Artykuł metodologiczny

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

18.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50087

⸱

3 lutego 2013

 ,  , 
1Department of Pathology, New York University School of Medicine, 2New York University Center for Health Informatics and Bioinformatics, 3NYU Cancer Institute, 4Department of Pathology and Yale Cancer Center, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Streszczenie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ przy użyciu sond DNA na trójwymiarowo zachowanych jądrach, a następnie mikroskopia konfokalna 3D (3D DNA FISH) stanowi najbardziej bezpośredni sposób wizualizacji lokalizacji loci genów, podregionów chromosomowych lub całych terytoriów w pojedynczych komórkach. Ten rodzaj analizy zapewnia wgląd w globalną architekturę jądra, a także zachowanie określonych loci genomowych i regionów w przestrzeni jądrowej. Z drugiej strony immunofluorescencja pozwala na wykrycie białek jądrowych (zmodyfikowanych histonów, wariantów i modyfikatorów histonów, maszynerii i czynników transkrypcyjnych, podkompartmentów jądrowych itp.). Głównym wyzwaniem w połączeniu immunofluorescencji i 3D DNA FISH jest z jednej strony zachowanie epitopu wykrytego przez przeciwciało, a także architektury 3D jądra, a z drugiej strony, umożliwienie penetracji sondy DNA w celu wykrycia loci genów lub terytoriów chromosomów 1-5. Tutaj przedstawiamy protokół, który łączy wizualizację modyfikacji chromatyny z loci genomowymi w jądrach zachowanych w 3D.

Wprowadzenie

Mechanizmy epigenetyczne powodują tworzenie i dziedziczenie profili transkrypcyjnych specyficznych dla rozwoju i typu komórki. Na jednym poziomie wiąże się to z modulacją upakowania chromatyny, która definiuje aktywne lub ciche regiony genomu. Na większą skalę globalna organizacja 3D genomu i architektura jądrowa również odgrywają rolę w kontroli wzorców transkrypcyjnych. W związku z tym analiza tych cech epigenomicznych jest niezbędna do pełnego zrozumienia, w jaki sposób geny są regulowane 6-11.

Połączenie immunofluorescencji i 3D DNA FISH daje unikalną okazję do uzupełnienia analiz molekularnych i biochemicznych poprzez ocenę specyficznych interakcji/asocjacji sekwencji DNA i/lub białek w jądrze. Ponadto, podczas gdy techniki wysokoprzepustowe obejmujące cały genom, takie jak immunoprecypitacja chromatyny (ChIP-seq) lub konformacja wychwytywania chromosomów w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem (sekwencjonowanie 4C, 5C, Hi-C) dostarczają globalnych danych na temat populacji komórek12, techniki immunofluorescencji/DNA FISH umożliwiają analizy na poziomie pojedynczej komórki.

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-FISH). Zaletą tego protokołu jest połączona wizualizacja DNA i zachowanie struktur białkowych. Nasze doświadczenie w tej dziedzinie pozwoliło nam ulepszyć i uprościć istniejące protokoły. Chociaż zastosowaliśmy ten protokół do wykrywania dwuniciowych pęknięć DNA w limfocytach ulegających rekombinacji, metoda ta może być stosowana do innych białek i innych typów komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Znakowanie sondą DNA za pomocą fluoroforów: Nick Translation (~ 6 godz.)

  1. Do znakowania można użyć czystego DNA BAC (przygotowanego przez maxi-prep) lub plazmidów lub produktów PCR, wszystkie ponownie zawieszone wH2O. Należy pamiętać, że aby uzyskać solidny sygnał FISH, sondy powinny mieć co najmniej 10 kb.
  2. Inkubować DNA w RNazie A przez 30 minut w temperaturze 37 °C (wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli 1).
  3. Inkubować reakcję translacji nacięć przez 2 godziny w temperaturze 16 °C (patrz tabele 2 i 3). Można stosować alternatywne metody bezpośredniego etykietowania (Przykład: FISH Tag, Invitrogen).
  4. Dezaktywować reakcję na jedną godzinę w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
  5. Określ rozmiar sondy na 2% żelu agarozowym. Rozmaz powinien wynosić od 100 do 1000 pz, przy czym większość powinna wynosić około 300-500 pz (należy pamiętać, że rozmaz sond Cy5 nie jest widoczny). Jeżeli DNA nie jest wystarczająco strawione, do reakcji można dodać więcej DNA, Pol I i DNazy I, i inkubować przez kolejne dwie godziny w temperaturze 16 °C.
  6. Oczyść sondy na filtrach 0,025 mm w dwulitrowych zlewkach wypełnionych H20 przez dwie godziny w ciemności.
  7. Dodaj czynniki blokujące do sond w następujący sposób: 10 μg DNA Cot-1, 10 μg DNA Hybloc i 100 μg nasienia łososia na 10 μg sond DNA. Sondy DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Wytrącanie sondy/Denaturacja/Wyżarzanie wstępne (3-4 godziny)

  1. Na szkiełko nakrywkowe stosuje się od 0,3 μg do 1 μg sondy DNA. Wymieszać sondy z 0,1 objętości 3M NaAc (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu, inkubować przez jedną godzinę w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C i wirować z prędkością 13 000 obr./min w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Należy pamiętać, że ilość sondy DNA można dostosować w zależności od jakości DNA i regionu jądrowego hybrydyzacji. Alternatywne metody bezpośredniego etykietowania mogą pozwolić na użycie zmniejszonej ilości sondy. W celu wykrycia wielu sygnałów DNA FISH na jednym szkiełku, różne sondy mogą być wytrącane razem (z wyjątkiem sond, które nie powinny być wstępnie wyżarzane, takich jak sekwencje powtórzeń). Sondy do kilku eksperymentów wykonywanych w tym samym czasie mogą być również wytrącane razem. Granulki powinny być lekko zabarwione zgodnie z użytymi fluoroforami (w przypadku wytrącenia się niewielkich ilości sond osad może nie być widoczny).
  2. Wysuszyć granulki i ponownie zawiesić je w 15 μl buforu do hybrydyzacji (patrz tabela 4) na szkiełko nakrywkowe, wstrząsając (przy użyciu termomiksera Eppendorf) w ciemności w temperaturze 37-45 °C (przez około 20 minut).
  3. Denaturyzacja sond przez 5 minut w temperaturze 75-95 °C.
  4. Sondy do wyżarzania wstępnego w temperaturze 37 °C przez 30-60 min. Długość wyżarzania wstępnego można dostosować w zależności od złożoności i jakości sond.
  5. Nałożyć sondy na szkiełka nakrywkowe w celu hybrydyzacji przez noc (patrz sekcja 3).

3. 3-wymiarowe DNA RYBA - Pierwszy dzień (~ 3 godz.)

  1. Nieprzylegające komórki są skoncentrowane w małej objętości 1x PBS (~ 2x105 komórek po 5-10 μl 1x PBS na szkiełko nakrywkowe) i upuszczane na środek szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną. Przylegające komórki należy hodować na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 24 godziny (~ 70% konfluencji) (szkiełka nakrywkowe mogą być pokryte 0,1% żelatyny). Kwadratowe szkiełka nakrywkowe o wymiarach od 18x18 do 24-24 mm umieszcza się w płytkach 6-dołkowych, a w całym protokole stosuje się po dwa ml każdego roztworu na dołek (alternatywnie okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 1,5 mm można umieścić w płytkach 12/24-dołkowych).
  2. Utrwalić komórki w 2% paraformaldehydzie / 1x PBS, pH 7-7,4, przez 10 minut w temperaturze pokojowej (można podzielić na porcje 4% zapasów PFA, przechowywać w temperaturze -20 °C). Paraformaldehyd można kupić w roztworze (16%) lub 4% roztwory podstawowe można przygotować z proszku/bryłek. Proszek paraformaldehydu rozpuszcza się w 1x PBS w temperaturze > 60 °C (pH można zwiększyć do 8-9 w celu ułatwienia rozpuszczania), schładza się na lodzie, dostosowuje do pH 7-7,4, filtruje, porcjuje w sokołach i przechowuje przez tygodnie w temperaturze -20 °C.
  3. Po trzech płukaniach w 1x PBS, przepuszczalność komórek w lodowato zimnym 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS przez 5 minut na lodzie. Długość przepuszczalności można dostosować w zależności od typu komórki. N.B.: Jeśli DNA FISH jest połączone z immunofluorescencją, barwienie immunologiczne powinno być przeprowadzone na tym etapie (patrz punkt 4).
  4. Po trzech płukaniach w 1x PBS, inkubować komórki z 0,1 μg/μl RNazy A w 1x PBS przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 100 μl roztworu na parafilmie lub na szkiełku w wilgotnej komorze. Szkiełka nakrywkowe są następnie ostrożnie usuwane za pomocą kleszczy. W przypadku napotkania jakiegokolwiek oporu, szkiełka nakrywkowe należy zalać 1x PBS, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
  5. Po trzech płukaniach w 1x PBS, przepuszczalność komórek w lodowato zimnym 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl przez 10 minut na lodzie.
  6. Po trzech płukaniach w 1x PBS, denaturować komórki w 1,9 M HCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, komórki można denaturować w 50% formamidzie / 2x SSC w temperaturze 75-80 °C przez co najmniej 30 minut. Należy pamiętać, że długość hybrydyzacji (i temperatura) może być zoptymalizowana w zależności od typu komórki.
  7. Po trzech płukaniach w lodowato zimnym 1x PBS, hybrydyzuj komórki z sondami przez noc w temperaturze 37 °C w ciemnej i wilgotnej komorze. Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 15 μl sondy na szkiełku podstawowym i uszczelnia cementem gumowym.

4. 3-wymiarowy Immuno-FISH - Pierwszy dzień (~ 6-7 godz.)

  1. W przypadku immunofluorescencji złożonej / DNA FISH barwienie immunologiczne należy przeprowadzić po permeabilizacji w 0,4% Triton-X-100 (krok 3.3).
  2. Inkubować komórki w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (2,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 10% normalnej surowicy koziej, 0,1% Tween-20). Roztwór blokujący jest filtrowany, podawany w 1,5 ml Eppendorfs i przechowywany przez miesiące w temperaturze -20 °C.
  3. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem podniesionym przeciwko białku lub modyfikacji histonów będących przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonymi w roztworze blokującym, przez jedną godzinę w temperaturze RT w wilgotnej komorze. Tutaj pokazujemy przykład przeciwciała przeciwko fosforylowanej serynie-139 H2AX (γ-H2AX, Millipore; Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 5). Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 100 μl roztworu na parafilmie lub na szkiełku w wilgotnej komorze. Szkiełka nakrywkowe są następnie ostrożnie usuwane za pomocą kleszczy (w razie potrzeby zalewane 1x PBS). Należy pamiętać, że długość rozcieńczania i inkubacji może być dostosowana w zależności od jakości przeciwciała i typów komórek.
  4. Umyj komórki w 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.
  5. Inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem, rozcieńczonym w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemnej i wilgotnej komorze. Tutaj pokazujemy przykład wykrywania za pomocą wtórnego przeciwciała przeciwko mysi kóz (Alexa Fluor 488 lub 555, Invitrogen; Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 5). Można również stosować przeciwciała drugorzędowe sprzężone haptenem (biotyna, digoksygenina itp.). W takim przypadku dodatkowy krok w celu odpowiedniego wykrycia (streptawidyna, anti-dig itp.) można wykonać przed lub po nocnej hybrydyzacji DNA-FISH.
  6. Wypłucz komórki w 0,1% Tween-20 / 1x PBS, trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej z potrząsaniem w ciemności.
  7. Komórki post-fix w 2% paraformaldehydzie / 1x PBS przez 10 min w RT w ciemności.
  8. Kontynuuj DNA FISH jak powyżej od inkubacji w RNazie A (krok 3.4).

5. 3-wymiarowe DNA RYBA / Immuno-FISH - Drugi dzień (~ 2 godz.)

  1. Ostrożnie usuń cement kauczukowy, zalej szkiełka nakrywkowe 2x SSC, ostrożnie usuń kleszczami i umieść je w studzienkach zawierających roztwór myjący.
  2. Myć komórki w 2x SSC przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności z potrząsaniem.
  3. Myć komórki w 2x SSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z potrząsaniem.
  4. Myć komórki w 1x SSC przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z potrząsaniem. Należy pamiętać, że w przypadku denaturacji formamidem pranie należy zastąpić następującymi: 3 prania w 50% formamidzie / 2x SSC i 3 prania w 2x SSC po 5 minut, w temperaturze 37 °C.
  5. Zamontuj komórki w pożywce montażowej ProLong Gold zawierającej 1,5 μg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol) w celu przeciwbarwienia całkowitego DNA. Szkiełka nakrywkowe umieszcza się komórką do dołu na kropli 10-15 μl podłoża montażowego na szkiełku podstawowym i uszczelnia lakierem do paznokci. Szkiełka są przechowywane przez miesiące w temperaturze -20 °C.

6. 3D Mikroskopia i analiza

  1. Obrazy 3D można uzyskiwać za pomocą różnych systemów mikroskopowych. W naszych eksperymentach skrawki optyczne oddalone od siebie o 0,3 μm są zbierane na systemie konfokalnym Leica SP5 AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter). Należy pamiętać, że separacja między płaszczyznami optycznymi może być dostosowywana w zależności od rodzaju analizy.
  2. Stosy obrazów 3D można analizować za pomocą różnych programów i narzędzi. Używamy oprogramowania Image J do oceny pomiarów odległości między interesującymi nas loci oraz do analizy różnych typów asocjacji interesujących nas loci z subjądrowymi przedziałami lub białkami.
  3. Wszystkie analizy statystyczne są wykonywane w celu porównania dwóch (lub więcej) różnych warunków biologicznych z parami ocen istotności: porównanie różnych typów komórek lub etapów, porównanie między różnymi loci będącymi przedmiotem zainteresowania. We wszystkich testach statystycznych przyjmuje się, że wartości P ≤ 5,00E-2 (a = 0,05) są istotne (1,00E-2 ≤ P ≤ 5,00E-2 * istotne; 1,00E-3 ≤ P ≤ 1,00E-2 ** bardzo istotne; P < 1.00E-3 *** bardzo znaczące).

Analiza statystyczna całego rozkładu odległości między dwoma allelami. Najpierw konstruujemy krzywe częstości rozkładu skumulowanego w całym zakresie mierzonych odległości między dwoma allelami. Do oceny istotności różnic w rozkładach empirycznych odległości międzyallelicznych stosuje się nieparametryczny test Kołmogorowa-Smirnowa (KS) dla dwóch prób 13,14 .

Analiza statystyczna ścisłego związku (np. parowanie) dwóch alleli przy użyciu optymalnego odcięcia odległości. Aby określić zakres najbardziej wytrzymałych różnic w odległościach między dwoma allelami lub loci, używamy serii dokładnego testu Fishera z dwoma ogonami 15 s. Mianowicie, przy każdej zmierzonej odległości sprawdzamy, czy jeden warunek jest znacząco nadreprezentowany na krótszych odległościach między dwiema próbkami. Minimum w rozkładzie wartości P wskazuje zakres odległości, które należy uznać za punkt odcięcia dla ścisłego powiązania (tj. parowania) dwóch alleli. Następnie stosuje się dokładny test Fishera z dwoma ogonami do oceny znaczenia parowania dwóch alleli przy zidentyfikowanej wartości odcięcia15. Stosuje się wiele poprawek testowych, aby uwzględnić łączną liczbę wykonanych testów Fishera 16.

Analiza statystyczna związku interesującego miejsca z sub-jądrowymi kompartmentami lub białkami. Dokładny test Fishera z dwoma ogonami służy do analizy znaczenia związku miejsca zainteresowania z różnymi przedziałami lub białkami 15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W laboratorium Skoka stosuje się techniki DNA-FISH i immuno-FISH do badania zmian w organizacji jądra komórkowego związanych z procesem rekombinacji V(D)J loci receptorów antygenowych podczas rozwoju limfocytów B i T. Opisane powyżej techniki pozwalają nam na: i) pomiar odległości między dwoma końcami locus (kontrakcja), ii) pomiar odległości między allelami lub loci (parowanie), iii) analizę uszkodzeń DNA występujących w obrębie loci, iv) ocenę lokalizacji alleli i loci względem podkompartymentów jądra (w naszym badaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Techniki opisane powyżej zostały wykorzystane w naszym laboratorium do analizy regulacji rekombinacji V(D)J loci immunoglobuliny i TCRA / d w rozwijających się limfocytach 30,31 . Jesteśmy przekonani, że technika ta może być zaadaptowana do wykrywania różnych białek jądrowych, przedziałów jądrowych i loci w różnych typach komórek. Modyfikacje protokołu mogą być konieczne, a w tym przypadku główne kroki, na których należy się skupić, są następujące. Po pierwsze, długość przepuszczalności można...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Skok, szczególnie Susannah Hewitt, za dyskusje i komentarze. Prace te są wspierane przez granty Narodowego Instytutu Zdrowia R01GM086852, RC1CA145746 (J.A.S.). J.A.S. jest stypendystą Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka. J.C. jest członkiem Instytutu Irvington w Instytucie Badań nad Rakiem. M.M. jest wspierany przez National Science Foundation Grant Integrative Graduate Education and Research Traineeship (NSF IGERT 0333389).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
H2OFisher# BP2470
RNase ASigma# R4642
dNTPSigma# DNTP100
Alexa dUTPInvitrogen# C11397 do C-11401
Cy3 lub Cy5 dUTPFisher# 45-001-xxx
DNase IRoche# 04536282001
DNA Pol IBiolabs# M0209
0,025 μ m filtryMillipore# VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg/mlInvitrogen# 18440
Hybloc DNA 1 mg/mlGenetyka stosowana# MHB
Nasienie łososiaSigma# D1626proszek do ponownego zawieszenia w stężeniu 10 mg/ml w H2O
NaAc (octan sodu, pH 5,2, roztwór buforowy)Sigma# S7899
Ficoll 400 (klasa Mol Biol)Fisher# 525
Poliwinylopirolidon (klasa Mol Biol)Fisher# BP431
Siarczan dekstranu w proszkuSigma# D8906
SSPE (sól fizjologiczno-sodowo-fosforanowa-EDTA) 20x roztwórFisher# BP1328
FormamidFisher# BP227
Szkiełka nakrywkoweFisher# 12-548-B
SzkiełkaFisher# 12-550
Płytki 6-dołkoweFisher# 0720080
PBS, 10xFisher# MT-46-013-CM
Roztwór poli-L-lizynySigma# P8920
Paraformaldehyd, bryłki, 95%Sigma# 441244
Triton-X-100, Mol Biol gradeSigma# T8787
BSA (albumina surowicy bydlęcej) Frakcja VFisher# BP 1600
Normalna surowica koziaVector Labs# S-1000
Tween-20, Mol Biol gradeSigma# P9416
SSC (Solan Sodium Citrate) 20x roztwórFisher# BP1325
ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciuInvitrogen# P36930
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)Sigma# D9542
Najlepszy test jednowarstwowego cementu gumowegoSklepy z artykułami
Tabela 1. Specyficzne odczynniki i drobny sprzęt.
artystycznymi lub biurowymi

Bibliografia

  1. Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
  2. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
  3. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
  4. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
  5. Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
  6. Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
  7. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
  8. Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
  9. Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
  10. Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
  11. Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
  12. van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
  13. Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951(1951).
  14. Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
  15. Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
  16. Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
  17. Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
  18. Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
  19. Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
  20. Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
  21. Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
  22. Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568(2008).
  23. Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
  24. Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
  25. Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
  26. Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
  27. Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
  28. Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
  29. Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
  30. Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
  31. Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
  32. Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
  33. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
  34. Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
  35. Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  36. Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
  37. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
  38. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
  39. Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
  40. Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia konfokalna 3Dmodyfikacje chromatynydetekcja loci genowychhybrydyzacja sondbarwienie przeciwcia amiarchitektura j dra kom rkowegoregulacja epigenetyczna

Powiązane artykuły