńczyć szczep zapytania do OD₆₀₀ = 0,2. Wstrząsać przez 4-6 godzin w temperaturze 30 °C (200 obr./min), aż kultura osiągnie OD₆₀₀ = 0,8-1,0.
4. Aby stłumić ekspresję (tak, aby monitorować tylko już translowaną i złożoną pulę GFP-Ubc9^ts), zmień pożywkę na pożywkę syntetyczną uzupełnioną 2% glukozą (SD) 30 minut przed obrazowaniem.
5. Leczenie - Szok termiczny komórek przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu wywołania nieprawidłowego fałdowania lub w sposób ciągły w inkubatorze mikroskopowym w celu śledzenia agregacji białek w warunkach szoku cieplnego. Uwaga - jeśli używasz mikroskopu w dowolnej temperaturze powyżej RT, podgrzewaj go przez około 2 godziny, aby zrównoważyć temperaturę wzdłuż korpusu mikroskopu i obiektywów (patrz poniżej).

2. Płyta\Przygotowanie slajdów

1. Wybierz odpowiednią płytę. Główną kwestią jest zdolność do utrzymania ostrości podczas akwizycji obrazowej. Poniższe punkty mają kluczowe znaczenie dla obrazowania 4D, a nie dla poklatków 2D lub obrazowania 3D.
   1. Płyta z wieloma studniami - dno różnych studni może nie być jednorodne (tj. studnie będą znajdować się na różnych wysokościach w stosunku do celu). Utrudni to utrzymanie ostrości w punktach x y i punktach czasowych, niezależnie od zastosowanej techniki automatycznego ustawiania ostrości.
   2. Materiał prowadnicy: szkło kontra plastik. Szkiełka ze szklanym dnem są bardziej jednorodne między studzienkami, ale są droższe.
   3. Grubość dna płyty: zwykle używamy płyt nakrywkowych o indeksie 1,5, ale indeks 1 jest również dopuszczalny w zależności od obiektywu.
2. Przykryj spód płytki\szkiełka ConA (0,25 mg/ml) przez 10 minut. ConA służy do przylegania komórek do szkiełka, co umożliwia śledzenie pojedynczej komórki w czasie.
3. Usuń ConA i inkubuj szkiełko w kapturze chemicznym, aby nadmiar ConA wyparował.
4. Wprowadzić 200 μl próbki drożdży (OD₆₀₀ = 0,5) do studzienki ConAed.
5. Inkubować przez 15 minut, aby komórki przykleiły się do powierzchni płytki.
6. Wyekstrahuj pożywkę i przemyj trzy razy nową pożywką, aby uzyskać jedną warstwę komórek. Uwaga: jeśli planowany jest długi upływ czasu, wysiewaj komórki rzadko, aby nowe pąki nie wypełniły i nie przerwały interesującego obszaru.

3. Preparaty mikroskopowe

1. Używamy mikroskopu konfokalnego Nikon A1Rsi z kilkoma niestandardowymi modyfikacjami. Do obrazowania drożdży używamy do 4 laserów (405 nm, 50 mW CUBE laser; 457-514 nm, 65 mW laser Argon Ion; 561 nm, 50 mW laser szafirowy oraz 640 nm, 40 mW CUBE) oraz do 4 PMT wyposażonych w filtry. Większość naszych obrazowań odbywa się za pomocą zestawu zielonych filtrów dla EGFP i czerwonego zestawu filtrów dla mCherry i tdTomato. W przypadku GFP i mCherry prawie nie ma przebijania, dlatego często korzystamy ze skanowania symultanicznego. Jednak skanowanie liniowe może być również stosowane, aby zapobiec krwawieniu, gdy do niego dojdzie. Nasz konfokus jest również wyposażony w stolik PInano Piezo (MCL), który może wykonywać kroki 3 ms w z, umożliwiając 2-3 stosy z (30-50 sekcji) na sekundę. System posiada również detektor spektralny, Perfect Focus (laser offset) oraz dwa skanery - skaner galwanowy i skaner rezonansowy.
2. Wybierz odpowiedni cel. Główne zagadnienia:
   1. Obiektyw woda/olej/powietrze: głównym czynnikiem jest współczynnik załamania światła ośrodka obrazowania w porównaniu z medium próbki.
      1. Obiektywne zalety oleju:
         1. Obiektywy olejowe mogą mieć większe apertury numeryczne (olej bardziej rozbija światło niż woda, a zatem więcej fotonów wraca do obiektywu). Cele olejowe mogą mieć do 1,49 NA, w porównaniu do 1,27 dla wody. (Jednak w rzeczywistości nie jest to ogromna różnica w rozdzielczości).
         2. Współczynnik załamania światła oleju odpowiada współczynnikowi załamania światła szkła, dlatego żadne fotony nie są tracone od próbki, przez szkło, do obiektywu. (Uwaga - wybierz olejek immersyjny, który ma współczynnik załamania światła odpowiedni dla Twojego obiektywu i szkiełka nakrywkowego).
         3. Olej umożliwia bezproblemowe długie upływy czasu, ponieważ nie paruje.
         Wady obiektywu olejowego:
         1. Wyższa rozdzielczość możliwa dzięki wyższemu poziomowi azotu w obiektywach olejowych ulega szybkiej degradacji, jeśli światło musi przejść przez ośrodek wodny (taki jak komórka).
         2. Obrazy zazwyczaj mają więcej aberracji sferycznych i efekt "rozciągnięcia" w 3D.
         3. Olej jest lepki, brudny i stanowi zagrożenie dla celów.
      2. Zalety obiektywu wodnego
         1. Sama komórka jest wodnista, dlatego w z występuje mniej zniekształceń, a rozdzielczość pozostaje wysoka głęboko w próbce wodnej.
         2. Czysty i przyjazny dla użytkownika. Wady celu wodnego: szybko odparowuje, dlatego nie nadaje się do długich filmów bez specjalnych ustaleń dotyczących ciągłego pompowania wody do celu.
      3. Obiektywne zalety powietrza: 1. Żaden materiał nie jest tracony/paruje podczas wielokrotnego pozyskiwania punktów lub długiego filmu. 2. Czysty i przyjazny dla użytkownika. Wada: niska rozdzielczość i niska czułość sygnału.
   2. Temperatura w pomieszczeniu i inkubatorze: zmiana temperatury wpływa na właściwości materii, a w delikatnych systemach zmienia ostrość. Temperaturę należy dostosować przed wyborem punktów do akwizycji. Zmiana temperatury podczas akwizycji zakłóci obrazowanie i spowoduje utratę ostrości. Przed obrazowaniem pozwalamy, aby nasz system mikroskopowy równoważył się przez 2 godziny w żądanej temperaturze.
   3. Kołnierze korekcyjne: Wiele obiektywów jest wyposażonych w pierścień korekcyjny, który umożliwia dostosowanie obiektywu do danej grubości szkiełka nakrywkowego. Zalecamy regulację kołnierza korekcyjnego przy użyciu koralików fluorescencyjnych w celu wizualizacji funkcji punktowego rozprowadzania. Zapewni to prawidłowe ustawienia dla każdej próbki.
   4. Stabilne uchwyty na próbki: stwierdzamy, że większość dostępnych na rynku uchwytów na próbki jest najsłabszą częścią mikroskopu. Często są chwiejne i nie proste. Jest to katastrofa dla wielopunktowego obrazowania 4D o wysokiej rozdzielczości. Projektujemy własne uchwyty na próbki, które są proste i ściśle przylegają do sceny. W razie potrzeby można je również przykręcić.
   5. Akwizycja wielopunktowa: nasz system obrazowania jest wyposażony w system "Perfect focus" firmy Nikon, który jest w zasadzie laserowym mechanizmem automatycznego ustawiania ostrości. Jednak autofokus niekoniecznie jest konieczny w przypadku obrazowania 4D, zwłaszcza jeśli system nie dryfuje zbytnio.

4. Obrazowanie

1. Włącz system: lasery, scenę, kontroler, kamerę i oprogramowanie komputerowe.
2. Umieść płytkę na uchwycie sceny, odpowiednio zabezpieczoną i ustabilizowaną.
3. Użyj portu oka, aby określić lokalizację i orientację drożdży.
4. Korzystając z jasnego pola, oceń zdrowie i żywotność komórek zgodnie z kształtem i teksturą.
5. Włącz światło epifluorescencyjne zgodnie z odpowiednim fluoroforem (np. filtrem FITC dla GFP) i skup się na komórkach wykazujących fenotyp, który jest przedmiotem Twoich badań. Komórki, które są wysoce fluorescencyjne na więcej niż jednej długości fali, mogą być martwe, a zatem autofluorescencyjne. Wizualizujemy jądro za pomocą fluoroforu tdTomato połączonego z sygnałem SV40 NLS (NLS-TFP). TFP jest dwa razy większy od GFP, a zatem znajduje się powyżej granicy dyfuzji jądra, dlatego bardzo dobrze sprawdza się jako marker jądrowy. Możemy również wzbudzić TFP za pomocą zielonego (488 nm) lasera jednocześnie jako GFP, ale zebrać zielone i czerwone emisje do dwóch oddzielnych PMT w celu uzyskania rozdzielczości spektralnej.
6. Dostosuj następujące ustawienia, aby zminimalizować szumy i przesycenie:
   1. Należy wziąć pod uwagę moc lasera - fotowybielanie i fototoksyczność w porównaniu z jasnością obrazu.
   2. Wzmocnienie: wpływa na czułość kamery, a tym samym na stosunek sygnału do szumu.
   3. Średnica otworka - powinna być dostosowana do lasera o krótszej długości fali. Średnica otworu określa grubość (wysokość) obrazowanego przekroju optycznego. Tak więc otwarcie otworu zbierze więcej światła (wpuści więcej fotonów), ale zmniejszy rozdzielczość w z (mniejsza konfokaliczność).
7. Przydatne wskazówki:
   1. Jeśli różne fluorofory emitują zbieżne długości fali, użyj funkcji detektora spektralnego, która umożliwia wybór wirtualnych filtrów. Należy pamiętać, że detektory spektralne są mniej czułe niż zwykłe PMT.
   2. Jeśli różne fluorofory są wzbudzane przez ten sam laser, użyj funkcji skanowania linii.
   3. Skaner Galvano zapewnia większą czułość, ale wiąże się z większym ryzykiem fotowybielania. Skaner rezonansowy umożliwia szybszą akwizycję, zmniejszając w ten sposób ryzyko fotowybielania, ale jest mniej czuły.
   4. Uzyskując średnio od 2 do 16 obrazów, poprawia stosunek sygnału do szumu, ale spowalnia akwizycję i oczywiście wiąże się z większą ekspozycją próbki na działanie lasera.
   5. Czas akwizycji - zależy od kwestii biologicznej (np. tworzenie JUNQ i IPOD trwa ~2 godziny). Obrazowaliśmy drożdże za pomocą skanera rezonansowego przez okres do 30 godzin w filmie poklatkowym 3D.
   6. Interwały poklatkowe- Mniejsze interwały stworzą bardziej spójny film, ale mogą spowodować wybielanie zdjęć, a tym samym utratę sygnału.

Wyniki

Rycina 1. Model: Subkomórkowa kompartymentacja białek błędnie sfałdowanych. Mechanizmy kontroli jakości kierują błędnie sfałdowane białka do odrębnych kompartymentów o różnych funkcjach: białka rozpuszczalne, przeznaczone do degradacji, ulegają poliubikwitynacji i są transportowane do przyjądrowego kompartymentu kontroli jakości (Juxta-NuclearQuality control compartment – JUNQ). Białka nierozpuszczalne, których nie można ubikwitynować, są kierowane do ochronnej sekwestracji w osadzie białek nierozpuszczalnych (InsolubleProteinDeposit – IPOD), sąsiadującym z wakuolą, gdzie ulegają aktywnej agregacji.

Rycina 2. Modelowanie błędnego fałdowania białek z użyciem GFP-Ubc9^ts. W normalnych warunkach GFP-Ubc9^ts (zielony) jest prawidłowo sfałdowany i zlokalizowany rozproszony w jądrze komórkowym oraz cytozolu. Jądro komórkowe jest znakowane NLS-TFP (czerwony). We wszystkich eksperymentach przed obrazowaniem ekspresja Ubc9^ts została wyłączona poprzez dodanie 2% glukozy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

1. Po zmianie temperatury na 37 °C białko GFP-Ubc9^ts (zielone) ulega błędnemu sfałdowaniu i tworzy cytozolowe ogniska stresu (Stress Foci). Jądro komórkowe jest oznakowane NLS-TFP (czerwone).
2. Po regeneracji po szoku termicznym w 23 °C termicznie zdenaturowane GFP-Ubc9^ts ulega degradacji, co objawia się obniżeniem poziomu fluorescencji.
3. Po zmianie temperatury na 37 °C i zahamowaniu proteasomu za pomocą 80 Mm MG132, białko GFP-Ubc9^ts ulega błędnemu sfałdowaniu i jest włączane do inkluzji JUNQ oraz IPOD. Jądro komórkowe jest oznakowane NLS-TFP (czerwone).
4. Po zmianie temperatury na 37 °C i zahamowaniu ubikwitynacji, białko GFP-Ubc9^ts ulega błędnemu sfałdowaniu i jest włączane do inkluzji IPOD. Jądro komórkowe jest oznakowane NLS-TFP (czerwone). Proteaza ubikwityny 4 (Ubp4) jest nadekspresowana w celu zablokowania ubikwitynacji Ubc9^ts.

Rycina 3. Przebieg czasowy formowania się JUNQ i IPOD. Po zmianie temperatury na 37 °C i inhibicji proteasomów przy użyciu 80 Mm MG132, ogniska stresu (Stress Foci) GFP-Ubc9^ts przekształcają się w inkluzje JUNQ i IPOD. Jądro komórkowe jest znakowane NLS-TFP (kolor czerwony). Obrazy 3D były pozyskiwane w odstępach 4 min. (patrz również Film 1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.

Dyskusja

Nasze intuicje dotyczące procesów biochemicznych wywodzą się z eksperymentów laboratoryjnych, w których dobrze wymieszany roztwór reagentów i produktów może osiągnąć równowagę w zlewce. W takim ustawieniu stężenie danego związku chemicznego może być wyrażone jako pojedyncza liczba, która jest stosunkiem ilości molowej cząsteczek do objętości makroskopowej. Wiele z tego, co wiemy o strukturze i funkcji białek, pochodzi z użycia metod, które odzwierciedlają klasyczny, masowy obraz reakcji: zachodnie plamy, wirówki i pomiary spektrofotometryczne przeprowadzane na ekstraktach z homogenatów całych populacji komórek.

W miarę jak technologia, której używamy do oglądania komórek w powiększeniu, poprawia się w zawrotnym tempie, staje się coraz bardziej jasne, że warunki, w których większość reakcji biochemicznych zachodzi in vivo , tylko w najmniejszym stopniu przypominają te z klasycznego scenariusza laboratoryjnego. Wnętrze komórki jest nie tylko gęsto upakowanym środowiskiem, w którym efekty stłoczenia znacznie zmieniają aktywność różnych reagentów, ale jest również przeciwieństwem dobrze wymieszanych. Tłumaczy to częste rozbieżności między skutecznością in vitro i in vivo w szerokim zakresie złożonych reakcji makromolekularnych.

Intuicje wywodzące się z klasycznych eksperymentów biochemicznych in vitro nigdzie nie są bardziej podatne na wprowadzanie w błąd, jak w pytaniach dotyczących fałdowania, nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek in vivo . Podczas gdy badania nad chemią białek w reakcjach masowych mogą traktować kwestię fałdowania danego białka jako proste pytanie "tak" lub "nie", każda próba śledzenia dynamiki całych populacji makrocząsteczek w żywej komórce musi być wrażliwa na cały rozkład możliwych wyników konformacyjnych dostępnych dla łańcucha polipeptydowego, , a w szczególności do ryzyka nieprawidłowego fałdowania i agregacji. Na przykład, możemy zbadać lizat komórkowy białka agregującego za pomocą western blotting i ustalić, że białko jest w większości nierozpuszczalne i nie jest ubikwitynowane. Jednak w żywej komórce dyskretna subpopulacja białka, trudna do wykrycia podczas uśredniania na wielu komórkach, może być rozpuszczalna i ubikwitynowana w określonym kompartmencie, w którym lokalne stężenie gatunku jest bardzo wysokie. Ten drugi scenariusz może mieć ważniejsze konsekwencje dla żywotności komórki niż większa subpopulacja masowa. Co więcej, podczas gdy białka opiekuńcze wykazują różnorodne zachowania i funkcje plejotropowe in vitro, staje się oczywiste, że w komórce ich dyskretne funkcje są ograniczone przestrzennie i czasowo.

W nowo powstającym paradygmacie rozumienia biochemii koncentracja staje się zmienną właściwością każdego konkretnego nanośrodowiska w komórce, a zdarzenia molekularne, które leżą u podstaw procesów biologicznych, muszą być badane nie tylko w czasie, ale także w przestrzeni. Przedstawione tutaj podejście do obrazowania 4D umożliwia czułe modelowanie nieprawidłowego fałdowania białek w żywych komórkach, choć może być wykorzystane do badania dowolnej liczby innych procesów biologicznych i tego, jak są one regulowane w przestrzeni, czasie i po zmianach warunków środowiskowych. W tym artykule wykorzystano czujnik składania Ubc9^ts , który skutecznie demonstruje etapy i opcje radzenia sobie z początkiem agregacji białek w cytozolu. Oprócz zilustrowania biologii komórki w kontroli jakości agregacji, podejście to może służyć jako potężne narzędzie do rozszyfrowywania wpływu określonych zaburzeń lub mutacji genetycznych na proteostazę (na przykład Ubc9^ts można wykorzystać do pomiaru stresu związanego z fałdowaniem białek w odpowiedzi na utlenianie, ekspresję toksycznego agregatu lub mutacje w szlaku kontroli jakości).

Obrazowanie 4D jest również niezbędne do dokładnego określenia lokalizacji lub kolokalizacji białek między dwoma różnymi białkami oraz do wykrywania zjawisk, które mogą być przejściowe, ale ważne. Na przykład, szczególnie w małych kulistych organizmach, takich jak drożdże, może się wydawać, że struktura lub agregat ma lokalizację międzyjądrową, podczas gdy obrazowanie 4D może ujawnić, że jest to po prostu artefakt kąta badania.

W przykładowym eksperymencie, który tutaj prezentujemy, demonstrujemy użycie modelowego nieprawidłowo sfałdowanego białka, Ubc9^ts, do śledzenia kontroli jakości agregacji w czasie i przestrzeni w cytozolu. W temperaturze dopuszczalnej Ubc9^ts jest fałdowany i dyfundowany w jądrze i cytozolu. W przypadku nieprawidłowego fałdowania wywołanego ciepłem początkowo tworzy szybko dyfundujące małe zagregowane ogniska naprężeń, które są przetwarzane w celu degradacji proteasomalnej. Kiedy proteasom jest częściowo zahamowany, te ogniska stresu są przekształcane w inkluzje JUNQ i IPOD w ciągu około 2 godzin. Jeśli degradacja za pośrednictwem ubikwityny nie jest dostępna jako opcja kontroli jakości, Ubc9^ts jest natychmiast przekierowywany do inkluzji IPOD w celu agregacji ochronnej. Narzędzia te oferują niesamowite możliwości odkrywania nowych czynników genetycznych zaangażowanych w kontrolę jakości agregacji oraz badania ich przestrzennej i czasowej regulacji w komórce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Szklane płyty dolne	ibidi	ibd81158
4D Obrazowanie fluorescencyjne agregacji białek Konfokalne filmy 3D zostały uzyskane za pomocą mikroskopu Nikon A1R-si wyposażonego w stolik PInano Piezo (MCL), przy użyciu 60-krotnego obiektywu wodnego NA 1,27, plastry 0,3 mikrona, 0,5% mocy lasera (od 65 mW lasera 488 i 50 mW lasera 561). Ładunki z były zdobywane co 5 minut przez 90 minut. Każda seria z została uzyskana z krokiem o wielkości 0,5 mikrona i łącznie 30 krokami. Przetwarzanie obrazu odbyło się za pomocą oprogramowania NIS-Elements.